葛根上调肝胰岛素抵抗HepG2细胞OB-R,IRS2,GLUT1和GLUT2蛋白调节糖代谢的研究

研究中药葛根对人肝癌Hep G2细胞胰岛素抵抗(IR)模型糖代谢的改善作用并初步探讨葛根降糖的分子作用机制。该实验采用课题组优化方法,1×10~(-9)mol·L~(-1)胰岛素加3.75×10~(-6)mol·L~(-1)地塞米松联合给药Hep G2细胞48 h建立稳定的IR模型;CCK-8法检测葛根含药血清对细胞活性的影响;葡萄糖氧化酶法检测多个时间点(12,15,18,21,24,30,36 h)IRHep G2细胞葡萄糖消耗量;蒽酮法检测细胞内糖原含量;Western blot法检测胰岛素受体底物2(IRS2)、瘦素受体(Ob-R)、葡萄糖转运蛋白1(GLUT1)和GLUT2蛋白表达水平。研究结果显示葛根含药血清(5%,10%,15%)对IR-Hep G2细胞的活力没有明显的影响;5%和10%葛根含药血清在给药18,21,24 h均显著上调IR-HepG2细胞葡萄糖消耗量(P0.01),15%葛根含药血清除给药15 h上调葡萄糖消耗量较弱(P0.05),18,21,24,30 h都显著上调葡萄糖消耗量(P0.01),呈现一定程度剂量依赖性。葡萄糖消耗时效实验确认24 h是最佳时间点,进一步研究发现葛根含药血清作用24 h增加胞内糖原含量(P0.01);上调IRS2,Ob-R,GLUT1和GLUT2蛋白表达量。葛根含药血清降糖作用可能部分通过上调Ob-R和IRS2蛋白表达来调节以PI3K/PDK为中心的胰岛素信号通路;上调IR-HepG2细胞GLUT1和GLUT2表达量,加速葡萄糖转运进入肝细胞中并增加糖原合成来增强IR-HepG2细胞的胰岛素敏感性来实现的。     

3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗模型建立、优化及分子指标鉴定

[摘要]：目的：探讨3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗（Insulin Resistance,IR）模型建立条件、优化及分子指标鉴定。方法：采用3-异丁基-1-黄嘌呤（3-isobutyl-1-methylxanthine, IBMX）,地塞米松（Dexamethason,DEX）和胰岛素联合诱导3T3-L1前脂肪细胞分化为成熟脂肪细胞,油红O染色鉴定。采用1μmol·L-1DEX诱导建立IR-3T3-L1脂肪细胞,1μmol·L-1DEX联合10μmol·L-1罗格列酮（Rosiglitazone,ROS）联合诱导建立IR-3T3-L1脂肪细胞。葡萄糖氧化酶-过氧化物酶法（Glucose oxidase-peroxidase,GOD-POD）检测不同时间点细胞培养液葡萄糖含量,确认IR-3T3-L1细胞模型最佳诱导时间和IR状态稳定性;甘油磷酸氧化酶法(glycerol phosphate oxidase,GPO-POD)测定胞内甘油三酯（Triglyceride,TG）含量。荧光定量qPCR和Western blot法分别检测脂联素（Adiponectin,ADPN）和葡萄糖转运蛋白-4（Glucose transporter 4,GLUT4）mRNA基因和蛋白质表达水平。结果：DEX作用3T3-L1脂肪细胞96h葡萄糖消耗差值比例最大,为46.84%;DEX ROS作用72h葡萄糖消耗差值比例最大,为22.77%,可确认为两种IR模型建立的最佳时间点,其后可保持稳定IR状态至少60h。两类IR细胞中的GLUT4和ADPN mRNA和蛋白表达水平较正常组显著降低（P<0.01）,相较于DEX ROS组,DEX单独诱导细胞内GLUT4和ADPN mRNA和蛋白表达水平降低更显著。结论：DEX组和DEX ROS组两种诱导方法抑制GLUT4和ADPN mRNA和蛋白表达水平来建立稳定可靠的IR-3T3-L1细胞模型,但DEX单独诱导IR模型方法更稳定可能与更有效抑制了ADPN mRNA和蛋白表达导致葡萄糖消耗下降更为显著。     

