3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗模型建立、优化及分子指标鉴定

[摘要]：目的：探讨3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗（Insulin Resistance,IR）模型建立条件、优化及分子指标鉴定。方法：采用3-异丁基-1-黄嘌呤（3-isobutyl-1-methylxanthine, IBMX）,地塞米松（Dexamethason,DEX）和胰岛素联合诱导3T3-L1前脂肪细胞分化为成熟脂肪细胞,油红O染色鉴定。采用1μmol·L-1DEX诱导建立IR-3T3-L1脂肪细胞,1μmol·L-1DEX联合10μmol·L-1罗格列酮（Rosiglitazone,ROS）联合诱导建立IR-3T3-L1脂肪细胞。葡萄糖氧化酶-过氧化物酶法（Glucose oxidase-peroxidase,GOD-POD）检测不同时间点细胞培养液葡萄糖含量,确认IR-3T3-L1细胞模型最佳诱导时间和IR状态稳定性;甘油磷酸氧化酶法(glycerol phosphate oxidase,GPO-POD)测定胞内甘油三酯（Triglyceride,TG）含量。荧光定量qPCR和Western blot法分别检测脂联素（Adiponectin,ADPN）和葡萄糖转运蛋白-4（Glucose transporter 4,GLUT4）mRNA基因和蛋白质表达水平。结果：DEX作用3T3-L1脂肪细胞96h葡萄糖消耗差值比例最大,为46.84%;DEX ROS作用72h葡萄糖消耗差值比例最大,为22.77%,可确认为两种IR模型建立的最佳时间点,其后可保持稳定IR状态至少60h。两类IR细胞中的GLUT4和ADPN mRNA和蛋白表达水平较正常组显著降低（P<0.01）,相较于DEX ROS组,DEX单独诱导细胞内GLUT4和ADPN mRNA和蛋白表达水平降低更显著。结论：DEX组和DEX ROS组两种诱导方法抑制GLUT4和ADPN mRNA和蛋白表达水平来建立稳定可靠的IR-3T3-L1细胞模型,但DEX单独诱导IR模型方法更稳定可能与更有效抑制了ADPN mRNA和蛋白表达导致葡萄糖消耗下降更为显著。     

3’-羟基葛根素对脂肪细胞3T3-L1胰岛素抵抗的影响及其机制研究

目的探讨3′-羟基葛根素改善胰岛素抵抗的作用及其机制。方法采用MTT法检测3′-羟基葛根素对3T3-L1前脂肪细胞增殖的影响;油红O染色法检测其对3T3-L1前脂肪细胞分化的影响。以地塞米松诱导分化成熟的脂肪细胞,建立胰岛素抵抗模型,分别采用葡萄糖氧化酶法和比色法检测细胞培养上清液中葡萄糖消耗量和游离脂肪酸(FFA)生成量;实时荧光定量PCR法分析脂肪细胞中过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxysome proliferator-activated receptor gamma,PPARγ)和蛋白酪氨酸磷酸酶1B(protein tyrosine phosphatase 1B,PTP1B)的基因表达。采用嵌合蛋白基因试验检测3′-羟基葛根素的PPARγ配体结合活性和比色法检测其对PTP1B酶活性的影响。结果与溶媒对照组相比,1~10μmol/L 3′-羟基葛根素显著促进3T3-L1前脂肪细胞增殖及细胞分化(P<0.05、0.01)。与模型组相比,无论在基础状态还是胰岛素刺激状态,3′-羟基葛根素均能显著增加胰岛素抵抗脂肪细胞葡萄糖利用率、减少FFA的产生(P<0.05、0.01);同时显著上调胰岛素抵抗脂肪细胞PPARγ基因的表达,但对PTP1B基因表达无明显影响(P>0.05)。与溶媒对照组相比,3′-羟基葛根素在0.1、10.0μmol/L时能对PPARγ产生激活作用(P<0.05、0.01),但对PTP1B酶活性没有明显抑制作用(P>0.05)。结论 3′-羟基葛根素能促进胰岛素抵抗脂肪细胞葡萄糖利用、抑制FFA产生,从而改善胰岛素抵抗,其机制可能与上调PPARγ基因表达有关。     

