基于LNA-TaqMan探针实时荧光定量PCR检测技术的药用黄精掺伪研究

目的 建立一种快速、灵敏、有效的实时荧光定量聚合酶链式反应（PCR）方法,用于检测湖北黄精掺伪药用黄精。方法 基于锁核酸（LNA）-TaqMan探针实时荧光定量PCR技术,利用不同基原药用黄精样品的叶绿体DNA中trnC-petN基因序列差异,根据常见混伪品湖北黄精特异性差异位点设计筛选探针引物,并对引物及LNA-TaqMan探针的特异性进行验证。根据扩增曲线临界循环数（C_t）值的差值计算湖北黄精掺伪比例。结果 基于LNA-TaqMan探针能够特异性地检测出湖北黄精并确定掺伪比例,在湖北黄精掺伪1%时,仍可稳定检出。结论 该方法简便准确、稳定可靠,可以用于药用黄精掺伪湖北黄精定量检测。     

蜈蚣配方颗粒的位点特异性PCR鉴别

目的 为进一步保障蜈蚣药材及其制品的质量与临床疗效，建立蜈蚣配方颗粒特异性聚合酶链式反应（PCR）鉴别方法。方法 根据蜈蚣细胞色素C氧化酶亚基3（COX-3）基因序列筛选适用于蜈蚣配方颗粒的稳定引物区间，并在区间内筛选获得蜈蚣及其混伪品的单核苷酸多态性（SNP）位点，设计特异性鉴别引物。分别收集蜈蚣及其混伪品，考察退火温度、循环次数、不同Taq酶、DNA模板量、不同PCR仪、不同引物量等因素对PCR鉴别方法的影响，建立并优化PCR反应体系，并对此方法的专属性及适用性进行考察验证。结果 PCR鉴别反应体系为2×M5 PCR Mix 12.5 μL，蜈蚣配方颗粒鉴别引物（10 μmol·L^-1）各0.4 μL，DNA模板2.5 μL，无菌双蒸水9.2 μL。PCR反应参数为94 ℃预变性3 min，循环反应30次（94 ℃变性20 s，62 ℃退火20 s，72 ℃延伸45 s），72 ℃延伸5 min。利用上述PCR反应体系和反应参数对蜈蚣药材及其制品进行扩增，电泳检测结果表明所有正品均可在约135 bp处显示出一条明亮条带，而混伪品无条带。结论 建立的特异性PCR鉴别方法可准确对蜈蚣药材、饮片、标准汤剂冻干粉、配方颗粒中间体、配方颗粒成品进行准确鉴别，为进一步保障蜈蚣药材及其制品的质量具有重要意义。     

断肠草与金银花类药材水提液特异性PCR鉴定方法研究

目的: 研究断肠草与金银花类药材水提液的DNA分子鉴别方法。方法: 采集不同产地的断肠草药材13份、金银花32份、山银花21份和水银花5份,所有样品提取总DNA,并对断肠草、金银花、山银花的水提液进行DNA提取。通过对断肠草psbA-trnH片段进行扩增、测序,并搜索GenBank数据库中收录的中金银花类药材基原植物psbA-trnH序列,进行同源比对后根据其变异位点设计特异性鉴别引物。结果: 通过使用特异性引物对所有样品进行PCR扩增,发现断肠草可扩增出97 bp片段,而金银花类药材则不能扩增出条带。结论: 通过特异性PCR的方法实现了断肠草与金银花类药材水提液的快速、准确鉴别。     

人参PgWRKY22基因的克隆及在磷胁迫下的表达分析

目的 克隆人参Panax ginseng转录因子基因PgWRKY22,进行生物信息学、亚细胞定位及外源磷胁迫表达分析。方法 根据人参转录组数据库设计特异性引物,PCR扩增PgWRKY22全长cDNA序列,命名为PgWRKY22,并对其进行生物信息分析;构建绿色荧光融合表达载体PgWRKY22-eGFP,利用农杆菌侵染烟草叶片的瞬时表达法分析亚细胞定位;实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测PgWRKY22在人参组织中的表达特异性以及在外源磷作用下的表达模式。结果 人参转录因子基因PgWRKY22的cDNA序列为975 bp,编码324个氨基酸;PgWRKY22蛋白属于WRKY超家族蛋白,具有典型的WRKY结合域,该蛋白不稳定,属于亲水性蛋白,无规则卷曲为主要组成部分;PgWRKY22蛋白与丹参SmWRKY、葡萄VvWRKY22、长春花CrWRKY22、独脚金SaWRKY27蛋白具有较高的同源性,与西洋参PqWRKY1、PqWRKY2,人参PgWRKY1、PgWRKY3、PgWRKY4具有较近的系统发育关系;亚细胞定位显示PgWRKY22定位于细胞核上;qRT-PCR表明PgWRKY22在人参的侧根和主根中表达较高,在叶和茎中次之;在外源磷浓度为2 mmol/L下的表达显著高于其他磷浓度下的表达。结论 克隆获得PgWRKY22的cDNA序列及表达信息,可为后续进行基因功能鉴定和人参栽培的磷营养调控提供参考。     

