基于高通量测序和化学轮廓分析研究黄连在连栀矾溶液发酵炮制中的作用

目的探究黄连Coptidis Rhizoma在连栀矾溶液传统发酵炮制中的作用。方法按照连栀矾溶液传统配方比例,将其拆分为3组配方溶液:连栀矾组(黄连+栀子+白矾)、黄连组(黄连+白矾)和栀子组(栀子+白矾),采用HPLC分析比较3组溶液发酵前后的化学成分变化轮廓,采用Illumina Hiseq高通量测序技术测定并比较发酵溶液中微生物的群落特征。结果传统配方连栀矾经发酵后环烯醚萜类成分发生了较显著的变化(P<0.05),生物碱类成分未发生明显变化,拆分后的黄连组中生物碱类成分和栀子组中环烯醚萜类成分均没有发生明显变化。分别对各组发酵溶液进行测序,根据α多样性分析结果,3组发酵液中真菌多样性为连栀矾组<栀子组<黄连组,真菌的丰富度为栀子组<连栀矾组<黄连组;细菌多样性为连栀矾组<黄连组<栀子组,细菌的丰富度为连栀矾组<栀子组<黄连组。根据β多样性分析结果,3组溶液中的真菌和细菌的群落结构均有明显差异。根据微生物相对丰度分析可知,3组的优势真菌均为子囊菌门、担子菌门和罗兹菌门,不同组间丰度无明显差异;真菌优势属中的孢霉属的丰度在连栀矾组最高,显著高于另外2组(P<0.05),栀子组又显著高于黄连组(P<0.05);韦斯特壳属的丰度在连栀矾组中最低,显著低于黄连组和栀子组(P<0.05),后两者间丰度无明显差异。3组的优势细菌均为变形菌门、厚壁菌门、放线菌门和拟杆菌门,其中连栀矾组中变形菌门的丰度极显著低于黄连组和栀子组(P<0.01),厚壁菌门的丰度在连栀矾组中极显著高于黄连组和栀子组(P<0.01),放线菌门和拟杆菌门的丰度在3组发酵溶液的差异较小;细菌优势菌属中的乳杆菌属在连栀矾组中显著高于黄连组和栀子组(P<0.05),在黄连组中也显著高于栀子组(P<0.05),伯克氏菌属丰度在黄连组和栀子组中无显著差异,都显著高于连栀矾组中的丰度(P<0.05)。结论连栀矾溶液配方中的黄连能提高其中栀子的有效成分的发酵转化,并且是通过对发酵体系中的优势菌属的丰度进行调节而发挥作用的。进一步佐证了传统配方制剂的合理性和科学性。     

连栀矾溶液不同储存条件下主要活性成分变化研究

目的考察连栀矾溶液在不同储存条件下其所含主要活性成分的含量变化情况,为连栀矾溶液的应用及质量提升提供参考。方法采用Eclipse Agilent C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5μm),以0.1%磷酸水溶液-乙腈为流动相进行梯度洗脱,体积流量1.0 mL/min,检测波长238 nm,柱温25℃。建立连栀矾溶液化学成分指纹图谱分析方法,用于测定分析其在密封及非密封储存条件下主要活性成分随时间的变化情况。结果所建立并采用的连栀矾溶液HPLC指纹图谱的精密度、稳定性、重复性和加样回收率均符合要求,可用于连栀矾溶液化学成分的分析。2种储存条件下不同时间点的样品指纹图谱与对照指纹图谱相似度值均大于0.95;利用外标指认法及光谱特征分析共指认出连栀矾溶液中的9种活性成分,其中的生物碱类物质(包括非洲防己碱、表小檗碱、盐酸药根碱、盐酸黄连碱、盐酸巴马汀和盐酸小檗碱)在2种储存条件下均无显著变化,但环烯醚萜类化合物京尼平龙胆双糖苷和栀子苷含量显著降低,京尼平含量在前3个月增加但超过3个月后其含量有所降低。推测京尼平龙胆双糖苷及栀子苷能被溶液中的酶转化为京尼平,而京尼平也可能会被微生物产生的其他酶所降解。结论连栀矾溶液在6个月的储存时间内,仍然存在成分的转化,这可能与储存过程中相关酶的作用有关。为提高每批次产品的质量一致性,建议可采用新的终点判断方法并在发酵炮制结束后对其采取酶的灭活和灭菌处理。     

人类心目中的至美和永恒

我们是一朵玫瑰,圣洁地渴求生命的合一,渴求在同一份爱中获得心神交融与激烈、自豪的肉体满足……     

基于高通量测序分析连栀矾溶液发酵炮制过程中真菌菌群多样性变化

目的探究传统连栀矾溶液发酵炮制过程中真菌菌群多样性和优势菌群,为科学发酵提供理论依据。方法采用Illumina HiSeq高通量测序技术测定不同发酵时间上下层连栀矾溶液中真菌ITS2区序列,应用QIIME、Mothur和R等软件整理和统计样品序列数目和操作分类单元(OTU)数量,分析样品中真菌菌群的组成、丰度、分布、alpha多样性、beta多样性,阐明炮制过程中真菌菌群结构、多样性及丰富度的动态变化。结果 4个不同的发酵时期共获得用于分析的有效序列数为207 068,稀疏曲线表明测序深度充分,OTUs的数量接近于饱和,能充分展示连栀矾溶液的真菌群落结构,其主要由子囊菌门(Ascomycota,74.21%)、担子菌门(Basidiomycota,7.31%)、罗兹菌门(Rozellomycota,2.62%)、接合菌门(Zygomycota,0.66%)和球囊菌门(Glomeromycota,0.01%)组成,优势菌门为子囊菌门。通过分析OTUs数量、chao1指数,ACE指数、Shannon指数,表明连栀矾溶液真菌菌群有较高的丰富度和多样性,并且在炮制过程中上下层总丰富度和多样性随发酵时间的增加逐渐增加,其中上层样品的丰富度、多样性逐渐增加,下层样品的丰富度、多样性先降低后增加,且上层样品的丰富度、多样性明显高于下层样品。结论以高通量测序技术分析连栀矾溶液发酵炮制过程中真菌菌群结构、多样性及丰富度的动态变化可为指导其科学发酵提供参考。