地黄中介体亚基基因RgMed6的分离与表达特性

目的克隆地黄中介体亚基基因Rg Med6,分析其编码的蛋白序列特征和基因表达特性。方法利用地黄转录组数据库进行同源比对,获得拟南芥Med6的同源基因片段,通过序列拼接获得RgM ed6的全长开放阅读框(ORF),在NCBI上进行BLASTp获得RgM ed6的同源蛋白,用MAFFT进行多序列联配,应用MEGA 6.0构建系统进化树,以实时荧光定量PCR技术检测Rg Med6在地黄不同组织以及逆境胁迫下的相对表达量。结果获得1条924 bp的c DNA序列,包含1个771bp的完整ORF,编码256个氨基酸,具有Med6蛋白的典型结构域和1个潜在的核定位信号序列。Rg Med6在检测的5个地黄组织(器官)中均有表达,其中在地黄叶片里表达强度最大,其次为花蕾,在茎中表达量最低。在连作地黄块根中RgM ed6的表达量降低,Na Cl胁迫处理下Rg Med6的表达量升高。结论首次克隆了地黄中介体亚基基因Rg Med6,为阐明其在地黄生长发育和逆境胁迫中的分子功能奠定基础。     

怀地黄块根中菊花心与非菊花心部位的化学质量特征比较

利用HPLC对怀地黄"北京1号"生育期内块根中菊花心、非菊花心及整体块根三部位中梓醇、毛蕊花糖苷、地黄苷A、地黄苷D、益母草苷进行含量测定,并结合其HPLC指纹图谱进行整体化学质量特征比较。结果表明,生育期内怀地黄主要成分含量变化趋势不同;各成分在菊花心与非菊花心部位富集量差别较大。梓醇、毛蕊花糖苷与地黄苷D在菊花心与非菊花心中的分布相对均匀,非菊花心部位地黄苷A的含量明显高于菊花心部位,而菊花心部位益母草苷的含量则明显高于非菊花心部位;地黄菊花心、非菊花心及整体块根3部位的HPLC指纹图谱色谱行为基本一致,但是化学成分含量相差较大;通过聚类分析,怀地黄菊花心部位与非菊花心部位、整体块根明显被分为2类。因此,怀地黄菊花心与非菊花心部位化学质量特征存在明显差异。该研究为怀地黄的质量评价和道地性的揭示提供依据。     

鱼腥草乙酰辅酶A酰基转移酶基因克隆、表达及生物信息学分析

目的通过克隆鱼腥草乙酰辅酶A酰基转移酶(acetyl-Co A C-acetyltransferase,AACT)基因c DNA全长,并展开生物信息学分析和表达分析,为解析鱼腥草萜类次生代谢产物的生物合成机制奠定基础。方法采用RT-PCR方法获得AACT基因c DNA序列并进行生物信息学分析;利用实时荧光定量PCR方法检测了AACT基因在鱼腥草的地下茎、地上茎、叶、花中的表达情况。结果克隆获得的AACT基因c DNA全长为1 218 bp,编码405个氨基酸。生物信息学预测AACT蛋白不含跨膜区,不含信号肽。AACT基因在鱼腥草地上茎中的表达量最高,达到1.49,其次是地下茎0.96,花和叶中的表达量相对较低,分别为0.20和0.10。结论首次从鱼腥草中克隆了AACT基因,为进一步阐明该基因在鱼腥草萜类化合物代谢途径中的重要作用奠定基础。     

