丹参酮ⅡA联合伊马替尼对慢性髓细胞白血病K562细胞作用的实验研究

目的:探讨丹参酮ⅡA联合伊马替尼对K562细胞凋亡作用的影响及相关作用机制。方法:将K562细胞分为6组:常规培养K562细胞组、1μM伊马替尼单药组、20μM丹参酮ⅡA单药组,以及5μM、10μM、20μM丹参酮ⅡA分别与1μM伊马替尼的联合用药组。在显微镜下观察细胞的形态学变化,检测细胞12 h和24 h的生长情况,利用流式细胞仪检测细胞的凋亡情况,再利用JC-1染料在荧光显微镜下观察细胞线粒体膜电位变化情况。结果:丹参酮ⅡA通过抑制线粒体膜电位,促进细胞凋亡(P0.05);并随丹参酮ⅡA的浓度增加联合用药组的抑制作用也增强。结论:丹参酮ⅡA可显著增强伊马替尼引起的K562细胞凋亡,其机制与线粒体途径有关。     

桔梗皂苷D联合伊马替尼对白血病耐药细胞K562/R的抑制增殖和作用机制研究

桔梗皂苷D(platycodin D,PD)对多种恶性肿瘤有显著抑制作用,对白血病细胞有明显的增殖抑制和诱导凋亡的作用,但其是否有效提高耐药细胞对伊马替尼的敏感性及其发挥功能的分子机制仍未阐明。为了研究PD与伊马替尼(imatinib,IM)联合用药对慢性粒细胞白血病耐药细胞株K562/R的作用及机制。细胞增殖实验检测桔梗皂苷D对伊马替尼增殖抑制功能的影响,采用CCK8测定PD和IM单药及联合用药对K562/R增殖的抑制作用;流式细胞术检测Annexin V-FITC/PI双标记细胞凋亡率的变化,Western blot法检测cleaved caspase-3,cleaved caspase-9,PARP,cleaved PARP,Bcr/abl,p-AKT,p-mTOR蛋白表达。结果显示桔梗皂苷D联合伊马替尼对K562/R细胞的增殖抑制作用和细胞凋亡率比单独用药组效果明显。Western blot法检测结果显示与单药组比较,联合用药组可以明显上调cleaved caspase-3,cleaved caspase-9,cleaved PARP蛋白表达,同时下调PARP,Bcr/abl,p-AKT,p-mTOR蛋白的表达。结果表明桔梗皂苷D可以提高耐药细胞对伊马替尼的敏感性,联合用药在抑制细胞增殖、诱导凋亡、抑制Bcr/abl蛋白和激活PI3K/AKT/mTOR信号通路方面明显优于单独用药。     

丹参酮Ⅱ_A对白血病K562细胞的体外诱导凋亡作用研究

目的研究丹参酮ⅡA对人急性白血病K562细胞的诱导凋亡作用及其作用机制。方法以不同浓度的丹参酮ⅡA(10~50μmol/L)作用于体外培养的K562细胞24、48、72 h,应用MTT法检测细胞生长抑制率,流式细胞术(FCM)检测细胞凋亡率,并对50μmol/L的药物作用不同时间后亚G1期细胞进行检测。应用免疫印迹法(Western blotting)检测Caspase-3及其裂解底物多聚ADP-核糖聚合酶(PARP)的表达水平,并对凋亡调节蛋白Fas、Bax、Bcl-2、Bak、Bid的表达水平进行检测。结果 20μmol/L以上的丹参酮ⅡA可显著抑制K562细胞的生长、诱导细胞发生凋亡,并呈现出明显的量-效与时-效关系;FCM检测结果表明50μmol/L丹参酮ⅡA作用不同时间后,亚G1期细胞(凋亡细胞)逐渐增多。20μmol/L以上的丹参酮ⅡA作用48 h后Caspase-3逐渐被活化出现17 000的亚单位,Caspase-3的作用底物PARP被活化裂解出现89 000的亚单位片段,而且Caspase-3的激活以及PARP的裂解可被Caspase-3的特异性抑制剂z-DEVD-FMK所阻断,促凋亡蛋白Fas以及Bax的表达水平明显升高,而凋亡抑制蛋白Bcl-2及其他促凋亡蛋白Bak和Bid的表达水平则无明显变化。结论丹参酮ⅡA可以通过诱导白血病K562细胞凋亡而发挥体外抗白血病作用,上调促凋亡蛋白Fas和Bax的表达水平及激活Caspase-3可能是丹参酮ⅡA诱导白血病K562细胞发生凋亡的重要作用机制之一。     

隐丹参酮对K562细胞凋亡的影响及其机制

目的 探讨隐丹参酮诱导人慢性髓系白血病K562细胞凋亡的作用及其线粒体途径相关机制。方法 MTT法检测隐丹参酮对细胞增殖的抑制作用;Annexin V-FITC/PI双标记流式细胞术检测丹参酮对细胞凋亡的影响,DAPI染色法观察细胞形态的变化;Western blotting检测丹参酮对细胞凋亡相关蛋白Caspase-3、Caspase-9、PARP、Bax、Bcl-2和细胞色素C（Cyt C）表达的影响,线粒体膜电位检测试剂盒检测丹参酮对线粒体膜电位的影响;检测线粒体膜通透性转运孔（PTP）抑制剂环孢霉素A和caspase抑制剂z-VAD-fmk对隐丹参酮药效的影响。结果 隐丹参酮对K562细胞的生长有显著抑制作用,可引起细胞形态发生明显改变,诱导细胞发生凋亡,提高蛋白Bax/Bcl-2的比例,降低线粒体膜电位,促进Cyt C从线粒体释放到胞浆,增强促凋亡蛋白Caspase-3、Caspase-9和PARP的活性。环孢霉素A和cz-VAD-fmk均能减弱隐丹参酮抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡的作用。结论 隐丹参酮可显著诱导K562细胞凋亡,其机制与线粒体凋亡途径密切相关。     