实时荧光核酸扩增技术在女性泌尿生殖道 淋球菌感染检测中的效果

〔摘 要〕 目的：分析女性泌尿生殖道淋球菌感染检测中应用实时荧光核酸扩增技术的检测效果。方法：选取 2020 年 1 月至 2021 年 5 月晋江市妇幼保健院收诊的疑似泌尿生殖道淋球菌感染女性 75 例为研究对象。所有研究对 象均接受直接涂片法、培养法及实时荧光核酸扩增技术检测，比较三种方法的检测结果。 结果：实时荧光核酸扩增技 术的尿液样本、拭子样本检测结果相同，培养法、实时荧光核酸扩增技术的检测阳性率均高于直接涂片法，差异均具 有统计学意义（P ＜ 0.05）；培养法与实时荧光核酸扩增技术的检测阳性率比较，差异无统计学意义（P ＞ 0.05）。 在灵敏度、特异度、阳性预测值及阴性预测值上，实时荧光核酸扩增技术均高于直接涂片法，差异均具有统计学意义 （P ＜ 0.05）。结论：实时荧光核酸扩增技术应用于女性泌尿生殖道淋球菌感染检测中的效果良好，检出率高。     

侵染三七的三七Y病毒和中国番茄黄化曲叶病毒PCR同步检测技术

目的 建立一种高效、快速、准确地同步检测侵染三七Panax notoginseng的2种病毒——三七Y病毒（Panax notoginsengvirus Y,PnVY）和中国番茄黄化曲叶病毒（tomato yellow leaf curl China virus,TYLCCNV）的双重PCR技术。方法 分别以单一感染PnVY或TYLCCNV及复合侵染了这2种病毒的染病三七植株为样品,CTAB法提取叶片总核酸作为模板,根据GenBank上已登录的PnVY和TYLCCNV这2种病毒核酸序列设计特异性检测引物。通过单一PCR技术明确染病三七样品PnVY和TYLCCNV的发生情况,筛选出可用于一步法双重PCR检测PnVY和TYLCCNV的引物组合及引物浓度,并对反应条件进行优化。对扩增产物进行克隆测序,验证一步法双重PCR检测的准确性和特异性。结果 建立的一步法双重PCR检测技术能同步有效地检测三七病样中的PnVY和TYLCCNV,检测灵敏度高,最低检测限点为核酸原液的0.01稀释倍数,特异性强。结论 所建立的一步法双重PCR检测技术可以高效、快速、准确、特异地同步检测三七样品中的PnVY、TYLCCNV2种病毒。     

SYBR Green qPCR 检测内镜活检 胃组织石蜡标本幽门螺杆菌

〔摘 要〕 目的：建立一种高效、特异的检测内镜活检胃组织石蜡包埋标本幽门螺杆菌（Hp）实时荧光定量聚合酶链 式反应（qPCR）方法。 方法：针对 Hp 23S 核糖体核糖核酸（rRNA）基因设计特异度引物，建立 SYBR Green qPCR 反应 体系，并验证该方法的特异度、灵敏度和重复性。用该方法对 20 份内镜活检胃组织石蜡标本进行检测，同时作免疫组织 化学染色分析。阳性扩增产物以 Sanger 测序法明确克拉霉素基因突变情况。 结果：本研究 qPCR 方法具备良好特异度和灵 敏度，最低可检测 2.3×10² copies·μL^-1 的质粒脱氧核糖核酸（DNA）。标准曲线表明其具有良好线性关系，直线方程为 y = –3.6106x + 44.626，R² 为 0.9879 ＞ 0.98。不同浓度标准品的批内变异系数为 0.20 % ~ 2.19 %，批间变异系数为 1.24 % ~ 2.63 %，均＜ 3 %，表明该方法的稳定性和重复性良好。针对 20 份疑似感染 Hp 的内镜活检胃黏膜组织石蜡标本，该方法 检出 Hp 阳性样品 14 份，阳性检出率为 70 %，免疫组织化学染色方法检出 Hp 阳性样品 15 份，阳性检出率为 75 %，二者 的符合率为 93.33 %。阳性扩增产物经 Sanger 测序法测序显示均为 Hp 23S rRNA 基因片段，且 14 例样品中有 5 例存在克拉 霉素耐药基因突变。 结论：本研究建立的 SYBR Green qPCR 方法的特异度、灵敏度和重复性良好，后续阳性扩增产物的测 序结果可明确克拉霉素耐药基因突变情况，适用于临床 Hp 感染和克拉霉素耐药性的检测。     