不同种质地黄块根菊花心与非菊花心部位有效成分特征分析

目的:比较沁怀,85-5,北京1号,QH-1,1706,白选6种地黄生育期内菊花心与非菊花心中梓醇,毛蕊花糖苷,地黄苷A,D,益母草苷,多糖等指标性成分的含量,分析不同地黄种质资源菊花心的成分差异及质量特征,为地黄的质量评价及道地性揭示提供科学依据。方法:梓醇、毛蕊花糖苷含量测定参考2015年版《中国药典》;地黄苷A,D及益母草苷含量测定采用HPLC法,Dikma Diamonsil C_(18)色谱柱(4.6 mm×250 mm,5μm),流动相乙腈-水(4∶96),流速1 mL·min~(-1),检测波长205 nm,柱温30℃,进样量20μL;多糖含量测定采用苯酚-硫酸法。结果:不同种质地黄块根各指标性成分在菊花心与非菊花心部位富集量差异很大。85-5与1706地黄菊花心部位中梓醇含量远高于非菊花心部位,而北京1号与QH-1地黄则是非菊花心部位明显高于菊花心部位;85-5,1706及QH-1地黄中毛蕊花糖苷在菊花心部位中的含量明显高于非菊花心部位,其他3个种质分布相对均匀;沁怀和北京1号地黄块根非菊花心部位中地黄苷A的含量明显高于菊花心部位;85-5,北京1号,1706地黄块根非菊花心部位中地黄苷D的含量均明显高于菊花心中的含量,其他种质差异不大;85-5,白选和1706地黄菊花心与非菊花心部位益母草苷含量差异不大,而北京1号,沁怀,QH-1地黄则为菊花心部位远高于非菊花心部位,差异达2~4倍;6种地黄块根非菊花心部位中的多糖含量明显高于菊花心部位。结论:种质在一定程度上决定了地黄块根次生代谢产物在地黄菊花心与非菊花心部位的积累与分布。     

五味子PLR基因及其启动子的克隆与表达分析

目的从五味子中克隆木脂素生物合成途径松脂醇-落叶松脂素还原酶(Pinoresinol-lariciresinol reductases,PLR)基因及其启动子序列,并进行生物信息学与表达分析。方法根据转录组PLR测序序列设计特异性引物,克隆ScPLR并进行生物信息学分析;采用TAIL-PCR对Sc PLR启动子序列扩增,并进行序列分析;采用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)分析果实不同发育时期ScPLR的表达。结果 Sc PLR基因开放阅读框(ORF)全长837bp,编码278个氨基酸;ScPLR蛋白相对分子质量31419.85,理论等电点8.97;具有跨膜结构,无信号肽,为稳定性疏水蛋白,主要由α-螺旋和无规卷曲构成;亚细胞定位预测Sc PLR主要定位于细胞质;系统进化显示Sc PLR与蓖麻PLR亲缘关系较近。克隆到Sc PLR基因启动子长994bp,具有TATA-box、CAAT-box基本元件、光调控、生长素响应、厌氧诱导、防御和应激反应的多种调控元件;qRT-PCR结果显示ScPLR表达量呈现果实膨大期快速增加而进入着色期迅速降低的变化趋势。结论获得了Sc PLR基因及其启动子序列,ScPLR果实着色期之前高水平表达的趋势和木脂素的动态变化相一致,为进一步研究该基因功能及表达调控奠定了理论基础。     

黄花蒿CMK基因的克隆与功能分析

青蒿素是治疗疟疾的首选药物,黄花蒿为其唯一的药源植物。该研究首次从黄花蒿中克隆到青蒿素生物合成关键基因Aa CMK,其c DNA全长为1 462 bp,ORF 1 197 bp,编码399个氨基酸。研究表明:Aa CMK在黄花蒿各部位中均有表达,但在腺毛体中表达量极高,且该基因的表达受外源Me JA的强烈诱导;亚细胞定位结果显示该基因定位于叶绿体中;在过表达Aa CMK拟南芥中,叶绿素a,叶绿素b及类胡萝卜素的含量极显著提高,证明Aa CMK是利用代谢工程技术提高萜类物质青蒿素生物合成的一个重要候选基因,为利用代谢工程提高青蒿素含量奠定了基础。     