葛根调节脂肪细胞糖脂代谢改善胰岛素抵抗的研究

该实验通过检测葛根对胰岛素抵抗(IR)3T3-L1脂肪细胞葡萄糖消耗,甘油三脂(TG)含量及PPARγ,ADPN,GLUT4,LPL,FABP4,FASn表达量的影响来探讨葛根调节糖脂代谢改善脂肪IR的作用机制。先采用3T3-L1前脂细胞诱导分化的成熟脂肪细胞,地塞米松诱导建立IR模型,将脂肪细胞分为正常组,IR模型组,罗格列酮阳性组,低、中、高剂量葛根含药血清组,以葡萄糖氧化酶-过氧化物酶(glucose oxidase-peroxidase,GOD-POD)法检测细胞培养液葡萄糖含量和甘油磷酸氧化酶(glycerol phosphate oxidase,GPO-POD)法测定胞内TG含量,荧光定量q PCR检测PPARγ,ADPN,GLUT4,LPL,FABP4(a P2),FASn基因mRNA水平。结果显示1μmol·L~(-1)地塞米松作用3T3-L1脂肪细胞96 h,与正常组比较,模型组葡萄糖消耗量降低(P0.01),胞内TG含量增加(P0.01),由此确认建立IR模型;与IR组比较,葛根含药血清干预IR细胞24 h葡萄糖消耗量上升(P0.01),胞内TG含量降低(P0.01),中、高剂量葛根含药血清组升高PPARγ,ADPN和GLUT4表达(P0.01),PPARγ与后两者基因表达呈现一致性。脂代谢相关基因检测结果显示仅高剂量葛根含药血清显著升高LPL表达(P0.05);各剂量葛根含药血清下调FABP4表达(P0.01);中、高剂量的葛根含药血清上调FASn基因表达(P0.01)。该实验表明葛根提高IR-3T3-L1脂肪细胞对葡萄糖的摄取能力,降低细胞内TG积聚,干预多个重要糖脂代谢基因,推测以PPARγ为中心多靶点调节糖脂代谢改善脂肪IR。     

小檗碱对白介素-6诱导胰岛素抵抗 3T3-L1脂肪细胞脂联素表达的影响

目的:观察小檗碱对白介素-6(IL-6)诱导胰岛素抵抗的3T3-L1脂肪细胞脂联素表达的影响。方法:选用IL-6诱导3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗(IR)模型。以20μg·L-1IL-6培养48 h,将3T3-L1脂肪细胞随机分为正常对照组、模型组、吡格列酮组(50μmol.L-1)和小檗碱高、中、低剂量组(10,20,50μmol.L-1),以葡萄糖氧化酶法测定葡萄糖消耗量,观察小檗碱对脂肪细胞葡萄糖摄取的影响,鉴定IR模型;采用实时荧光定量PCR技术测定脂肪细胞脂联素基因mRNA水平。结果:模型组葡萄糖消耗量及脂联素基因表达水平与正常对照组比较,均显著降低(P<0.05);小檗碱高、中、低剂量组及吡格列酮组均能显著增加葡萄糖消耗量及脂联素基因表达水平(P<0.05)。结论:小檗碱可增加白介素-6诱导胰岛素抵抗的3T3-L1脂肪细胞脂联素基因mRNA的表达,改善胰岛素抵抗状态。     

小檗碱对3T3-L1脂肪细胞增殖及糖代谢的影响

目的:研究小檗碱对脂肪细胞增殖、糖代谢及地塞米松诱导3T3-L1脂肪细胞中葡萄糖转运蛋白4(GLUT4)mRNA表达的影响。方法:用四甲基偶氮唑盐(MTT)方法检测3T3-L1前脂肪细胞及脂肪细胞的增殖情况,检测小檗碱对3T3-L1前脂肪细胞及脂肪细胞培养基中葡萄糖浓度的影响;采用地塞米松诱导胰岛素抵抗细胞模型,分别给予罗格列酮、小檗碱进行干预,用RT-PCR检测GLUT4 mRNA的表达。结果:在DMEM高糖培养基中,小檗碱可促进3T3-L1前脂肪细胞增殖,抑制3T3-L1脂肪细胞增殖,作用呈明显量效关系;使3T3-L1前脂肪细胞及3T3-L1脂肪细胞葡萄糖消耗量增加,呈明显量效关系,同时小檗碱组GLUT4 mRNA的表达升高。结论:小檗碱可以显著促进前脂肪细胞的增殖,抑制脂肪细胞的增殖;同时具有显著的降糖作用。且小檗碱能上调脂肪细胞GLUT4 mRNA的表达,这提示小檗碱改善胰岛素抵抗的作用机制可能与罗格列酮不同。     