葛根调节脂肪细胞糖脂代谢改善胰岛素抵抗的研究

该实验通过检测葛根对胰岛素抵抗(IR)3T3-L1脂肪细胞葡萄糖消耗,甘油三脂(TG)含量及PPARγ,ADPN,GLUT4,LPL,FABP4,FASn表达量的影响来探讨葛根调节糖脂代谢改善脂肪IR的作用机制。先采用3T3-L1前脂细胞诱导分化的成熟脂肪细胞,地塞米松诱导建立IR模型,将脂肪细胞分为正常组,IR模型组,罗格列酮阳性组,低、中、高剂量葛根含药血清组,以葡萄糖氧化酶-过氧化物酶(glucose oxidase-peroxidase,GOD-POD)法检测细胞培养液葡萄糖含量和甘油磷酸氧化酶(glycerol phosphate oxidase,GPO-POD)法测定胞内TG含量,荧光定量q PCR检测PPARγ,ADPN,GLUT4,LPL,FABP4(a P2),FASn基因mRNA水平。结果显示1μmol·L~(-1)地塞米松作用3T3-L1脂肪细胞96 h,与正常组比较,模型组葡萄糖消耗量降低(P0.01),胞内TG含量增加(P0.01),由此确认建立IR模型;与IR组比较,葛根含药血清干预IR细胞24 h葡萄糖消耗量上升(P0.01),胞内TG含量降低(P0.01),中、高剂量葛根含药血清组升高PPARγ,ADPN和GLUT4表达(P0.01),PPARγ与后两者基因表达呈现一致性。脂代谢相关基因检测结果显示仅高剂量葛根含药血清显著升高LPL表达(P0.05);各剂量葛根含药血清下调FABP4表达(P0.01);中、高剂量的葛根含药血清上调FASn基因表达(P0.01)。该实验表明葛根提高IR-3T3-L1脂肪细胞对葡萄糖的摄取能力,降低细胞内TG积聚,干预多个重要糖脂代谢基因,推测以PPARγ为中心多靶点调节糖脂代谢改善脂肪IR。     

葛根芩连汤激活PPARγ上调脂联素和GLUT4表达改善脂肪胰岛素抵抗

该实验研究复方葛根芩连汤体内外改善脂肪胰岛素抵抗(IR)的药效及相关分子机制。采用高糖高脂饮食加小剂量链脲佐菌素诱导糖尿病大鼠模型,葛根芩连汤给药干预3个月,检测糖尿病大鼠空腹血糖、胰岛素和糖化血清蛋白,计算胰岛素抵抗指数。提取大鼠脂肪组织总RNA,q PCR检测糖尿病大鼠过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)、脂联素(ADPN)、葡萄糖转运蛋白4(GLUT4)、葡萄糖转运蛋白2(GLUT2)、乙酰辅酶A羧化酶α基因(ACACA)和乙酰辅酶A羧化酶β(ACACB)基因mRNA表达水平。1μmol·L~(-1)地塞米松诱导建立稳定IR-3T3-L1脂肪细胞模型,CCK-8法检测葛根芩连汤含药血清对细胞活力的影响,采用5%,10%,15%葛根芩连汤含药血清干预24 h检测细胞培养液葡萄糖含量、游离脂肪酸(NEFA)含量和外泌脂联素含量,测定细胞内甘油三酯(TG)含量。荧光定量q PCR和Western blot分别检测IR-3T3-L1细胞PPARγ,ADPN和GLUT4 mRNA和蛋白质表达水平。结果显示葛根芩连汤给药3个月可明显降低糖尿病大鼠的空腹血糖、胰岛素和糖化血清蛋白(P0.01),下调胰岛素抵抗指数(P0.05),具有较好的降糖效果。葛根芩连汤可显著升高糖尿病大鼠脂肪组织PPARγ,ADPN,GLUT4,GLUT2,ACACA和ACACB基因mRNA表达水平。5%,10%,15%葛根芩连汤含药血清均可显著性上调IR-3T3-L1脂肪细胞葡萄糖消耗量(P0.01);降低IR-3T3-L1细胞TG含量(P0.01);一定程度下调NEFA含量但并不显著。此外,葛根芩连汤含药血清剂量依赖上调外泌ADPN,15%含药血清上调ADPN非常显著(P0.01);各剂量含药血清显著上GLUT4表达(P0.01)。该研究显示葛根芩连汤激活PPARγ上调ADPN和GLUT4调节糖代谢改善脂肪IR。     