冬凌草IrCYP71基因的克隆和功能

目的:克隆冬凌草二萜类化合物生物合成途径下游关键酶基因Ir CYP71,进行序列特征分析,对此基因编码的蛋白进行原核表达分析以及亚细胞定位,并对蛋白在宿主细胞表达的条件进行了优化。方法:根据转录组测序所得的Ir CYP71基因片段,克隆出全长c DNA序列;构建p ET28a(+)-Ir CYP71重组质粒,转化到Rosetta感受态细胞,小量表达和大量表达蛋白并鉴定,进行包涵体蛋白的纯化与复性,再对复性蛋白纯化鉴定分析。基于gateway克隆技术构建出PCR8/GW/TOPO-Ir CYP71载体之后与改造Pearleygate104载体重组,之后与农杆菌GV3101重组,转入烟草中瞬时表达,从而进行蛋白亚细胞定位。结果:克隆得到的Ir CYP71基因全长c DNA为1 593 bp,编码530个氨基酸,并在Gen Bank注册(登录号MG800628)。经大肠埃希菌表达系统表达的重组蛋白相对分子质量正确,在62 k Da左右,纯化后的重组蛋白总量有1 mg,蛋白纯度为85%。此蛋白亚细胞定位在细胞核。结论:对冬凌草Ir CYP71基因进行了初步验证,并对基因表达的蛋白进行原核表达和亚细胞定位,使该基因在冬凌草二萜成分的生物合成过程中的作用得到了进一步的阐述。     

密度对地黄生长及基因转录特性的影响分析

为了分析种植密度对地黄发育、品质及基因转录特性的影响,以85-5和J9为材料,设置了5 000、25 000、50 000株/亩(1亩≈667 m~2)3个种植密度,分析了地黄叶片和块根的农艺性状,梓醇和毛蕊花糖苷的含量,以及基因表达的变化规律。结果表明,低密度下地黄的叶片大小、单株叶生物量、块根直径、单株块根数、单株块根生物量均明显高于中、高密度。高密度下叶中的梓醇和毛蕊花糖苷含量均较高。块根中的梓醇含量在低密度下较高,变化趋势与叶中类似;而块根中的毛蕊花糖苷含量在高密度下较高。转录组分析发现约1/2的扩展蛋白基因能够响应密度的处理而呈规律性变化,与块根的发育有关。参与梓醇和毛蕊花糖苷生物合成的多个催化酶基因的表达量变化趋势与它们含量的变化趋势一致,可能参与了密度响应的药效成分积累调控。该研究基于大田栽培条件下不同种植密度的地黄发育、药效成分含量和基因表达特征的分析,对通过管理地黄种植密度调控地黄药材的品质和产量提供了重要的依据。     

丹参中转录因子SmMYB87基因的克隆、亚细胞定位和表达分析

目的克隆丹参Salvia miltiorrhiza中第14亚群R2R3 MYB转录因子基因SmMYB87的全长序列,并对其进行生物信息学和表达分析。方法以丹参总RNA为模板,利用同源克隆和c DNA快速扩增(RACE)技术获得SmMYB87 cDNA全长序列。运用生物信息学软件对该基因及其编码蛋白进行结构和理化性质分析,利用q RT-PCR测定SmMYB87在各器官中的表达并构建融合表达载体pTF-486-SmMYB87分析SmMYB87蛋白的亚细胞定位。结果 SmMYB87基因含有2个内含子和1个732 bp的开放阅读框(ORF),编码243个氨基酸。该基因在根、茎、叶和花中均有表达,且4个器官中的表达量没有显著差异。SmMYB87蛋白在细胞核和细胞膜上均有分布。结论 SmMYB87的序列结构和表达分析为进一步研究其在丹参中的生物学作用奠定了理论基础。     