软脂酸制备3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗模型的方法

目的用软脂酸（PA）诱导3T3-L1脂肪细胞,探讨用PA制备3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗（IR）模型的方法。方法将3T3-L1前脂肪细胞诱导分化为成熟的脂肪细胞,用油红O染色法鉴定细胞。用不同浓度的PA（0mmol/L、0.25mmol/L、0.5mmol/L、1.0mmol/L）干预3T3-L1脂肪细胞24h,收集各组细胞培养液,用葡萄糖氧化酶法测定各组细胞培养液葡萄糖的含量,观察PA对3T3-L1脂肪细胞糖摄取的影响。结果 0.25mmol/L PA就可明显抑制成熟的3T3-L1脂肪细胞葡萄糖的摄取（P〈0.01）,且呈浓度依赖性。与对照组相比,0.25mmol/L PA组、0.5mmol/L PA组、1.0mmol/L PA组葡萄糖摄取率分别下降5.25%、10.29%、14.54%。结论在胰岛素刺激下,0.25mmol/L PA作用于3T3-L1脂肪细胞24h就可诱导细胞产生IR,且随着浓度的增加其效果逐渐增强。     

肿瘤坏死因子-α诱导3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗模型的建立

目的:应用肿瘤坏死因子d(TNF-α)诱导3T3-L1脂肪细胞,探讨建立可靠胰岛素抵抗(IR)细胞模型的方法.方法:3T3-L1前脂肪细胞经3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、地塞米松、胰岛素诱导分化成3T3-L1脂肪细胞,将其与20,10,5μg·L-1TNF-α共孵育,100 nmol·L-1胰岛素作用30 min刺激脂肪细胞糖转运.以葡萄糖氧化酶法测定培养基上清液葡萄糖含量,观察TNF-α对脂肪细胞糖摄取的影响,鉴定IR模型.结果:TNF-α抑制胰岛素诱导前、后的脂肪细胞糖转运,抑制作用呈剂量依赖性,其中20 μg·L-1TNF-α的抑制率分别为79.2％和81.4％(P＜0.05).结论:肿瘤坏死因子α可诱导3T3-L1脂肪细胞产生IR,这种细胞模型简便、可靠.     

葛根调控PPARs信号通路改善脂肪细胞胰岛素抵抗的体外研究

目的 通过体外研究探讨葛根改善脂肪细胞胰岛素抵抗的关键分子机制。方法 优化建立胰岛素抵抗（IR）-3T3-L1细胞模型,以5%、10%和15%葛根含药血清干预24 h后,采用ELISA法检测脂肪细胞上清液中脂联素（ADPN）含量;油红O染色法观察脂肪细胞的形态变化。分子对接预测葛根化学成分与过氧化物酶体增殖物激活受体家族（PPARs）的结合活性。采用Western Blot法检测脂肪细胞PPARγ/α蛋白及其磷酸化表达水平,并采用试剂盒检测其PPARγ/α活性;以PPARγ/α特异拮抗剂GW9662/GW6471分别干预后,采用qPCR法检测PPARγ/α及其调控基因的转录水平。结果 与IR模型组比较,5%、10%和15%葛根含药血清组细胞外泌ADPN含量显著增加（P<0.05,P<0.01）,小脂肪细胞数量增多,胞内脂滴变小。分子对接显示葛根中多个活性成分与PPARγ和PPARα有较强结合活性,而与PPARδ结合相对较弱。与IR模型组比较,5%、10%和15%葛根含药血清能显著上调PPARγ和PPARα蛋白表达（P<0.001）,下调p-PPARγ(Ser112)蛋...     