宽体金线蛭的特异性PCR分子鉴定

[目的] 实验旨在通过寻找宽体金线蛭单核苷酸多态性（SNP）位点，设计宽体金线蛭的特异性鉴别引物，建立宽体金线蛭特异性聚合酶链式反应（PCR）检测方法，实现对宽体金线蛭及其常见混伪品的快速鉴别。[方法] 通过比对宽体金线蛭与其常见混伪品的细胞色素C氧化酶亚基I（COI）序列，寻找宽体金线蛭COI基因序列内SNP位点，设计特异性鉴别引物。[结果] 进行PCR后仅宽体金线蛭能够扩增得到149 bp的条带，混伪品不能扩增出明显目的条带。向扩增产物中加入SYBR Green I核酸染料染色，宽体金线蛭样品在紫外灯下显黄绿色荧光，混伪品不显荧光。[结论] 该方法能够准确快速鉴别宽体金线蛭与其常见混伪品，为中药材市场上宽体金线蛭的快速鉴别提供技术支持。     

荧光定量 PCR 检测结核杆菌 DNA 与涂片 抗酸染色诊断肺结核的效果比较

〔摘 要〕 目的：比较荧光定量聚合酶链式反应（PCR）检测结核杆菌脱氧核糖核酸（DNA）与涂片抗酸染色诊断肺结 核的效果。 方法：收集 2017 年 1 月至 2020 年 12 月在新乡市第一人民医院就诊的疑似肺结核患者 95 例的痰液标本 127 份, 对所有痰液标本均实施荧光定量 PCR 检测结核杆菌 DNA 及涂片抗酸染色检测,以痰培养结果为金标准,比较两种检测方 法的诊断效能。 结果：痰培养结果显示,95 例疑似肺结核患者中,61 例患者确诊,确诊率为 64.21 %。荧光定量 PCR 检测 的准确度、特异度、灵敏度及阳性预测值、阴性预测值均明显高于涂片抗酸染色检测,差异均具有统计学意义（P ＜ 0.05）。 结论：荧光定量 PCR 检测结核杆菌 DNA 对肺结核的诊断效能明显高于涂片抗酸染色检测。     

PCR增强剂对药材DNA分子鉴定的影响

评价PCR增强剂对中药材DNA分子鉴定的影响,筛选获得适用于中药材DNA分子鉴定的PCR增强剂。文章分别利用CTAB法和碱裂解法提取180个中药材DNA样品,分析在PCR反应体系中使用PCR增强剂对通用引物ITS2,psbA-trnH,rbcL,matK,trnL-trnF片段PCR成功率的影响及实时荧光定量PCR反应体系中使用增强剂对PCR扩增效率的影响。结果表明BSA与PVP组合可以明显增加ITS2,psbA-trnH,rbcL片段的PCR成功率,且PCR增强剂也能消除位点特异性鉴别假阴性结果,提高分子鉴定的准确性,但降低了实时荧光定量PCR的扩增效率。本研究说明BSA和PVP作为PCR增强剂能增加中药材DNA的PCR扩增成功率和分子鉴别的准确性。     

多重位点特异性PCR鉴别人参、三七、西洋参掺杂

为建立一种能同时鉴别人参、三七、西洋参及其掺杂品的方法。通过分析人参属ITS,18S和matK序列,寻找特异性SNP位点设计引物,建立多重位点特异性PCR法,并对不同来源的人参、三七、西洋参样品进行扩增,根据特异性条带大小进行鉴别。在退火温度为60℃,循环数为35时,人参、三七和西洋参分别出现约250,500,1000 bp的特异性条带。该方法对于人参、三七、西洋参相互掺杂的混合样品,人参中掺杂三七或西洋参以及三七中掺杂西洋参或人参的检出限均为0.5%,对西洋参中掺杂人参的检出限为0.5%,掺杂三七的检出限为1%。表明建立的多重位点特异性PCR可用于人参、西洋参、三七的掺杂鉴定。     