牛樟芝非还原型聚酮合酶基因的克隆及表达分析

目的获得牛樟芝聚酮合酶基因(Ac PKS1)全长,对其进行生物学分析并分析该基因在不同培养基上的表达差异。方法通过对牛樟芝基因组分析获得牛樟芝聚酮合酶基因,通过设计含有起始密码子和终止密码子的特异引物并以牛樟芝c DNA为模板克隆得到Ac PKS1基因全长,并对该基因进行生物信息学分析及在不同培养基上的表达谱分析。结果 Ac PKS1全长6 348 bp,含有6个内含子和7个外显子,外显子编码2 115个氨基酸;通过生物信息学分析,推测该基因为真菌I型非还原型PKS,结构域为SAT-KS-PT-ACP-ACP-TE,系统树分析显示Ac PKS1与其他未知功能的聚酮合酶(PKS)聚为一支,说明Ac PKS1可能是一种新的聚酮化合物环化方式;表达谱分析表明,葡萄糖为Ac PKS1基因表达的必要条件,且葡萄糖含量与Ac PKS基因表达量呈正相关。结论本研究为Ac PKS1功能鉴定以及牛樟芝基因资源利用奠定基础。     

不同品种地黄中毛蕊花糖苷的动态积累规律变化

目的:对大田生长期间不同品种地黄块根和叶片中的毛蕊花糖苷含量进行测定,研究道地产区不同品种地黄块根和叶片中毛蕊花糖苷的积累规律。方法:以栽培地黄85-5,北京1号,沁怀,金九和白选为材料,于2015年和2016年在河南温县大田栽培,以HPLC检测不同采收期不同品种地黄块根和叶片中的毛蕊花糖苷的含量。并以85-5为材料,于2014年进行遮阴处理,以HPLC检测遮阴后地黄块根和叶片中的毛蕊花糖苷含量。结果:不同品种地黄块根和叶片中毛蕊花糖苷含量有较大差异,块根中毛蕊花糖苷含量较高的2个品种是白选和沁怀,两年内毛蕊花糖苷含量变化分别为0.023%~0.620%和0.018%~0.796%;叶片中毛蕊花糖苷含量较高的品种为85-5和北京1号,毛蕊花糖苷含量变化分别为1.955%~5.968%和0.681%~5.941%。不同发育阶段的地黄叶片中,展开叶和衰老叶较幼嫩叶含有较高的毛蕊花糖苷。遮阴对地黄块根中毛蕊花糖苷含量有促进作用,对叶片中毛蕊花糖苷含量有抑制效应。结论:该研究为毛蕊花糖苷高含量地黄新品种的选育提供实验材料和依据,同时也为明确地黄毛蕊花糖苷积累变化的分子机制奠定基础。     

遮阴对地黄块根性状、光合特性及基因转录的影响

目的分析遮阴对地黄块根性状和叶片光合特性的影响,并通过转录组测序阐明遮阴抑制地黄块根膨大的分子机制。方法对地黄进行全光照、60%遮阴、90%遮阴处理,测块根性状及光合特性。利用高通量测序技术对90%遮阴处理和自然光照的地黄块根进行转录组测序,筛选差异表达的基因,同时,利用实时荧光定量PCR对部分基因在根和叶中的表达特性进行分析。结果遮阴后块根长度、直径和单株块根产量均显著降低,90%遮阴处理块根几乎不膨大。地黄块根中薄壁细胞层数减少,导管比例升高。随遮阴程度增加叶绿素a、b及总叶绿素含量逐渐降低,光合能力下降。转录组分析共获得3 348个差异表达的基因,其中1 396个下调,1 952个上调;通过KEGG代谢通路富集分析,将遮阴后差异表达的1 668个基因(53.4%)富集到117个代谢通路中,其中17个代谢通路富集达到显著水平。植物激素信号传导通路最先得到富集,其次是植物病原菌互作通路,苯乙醇苷生物合成通路、淀粉和蔗糖代谢通路也得到了显著富集。在激素信号通路中,多数基因上调表达。遮阴后差异表达的16个扩展蛋白基因中11个下调表达,仅有5个上调表达,与淀粉降解有关的2个β-淀粉酶基因(Bmy)基因均上调表达,而蔗糖磷酸合成酶基因(SPS)下调表达,参与木质素合成的多数基因下调表达,纤维素合成基因多数上调表达。结论遮阴后地黄光合能力下降,光合产物减少,地黄通过一系列激素通路基因的差异表达对遮阴作出响应调控,使块根膨大受阻。     