三黄消渴汤对胰岛素抵抗3T3-L1脂肪细胞的影响

目的探讨三黄消渴汤配伍对胰岛素抵抗3T3-L1脂肪细胞糖脂代谢的调控作用,阐明其降糖机理。方法培养3T3-L1前脂肪细胞并采用以地塞米松、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤和胰岛素诱导分化为成熟的脂肪细胞,采用地塞米松诱导成熟的脂肪细胞建立胰岛素抵抗3T3-L1细胞模型。以该模型为手段,以葡萄糖消耗量、细胞游离脂肪酸的溢出水平为主要指标,通过拆方、组方对三黄消渴汤的降糖作用进行研究。结果与模型组相比,黄连组和配伍组均可降低培养液中葡萄糖的含量(P0.01),提高葡萄糖的利用率,配伍组效果优于单药组。且含或不含10 nmol·L-1胰岛素的条件下,各组培养上清液中游离脂肪酸浓度均明显低于模型组(P0.01),与胰岛素(10 nmol·L-1)无依存关系。结论三黄消渴汤配伍能显著增加3T3-L1脂肪细胞的葡萄糖消耗量,同时可减少游离脂肪酸的溢出,通过调节糖代谢和脂代谢改善胰岛素抵抗。     

葛根素对3T3-L1前脂肪细胞分化及胰岛素抵抗模型糖代谢的影响

目的:研究葛根素(Pur)对3T3-L1前脂肪细胞增殖、分化的影响,以及在胰岛素抵抗状态下对3T3-L1脂肪细胞葡萄糖代谢的影响。方法:不同浓度Pur干预3T3-L1细胞,MTT法检测其对细胞增殖的影响;油红O染色法检测其对前脂肪细胞分化过程及成脂的影响;地塞米松诱导3T3-L1细胞建立胰岛素抵抗模型,用不同浓度Pur进行干预,测定细胞的葡萄糖消耗量。结果:Pur(3～300μmol/L)对3T3-L1前脂肪细胞增殖无明显影响;Pur(30～300μmol/L)促进3T3-L1细胞的分化成脂,增加胰岛素抵抗状态下3T3-L1脂肪细胞的葡萄糖代谢,且具有量效关系。结论:Pur能够促进3T3-L1细胞的分化成脂,增加胰岛素抵抗状态下3T3-L1脂肪细胞的葡萄糖代谢,改善胰岛素抵抗。     

宫颈CIN免疫相关转录因子T-bet、GATA3、Foxp3的表达

目的 研究各级宫颈上皮内瘤变(CIN)组织中T-bet、GATA3、Foxp3的表达.方法 将宫颈组织按病变程度分为宫颈炎症组、CIN Ⅰ级组、CIN Ⅱ级组和CIN Ⅲ级组,组织包埋、切片后进行镜下观察及免疫组化检测.结果 各组病变组织中T淋巴细胞数量无显著性差异(P>0.05);T-bet阳性细胞数量随病变进展增多...     

梓醇与小檗碱及其配伍对胰岛素抵抗3T3-L1脂肪细胞的影响

目的观察梓醇与小檗碱及其配伍对地塞米松诱导的胰岛素抵抗3T3-L1脂肪细胞葡萄糖消耗、转运及这一过程中过氧化物体增殖物激活受体(PPAR-γ)mRNA表达的影响。方法采用地塞米松诱导胰岛素抵抗细胞模型,分别给予罗格列酮、小檗碱、梓醇、梓醇 小檗碱进行干预,以葡萄糖氧化酶法检测培养液中葡萄糖消耗量,以2-脱氧-[3H]-D-葡萄糖摄入法观察葡萄糖的转运率,以RT-PCR检测PPAR-γmRNA的表达。结果含或不含10nmol/L胰岛素的条件下,梓醇、小檗碱及其配伍组胰岛素抵抗脂肪细胞的葡萄糖消耗量和转运率较模型组明显改善(P<0.05、0.01),配伍组效应优于梓醇、小檗碱单药组(P<0.05、0.01);且小檗碱组及配伍组PPAR-γmR-NA的表达降低(P<0.05、0.01)。结论梓醇、小檗碱均能增加葡萄糖消耗和转运,改善胰岛素抵抗,其作用不依赖胰岛素的存在,且小檗碱及两药配伍还能下调脂肪细胞PPAR-γmRNA的表达水平,提示梓醇、小檗碱改善胰岛素抵抗的作用机制可能与罗格列酮不同。     

Effect of ginsenosides Rg3 and Re on glucose transport in mature 3T3-L1 adipocytes