人参属药用植物转录组研究进展

五加科人参属中含有多种药用植物,其中最著名的是人参,西洋参和三七。随着高通量测序技术的发展,使得转录组测序成为挖掘功能基因、筛选分子标记、阐明代谢途径的有力工具。人参等植物的转录组测序为其功能基因组学等方面的研究提供了丰富的基因信息。该文综述了近年来人参、西洋参、三七转录组的研究进展,重点介绍了人参皂苷合成途径的代谢调控及候选基因的挖掘,以期为这3种药用植物的功能基因组学研究提供借鉴。     

人参与当归配伍对人参总皂苷溶出率的影响

目的: 研究药对人参-当归中不同比例配伍后醇提液中人参总皂苷溶出率的变化,探讨两药配伍使用的作用机制,体现中药复方用药整体性理论。 方法: 采用紫外分光光度法对人参与当归不同比例配伍后醇提液中人参总皂苷含量进行测定。 结果: 人参与当归配伍后人参总皂苷的溶出率降低,不同配伍比例降低程度有所不同,1∶1配伍时人参总皂苷的降低率最高。 结论: 人参、当归配伍后人参总皂苷溶出率变化的研究,为药对人参-当归的配伍使用提供科学依据。     

基于高通量测序的三七微生物群落结构特征分析

目的获得鲜三七和干三七菌群结构信息。方法以鲜三七和干三七为研究材料,利用Illumina MiSeq平台,采用高通量测序并进行数据分析。结果鲜三七和干三七共获得637个操作分类单元(OTUs),其中15个OTU为共有,鲜三七和干三七特有的OTU数量分别为484、123个。新鲜三七中占比较大的菌门为变形菌门(Proteobacteria,59.7%)、厚壁菌门(Firmicutes,40.1%);干三七中占比较高的菌门为厚壁菌门(Firmicutes,99.8%)。鲜三七中占比较大的菌属为肠杆菌属(Enterobacter,37.4%)、嗜碱菌属(Alkaliphilus,11.5%);干三七中占比较大的菌属是芽孢杆菌属(Bacillus,54.6%),类芽孢杆菌(Paenibaciiius,44.9%)。KEGG功能预测表明干三七的萜类化合物和聚酮类化合物代谢功能菌群的相对丰度高于鲜三七。结论鲜三七菌群多样性高于干三七;干三七中的萜类化合物和聚酮类化合物代谢功能菌群丰富度高于鲜三七,这为三七发酵皂苷菌株筛选提供了重要参考。     

人参皂苷生物合成研究进展

人参为五加科多年生草本植物,驰名中外的名贵药材,人参的主要活性成分为人参皂苷,大体上可以分为3种:齐墩果烷型、原人参二醇(PPD)和原人参三醇(PPT)。人参皂苷具有抗血栓、抗疲劳、抗衰老、控制肿瘤、增强免疫力等诸多作用。关于人参皂苷的研究已深入到药理、药效和生物合成等各个方面,并有很大的提升,该研究对近年来发表的关于人参皂苷生物合成的相关文章进行总结与综述,为人参皂苷的研究提供一定的指导和参考。     

三七醇提物对秀丽隐杆线虫的降脂作用＊

目的 研究三七醇提物降低秀丽隐杆线虫脂肪沉积的作用以及可能的分子机制。方法 本研究采用秀丽隐杆线虫为模式生物，三七醇提物以不同剂量给药后，观察对线虫的寿命、生殖和抗逆性的影响；采用油红O染色法，观察了线虫体内脂肪沉积的变化；同时,检测了线虫体内的甘油三酯含量和脂肪代谢相关的基因acs-2、pod-2、fat-5的表达水平。结果 与对照组比较：三七醇提物不同给药剂量组均能延长线虫的寿命，增强抗逆性，且高剂量组更为显著（P < 0.01）；对线虫生殖能力没有影响；油红O染色结果显示，三七醇提物可显著降低线虫肠道脂肪沉积（P < 0.01）；三七醇提物高剂量组还能显著降低甘油三酯的含量（P < 0.05），并影响与脂肪代谢相关基因表达水平，其中acs-2 mRNA被上调，pod-2、fat-5mRNA被下调（P < 0.05）。结论 三七醇提物在不影响线虫生命特征的前提下，可减少线虫体内脂肪沉积，对甘油三酯水平及脂肪代谢相关的基因表达水平有调控作用。     