地黄RgMATE6转运蛋白基因的克隆、亚细胞定位与表达分析

目的克隆地黄多药及有毒化合物外排(multidrug and toxic compound extrusion,MATE)转运蛋白基因RgMATE6,并进行亚细胞定位与时空表达分析,为深入研究其在地黄转运次生代谢产物中的分子功能奠定基础。方法利用地黄转录组数据库候选基因序列,利用实时荧光PCR(RT-PCR)克隆RgMATE6基因;利用生物信息学软件对其编码蛋白的结构、理化性质、同源性和进化树进行分析;通过与绿色荧光蛋白(GFP)融合表达进行亚细胞定位;利用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)的方法测定该基因的时空表达模式。结果克隆获得1892 bp的RgMATE6基因序列,RgMATE6基因编码524个氨基酸、具有2个典型的MatE结构域和12个跨膜结构;RgMATE6蛋白与越橘的VcMATE6蛋白亲缘关系最近;RgMATE6-GFP载体瞬时表达的结果发现RgMATE6蛋白定位在液泡膜上;qRT-PCR分析发现RgMATE6基因在地黄不同时期的根中表达最高,尤其是块根膨大前期。结论RgMATE6蛋白定位在液泡膜上,在地黄块根膨大期的根中表达较高,初步表明RgMATE6可能参与地黄体内次生代谢产物向液泡转运的过程。     

真菌诱导子对怀地黄组培苗生长及次生代谢产物合成的影响

目的:研究分离自地黄不同部位的内生真菌诱导子对怀地黄组培苗生长及其次生代谢产物含量的影响,初步探究其促生作用。方法:以2株Alternaria属内生真菌A.alternata,Penicillium属内生真菌P.axalicum制备不同类型的诱导子,发酵液滤液和菌丝降解液,分别考察其对地黄组培苗株高、鲜重、叶绿素含量、梓醇及毛蕊花糖苷含量的影响,并用SPSS 17.0进行数据分析。高效液相色谱法测定梓醇及毛蕊花糖苷含量。结果:不同菌株制备的真菌诱导子促生作用差异明显,以Penicillium属内生真菌P.axalicum制备的真菌诱导子对怀地黄组培苗促生效果较佳,且以其发酵液滤液促生效果最好。在该培养条件下,怀地黄组培苗株高、鲜重、根长、总叶绿素、梓醇及毛蕊花糖苷含量增加率分别为27.80%,29.49%,22.08%,15.05%,35.98%和68.18%。结论:内生真菌诱导子可促进怀地黄组培苗生长,并提高其次生代谢产物含量,在今后地黄内生真菌应用中可做进一步探究。     

地黄酪氨酸脱羧酶基因的克隆与表达分析

酪氨酸脱羧酶TyDC是植物次生代谢的催化酶,在苯乙醇苷类成分的生物合成中发挥重要作用。根据地黄转录组数据,克隆了地黄酪氨酸脱羧酶基因RgTyDC的全长cDNA序列(GenBank登录号KU640395),并进行生物信息学分析,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测其在地黄不同组织及4种诱导子处理后毛状根中的表达量。结果表明,RgTyDC ORF为1 619 bp,编码509个氨基酸,相对分子质量为56.6 kDa,等电点pI 6.25。RgTyDC与芝麻酪氨酸脱羧酶SiTyDC和猴面花酪氨酸脱羧酶EgTyDC的同源性最高,均为88%。RgTyDC基因在叶片(尤其是衰老的叶片)中表达量较强,在块根中表达量较低。SA和MeJA处理后显著上调表达。这为进一步研究RgTyDC在地黄苯乙醇苷类成分生物合成中的分子功能奠定基础。     