Ginsenosides, the active component of Panax ginseng, have been shown to evidence a variety of biological activities associated with hyperglycemia, obesity and type 2 diabetes mellitus. This study evaluated the effects of the ginsenosides, Rg3 and Re, on glucose uptake and the glucose transport system in mature 3T3‐L1 cells. The results demonstrated that the glucose uptake of ginsenosides Rg3 and Re at concentrations of 1–10 µM significantly increased by approximately ～10% and ～12%, respectively. Furthermore, the glucose transporter 4 (GLUT4) mRNA expression of ginsenosides Rg3 and Re at 10 µM was increased by approximately ～1.73 and 1.43 fold, respectively. It was further confirmed in a series of experiments that ginsenosides Rg3 and Re stimulated the mRNA expression of insulin receptor substrate (IRS‐1) and the expression of phosphatidylinositol 3‐kinase (PI3K)‐110α protein, which is involved in downstream events in the insulin signaling pathway. These findings demonstrate that ginsenosides Rg3 and Re may stimulate glucose uptake via the PI3K pathways involving IRS‐1. Further, our results suggest that both of these ginsenosides might prove useful as effective antidiabetic and antihyperglycemic agents. Copyright © 2010 John Wiley & Sons, Ltd.     

Inhibition of preadipocyte differentiation and lipid accumulation by Orengedokuto treatment of 3T3-L1 cultures

Obesity is a major cause of metabolic syndrome and is due to an increase in the number and hypertrophy of adipocytes. Accordingly, inhibition of the differentiation and proliferation of adipocytes may be used in the treatment and prevention of metabolic syndrome. This study investigated the effects of 50 commonly used Kampo medicines on the differentiation of 3T3-L1 preadipocytes to search for a drug with an antiobesity effect. Kampo medicines were screened, and the strongest differentiation-inhibitory effect was noted with Orengedokuto. To explore the active ingredients in Orengedokuto, the effects of four crude drug components of Orengedokuto were investigated. It was found that the differentiation-inhibitory effect of Orengedokuto was accounted for by Coptidis rhizome and Phellodendri cortex. Furthermore, berberine, a principal ingredient common to Coptidis rhizome and Phellodendri cortex, showed a differentiation-inhibitory effect. The effect of berberine involves an inhibition of the mRNA and protein expression of peroxisome proliferator-activated receptor γ (PPARγ) and CCAAT/enhancer binding protein α (C/EBPα). Moreover, berberine inhibited lipid accumulation in adipocytes. These findings suggest that an antiobesity effect could be a new indication for Orengedokuto and that its active ingredient is berberine, with a mechanism involving the inhibition of PPARγ and C/EBPα expression.     

La（NO3）3对猴头菌多糖产生的影响

在猴头菌（Ｈｅｒｉｃｉｕｍ ｅｒｉｎａｃｅｕｓ）菌丝发酵增减液中,加入不同浓度的Ｌａ（ＮＯ３）３,接种接头７ｄ后,测定菌体和上清液的多糖含量,发现０．５ｍｍｏｌ／Ｌ的Ｌａ（ＮＯ３）３可促进菌丝分泌胞外多糖,发酵液中多糖含量对照高１２６．６９％;０．７５ｍｍｏｌ／Ｌ的Ｌａ（ＮＯ３）３可刺激菌丝多糖的合成,水提多糖含量比对照高１９．４％,碱提多糖含量比对照高４．７１％。     

小檗碱对3T3-L1前脂肪细胞及其胰岛素抵抗模型的影响

目的:探查小檗碱的体外安全浓度及其对脂肪细胞的抗胰岛素抵抗(IR)活性。方法:3T3-L1前脂肪细胞分为空白组和小檗碱不同浓度(0.001~10μmol·L-1)组,48 h后MTT法测定各组的A值。成熟的3T3-L1脂肪细胞分为空白组和IR模型组,模型组细胞经10μmol·L-1胰岛素(Ins)诱导24,48 h。检测各组培养液和细胞葡萄糖含量。检测IR模型细胞经小檗碱不同浓度(0.000 1~1μmol·L-1)干预24,48 h后的培养液中葡萄糖含量。结果:小檗碱0.01~1μmol·L-13个浓度和10μmol·L-1作用的前脂肪细胞A值均显著升高或降低(P0.05,P0.01);经Ins诱导24,48 h的培养液和细胞葡萄糖含量均显著增加或减少(P0.01);作用24 h的小檗碱0.01~1μmol·L-1和作用48 h的0.000 1~1μmol·L-1各浓度组培养液中的葡萄糖量均显著减少(P0.01)。结论:小檗碱的体外细胞安全浓度较低,低浓度小檗碱对脂肪细胞即具有显著的抗IR活性。