三七总皂苷心脑血管药理作用及其溶血反应

三七总皂苷(total saponins of Panax notognseng,PNS)对于心脑血管疾病具有明确的治疗效应和广泛的应用前景,同时皂苷所具有溶血特性与其分子结构类型及用药剂量有关。该文一方面总结了近5年来PNS在心脑血管药理方面的研究进展;从整体、器官、细胞、分子水平的多项研究表明,PNS具有改善心肌缺血、抗血栓、抗炎、抗氧化、抗动脉粥样硬化、调节血管内皮细胞功能、改善脑缺血损伤等方面的作用。另一方面,通过对PNS以及单体皂苷溶血反应的结构特点、剂量以及检测方法等方面进行文献综述,发现PNS的溶血作用与其分子结构类型及用药剂量密切相关。三七皂苷的结构不同,溶血活性不同,构效关系提示,原人参二醇C-20上糖侧链的长度以及C-3上二糖的连接方式可能影响皂苷的溶血活性。PNS在一定剂量范围内(2.5~250 mg·L-1)无溶血活性,在高浓度(≥500 mg·L-1)时表现出溶血特性。因此,根据三七皂苷单体溶血与抗溶血作用的特点及量效关系,通过控制PNS中具有溶血活性的皂苷单体比例,并通过改进溶血检测方法,可以为三七皂苷制剂临床合理应用提供保障。     

藜芦配伍人参对未成熟小鼠雌激素样作用的影响

目的:观察藜芦配伍人参对未成熟小鼠子宫系数、性激素水平、靶器官子宫和阴道的病理学变化的影响。方法:昆明种雌性小鼠120只,随机分为正常组、特异性雌激素受体拮抗剂ICI组(5 mg·kg-1)、藜芦组(0.045 g·kg-1)、人参低、中、高剂量组(12,18,24 g·kg-1)、ICI和人参低剂量混合组(混合低剂量组)、ICI和人参中剂量混合组(混合中剂量组)、ICI和人参高剂量混合组(混合高剂量组)、藜芦和人参低剂量配伍组(配伍低剂量组)、藜芦和人参中剂量配伍组(配伍中剂量组)、藜芦和人参高剂量配伍组(配伍高剂量组),每组10只,给药5 d后分别观察小鼠子宫系数,血清中雌二醇(E2),黄体生成素(LH),促卵泡生成素(FSH)的水平及子宫、阴道的病理学变化。结果:与正常组比较,人参各剂量组能使未成熟小鼠的子宫系数显著增加(P0.05),E2含量明显升高(P0.05,P0.01),LH,FSH的水平显著降低(P0.05,P0.01),还能明显促进靶器官子宫、阴道的生长发育。配伍藜芦后,人参各剂量组的子宫系数明显降低(P0.05,P0.01),血清E2,LH和FSH水平明显升高(P0.05,P0.01),子宫和阴道的促生长发育作用减弱。结论:藜芦与特定剂量的人参配伍能够妨害人参的雌激素样作用。     

细菌性软腐菌对人参根系分泌物中糖类和氨基酸类的化学趋向性响应

采用毛细管法测定了人参细菌性软腐菌在4种趋化参数(浓度、时间、温度和pH)下对不同氨基酸和糖的趋向性响应。与对照组结果显示,赖氨酸趋化率为2.509 7(pH 8,质量浓度为0.025 mg·L~(-1)、培养温度为25℃、培养时间为60 min),精氨酸趋化率为2.218 8(pH 6、质量浓度为0.25 mg·L~(-1)、培养温度为25℃、培养时间为60 min),L-鼠李糖趋化率为3.091 2(pH 7、质量浓度为0.25 mg·L~(-1)、培养温度为30℃、培养时间为60 min)和D-阿拉伯糖趋化率为3.026 3(pH 6、质量浓度为0.25 mg·L~(-1)、培养温度为30℃、培养时间为45 min)。糖类和氨基酸类对人参细菌性软腐菌有明显的趋化作用,且高浓度的氨基酸和糖对人参细菌性软腐菌的化学趋向性有抑制作用,但趋化作用随浓度的减弱反而增加。     

均匀设计法筛选三七、山楂有效部位组合物剂量配比

目的:研究确定三七、山楂(SS)组合物中2个有效部位最佳配比剂量的有效方法.方法:按照U6(64)表将小鼠随机分为山楂叶总黄酮∶三七叶总皂苷200∶15,100∶1.875,50∶30,25∶3.75,12.5∶60,6.25∶7.5 (mg·kg-1)6个剂量给药组,连续给药5d后,采用小鼠腹腔注射异丙肾上腺素和断头致急性脑缺血两种模型观察小鼠存活时间,分别得出多元回归方程,推算2个有效部位的最佳配比.结果:确定SS组合物中山楂叶总黄酮∶三七叶总皂苷最佳组合比例为20∶15 mg·kg-1,即配比为4∶3,此时药效作用明显(P＜0.05).结论:运用均匀设计与药效学验证相结合的方法可确定有效部位组合物的最佳配比.