基于高通量测序和化学轮廓分析研究黄连在连栀矾溶液发酵炮制中的作用

目的探究黄连Coptidis Rhizoma在连栀矾溶液传统发酵炮制中的作用。方法按照连栀矾溶液传统配方比例,将其拆分为3组配方溶液:连栀矾组(黄连+栀子+白矾)、黄连组(黄连+白矾)和栀子组(栀子+白矾),采用HPLC分析比较3组溶液发酵前后的化学成分变化轮廓,采用Illumina Hiseq高通量测序技术测定并比较发酵溶液中微生物的群落特征。结果传统配方连栀矾经发酵后环烯醚萜类成分发生了较显著的变化(P<0.05),生物碱类成分未发生明显变化,拆分后的黄连组中生物碱类成分和栀子组中环烯醚萜类成分均没有发生明显变化。分别对各组发酵溶液进行测序,根据α多样性分析结果,3组发酵液中真菌多样性为连栀矾组<栀子组<黄连组,真菌的丰富度为栀子组<连栀矾组<黄连组;细菌多样性为连栀矾组<黄连组<栀子组,细菌的丰富度为连栀矾组<栀子组<黄连组。根据β多样性分析结果,3组溶液中的真菌和细菌的群落结构均有明显差异。根据微生物相对丰度分析可知,3组的优势真菌均为子囊菌门、担子菌门和罗兹菌门,不同组间丰度无明显差异;真菌优势属中的孢霉属的丰度在连栀矾组最高,显著高于另外2组(P<0.05),栀子组又显著高于黄连组(P<0.05);韦斯特壳属的丰度在连栀矾组中最低,显著低于黄连组和栀子组(P<0.05),后两者间丰度无明显差异。3组的优势细菌均为变形菌门、厚壁菌门、放线菌门和拟杆菌门,其中连栀矾组中变形菌门的丰度极显著低于黄连组和栀子组(P<0.01),厚壁菌门的丰度在连栀矾组中极显著高于黄连组和栀子组(P<0.01),放线菌门和拟杆菌门的丰度在3组发酵溶液的差异较小;细菌优势菌属中的乳杆菌属在连栀矾组中显著高于黄连组和栀子组(P<0.05),在黄连组中也显著高于栀子组(P<0.05),伯克氏菌属丰度在黄连组和栀子组中无显著差异,都显著高于连栀矾组中的丰度(P<0.05)。结论连栀矾溶液配方中的黄连能提高其中栀子的有效成分的发酵转化,并且是通过对发酵体系中的优势菌属的丰度进行调节而发挥作用的。进一步佐证了传统配方制剂的合理性和科学性。     

hper1基因3′端UTR区双荧光素酶报告系统构建

目的：构建hper1基因3′端UTR区双荧光素酶报告系统pmiR-RB-REPORT^TM-hper1-3′UTR（PMIR-3′UTR），检测其表达，为研究hperl基因的表达调控及microRNA调控靶基因的结合位点提供基础平台。方法：用PCR扩增的方法提取hper1基因3′UTR序列，并连接至pmiR—IBREPORT^TM（PMIR）双荧光素酶报告载体的多克隆位点，测序验证插入序列并转染入A549细胞检测其荧光素酶活性。结果：测序结果表明PMIR-3′UTR的插入序列正确，在转染入A549细胞后其荧光素酶能正常表达。结论：PMIR-3′UTR双荧光素酶报告系统构建成功。