试管地黄形成过程中形态发生的研究

目的 :研究试管地黄形成的形态发生过程 ,比较试管地黄与自然条件下生长的地黄在形态解剖上的异同。方法 :取离体条件下和自然条件下不同阶段形成的地黄块根 ,染色后制成石蜡切片 ,于显微镜下观察。结果与结论 :试管地黄在形态解剖方面与自然条件下生长的地黄具有一致性 ,说明试管地黄在诱导过程中未发生结构上的变化。     

地黄叶片试管块根诱导体系优化的研究

目的:研究不同浓度蔗糖和植物生长物质对地黄叶片试管块根诱导的影响,建立从地黄叶片诱导试管块根的高效体系.方法:以85-5地黄试管苗的叶片作为外植体,先经生根诱导,后转接至正交设计的培养基中,诱导地黄试管块根.结果与结论:NAA对试管地黄诱导影响显著,其次分别为蔗糖和6-BA,以试管苗叶片为外植体诱导地黄试管块根的最佳培养基为MS+6-BA3 mg·L-1+NAA0.1 mg·L-1+蔗糖70g·L-1.该研究为今后利用地黄试管块根进行人工种子和次生代谢研究提供了高效的培养体系.     

地黄块根膨大发生和驱动的组织观察及激素相关基因的调控分析

目的:为了研究地黄块根膨大的发育特征,揭示激素相关基因在这个过程中的调控作用机制。方法:该研究以地黄品种"温-85"为实验材料,采集不同发育时期的地黄块根进行表型观察,利用半薄树脂切片技术观察块根的组织形态。从地黄转录组数据库中挑选与激素合成和响应相关的基因,利用qRT-PCR技术研究激素相关基因在地黄不同发育时期块根组织中的表达变化。结果:地黄的发育阶段可划分为苗期、拉线期、块根膨大初期,膨大中期,膨大后期和成熟期。块根解剖学特征分析表明次生形成层的分裂启动了地黄块根膨大的进程;膨大前期次生形成层的持续快速分裂和副形成层的形成驱动了块根的向外(平周)和侧向(圆周)持续快速膨大。在半薄和超薄切片观察过程中发现在地黄块根中存在有大量的油脂细胞。定量结果分析显示IAA,CK,ABA,乙烯,JA,EB的合成和响应基因整体呈现上调表达趋势,GA的合成与响应基因呈下调趋势,其负调控因子基因则上调表达。大部分激素合成相关基因的表达高峰期处在拉线期、膨大前期。结论:拉线期和块根膨大前期是地黄块根发育最为关键的时期,IAA,CK,ABA,乙烯,JA,EB的合成和响应基因的上调与GA合成基因的下调能促进块根的发育。油脂细胞可能与地黄药用成分的合成与储存有密切关系。该研究为阐述地黄块根发育的规律和分子调控机制进行了有益的探索。     

南方红豆杉DXS基因的克隆与功能分析

目的从南方红豆杉Taxus chinensis获得紫杉醇生物合成途径关键酶1-脱氧-D-木糖醇-5-磷酸合成酶(1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate synthase,DXS)基因(TcDXS)并进行生物信息学和表达模式分析以及亚细胞定位和功能鉴定。方法采用RACE技术获得TcDXS全长;利用qRT-PCR分析TcDXS在南方红豆杉不同部位的表达情况;采用亚细胞定位分析TcDXS在细胞中的位置;用颜色功能互补实验检测TcDXS功能。结果获得的TcDXS由3 031个核苷酸组成,包含了2 229 bp编码区,编码742个氨基酸,其蛋白相对分子质量为79 400,等电点(p I)为7.99;qRT-PCR检测表明TcDXS在南方红豆杉的嫩叶柄中表达量最高,其次是叶和皮,根和茎中的表达量较低;亚细胞定位结果表明,TcDXS定位在叶绿体中;功能互补实验结果表明,在共同转化p AC-BETA和pTrc-TcDXS的大肠杆菌菌落呈现出橘黄色。结论 TcDXS的克隆和功能分析为深入研究紫杉醇生物合成途径和实现其代谢工程奠定了基础。