小檗碱对脂肪胰岛素抵抗细胞PPARγ及脂肪分泌因子表达的影响

脂肪分泌细胞因子与脂肪组织胰岛素抵抗(IR)密切相关,在糖尿病的发生发展研究中越来越受到重视。该实验主要研究小檗碱对脂肪胰岛素抵抗(IR)细胞PPARγ和脂肪分泌因子mRNA表达的影响,探讨小檗碱增强胰岛素敏感性的分子机制及微滴数字PCR(ddPCR)方法的应用优势。该实验采用ddPCR绝对定量分析简单直观确定合适的内参基因,ddPCR和荧光定量法(qPCR)方法比较研究不同剂量(10,20,50,100μmol·L-1)小檗碱干预IR 3T3-L1脂肪细胞中PPARγ、脂联素、抵抗素和瘦素mRNA表达;加入GW9662研究PPARγ和脂联素mRNA表达的内在关联。ddPCR结果发现β-actin在脂肪细胞中表达稳定,适合作为内参基因对定量PCR数据标准化。ddPCR和qPCR方法均显示与IR模型组相比,10,20,50,100μmol·L-1小檗碱呈现剂量依赖降低脂联素mRNA表达(P0.01)。对于PPARγ,qPCR显示20,50,100μmol·L-1小檗碱呈现剂量依赖降低其表达(P0.01),而ddPCR仅在50,100μmol·L-1降低其表达(P0.05)。PPARγ特异拮抗剂GW9662干预实验表明脂联素基因表达受PPARγ直接调控(P0.05)。ddPCR探针法检测到各剂量小檗碱均剂量依赖显著降低抵抗素和瘦素mRNA表达(P0.01)。结果揭示小檗碱调节脂联素起到胰岛素增敏作用并非通过PPARγ依赖途径在转录调控水平上调脂联素表达,推测可能是在翻译后调控水平上调高聚体脂联素比例。小檗碱下调抵抗素和瘦素表达减轻脂解改善IR。ddPCR比qPCR具有更好线性范围和灵敏度,对低丰度表达基因检测具有明显的技术优势。     

3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗模型的建立、优化及分子指标鉴定

目的探讨3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗(Insulin resistance,IR)模型建立的条件、优化及分子指标鉴定。方法采用3-异丁基-1-黄嘌呤(3-isobutyl-1-methylxanthine,IBMX)、地塞米松(Dexamethason,DEX)和胰岛素联合诱导3T3-L1前脂肪细胞分化为成熟脂肪细胞,跟踪观察其诱导分化过程中的形态变化,并采用油红O染色鉴定。采用DEX(1μmol·L~(-1))单独诱导及DEX(1μmol·L~(-1))+罗格列酮(Rosiglitazone,ROS,10μmol·L~(-1))联合诱导建立IR-3T3-L1脂肪细胞。采用葡萄糖氧化酶-过氧化物酶法(Glucose oxidase-peroxidase,GOD-POD)检测不同时间点细胞培养液中葡萄糖含量,确定IR-3T3-L1脂肪细胞模型的最佳诱导时间,考察3T3-L1脂肪细胞模型IR状态的稳定性;采用CCK-8法测定IR-3T3-L1脂肪细胞活性;采用甘油磷酸氧化酶法(glycerol phosphate oxidase,GPO-POD)测定IR-3T3-L1细胞甘油三酯(Triglyceride,TG)含量;采用实时荧光定量PCR(q PCR)和Western Blot法分别检测IR-3T3-L1脂肪细胞的脂联素(Adiponectin,ADPN)及葡萄糖转运蛋白4(Glucose transporter 4,GLUT4)的mRNA、蛋白质表达水平。结果 DEX诱导3T3-L1脂肪细胞96 h,葡萄糖消耗差值比例达最大为46.84%;DEX+ROS诱导72 h,葡萄糖消耗差值比例达最大为22.77%,可作为2种IR模型建立的最佳时间点。与正常组比较,DEX及DEX+ROS诱导建立的2种IR模型葡萄糖消耗量均显著降低(P0.05,P0.01),2种方法建立的IR-3T3-L1细胞模型60 h内均保持稳定;IR模型组细胞活性均无明显变化(P0.05),2种诱导试剂对IR脂肪细胞活性均无明显影响;IR模型组TG含量均显著升高(P0.01),DEX+ROS组TG含量明显高于DEX组;IR模型组ADPN、GLUT4 mRNA及蛋白表达水平均显著下调(P0.01),且DEX组下调幅度较DEX+ROS组更加明显。结论 DEX单独诱导及DEX+ROS联合诱导2种方法均可建立稳定的IR-3T3-L1细胞模型,DEX诱导IR-3T3-L1细胞模型优于DEX+ROS,其机制可能与GLUT4及ADPN表达显著降低有关。