苦参碱诱导人白血病耐药细胞K562/IM自噬和凋亡的研究

目的观察苦参碱对人白血病耐药细胞K562/IM自噬和凋亡的影响。方法 (1)苦参碱及伊马替尼对细胞增殖及自噬情况检测:分别设空白对照组、不同浓度(0.25、0.50、1.00、2.00、5.00mg/mL)苦参碱组和(0.05、0.25、0.50、5.00、20.00μmol/L)伊马替尼组,MTT检测K562细胞和K562/IM细胞抑制率。分别设置空白对照组、0.4 mg/mL苦参碱组和0.5μmol/L伊马替尼组,免疫荧光激光共聚焦检测K562细胞和K562/IM细胞自噬现象,Western Blot检测细胞中自噬标志蛋白Beclin-1、LC3-Ⅱ/Ⅰ、P62的表达。(2)苦参碱联合3-甲基腺嘌呤(3-MA)或雷帕霉素(rapamycin,Rapa)诱导K562/IM细胞自噬及凋亡情况变化的检测:实验分6组,空白对照组、苦参碱组(0.4mg/mL苦参碱处理)、3-MA组(5mmol/L 3-MA处理)、Rapa组(0.5μmol/L Rapa处理)、苦参碱+3-MA组(0.4mg/mL苦参碱+5mmol/L3-MA处理)、苦参碱+Rapa组(0.4mg/mL苦参碱+0.5μmol/L Rapa处理),采用MTT检测细胞的抑制率,流式细胞仪检测细胞凋亡水平;Western Blot检测细胞自噬标志蛋白Beclin-1、LC3-Ⅱ/Ⅰ、P62及凋亡相关蛋白Caspase-3表达。结果 (1)苦参碱和伊马替尼作用K562、K562/IM细胞,细胞增殖受抑制明显(P0.05),LC3-Ⅱ/Ⅰ的聚集明显增加,Beclin-1及LC3-Ⅱ/Ⅰ蛋白表达升高,P62蛋白表达减少(P0.05),以K562/IM细胞更明显(P0.05)。(2)苦参碱组K562/IM细胞增殖抑制率(36.32±2.21)%,凋亡率(15.35±0.39)%。苦参碱+3-MA组K562/IM细胞增殖抑制率升高[(65.25±2.06)%,P0.01)],凋亡率升高[(21.70±0.48)%,P0.05],同时Beclin-1及LC3-Ⅱ/Ⅰ蛋白表达下降,P62蛋白表达增强,Caspase-3表达增强(P0.05);而苦参碱+Rapa组作用则相反。结论苦参碱和伊马替尼均可抑制K562、K562/IM细胞增殖的同时可诱导自噬,以耐药K562/IM细胞株自噬明显。通过3-MA抑制自噬可增强苦参碱对细胞K562/IM作用的敏感性,而雷帕霉素减弱苦参碱作用。     

苦参碱联合伊马替尼对K562细胞红系分化的影响

目的探讨苦参碱联合伊马替尼对K562细胞红系分化的影响。方法分别用0.2 g/L苦参碱与0.2μmol/L伊马替尼单独或联合作用K562细胞48 h,观察联苯胺染色阳性细胞数,并利用RT-PCR检测转录因子GFi-1B表达。结果苦参碱可降低伊马替尼单独作用K562细胞的联苯胺染色阳性细胞数以及转录因子GFi-1B的表达。结论苦参碱联合伊马替尼作用K562细胞后对红系分化有一定抑制作用。     

苦参碱联合伊马替尼对K562细胞红系分化的影响

目的探讨苦参碱联合伊马替尼对K562细胞红系分化的影响。方法分别用0．2g／L苦参碱与0．2μmol／L伊马替尼单独或联合作用K562细胞48h，观察联苯胺染色阳性细胞数，并利用RT—PCR检测转录因子GFi-1B表达。结果苦参碱可降低伊马替尼单独作用K562细胞的联苯胺染色阳性细胞数以及转录因子GFi-1B的表达。结论苦参碱联合伊马替尼作用K562细胞后对红系分化有一定抑制作用。     

葡萄柚黄酮抑制白血病细胞株增殖的体外实验研究

目的研究葡萄柚黄酮组分(PTFC)对Kasumi-1、K562细胞株的生长抑制作用及诱导凋亡情况,从而为白血病的临床治疗提供实验基础。方法不同浓度的PTFC(0、0.125、0.25、0.5、1、2 mg/mL)作用于Kasumi-1、K562细胞株,采用MTT法检测PTFC对Kasumi-1、K562细胞株的生长抑制作用;AnnexinⅤ/PI流式细胞术检测PTFC诱导Kasumi-1、K562细胞株的凋亡情况;Hoechst 33258染色法观察PTFC诱导白血病细胞凋亡的形态学改变;Western Blot法检测PTFC作用后Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9、PARP蛋白表达变化。结果 0.125～2 mg/mL PTFC可明显抑制Kasumi-1、K562细胞株增殖,与空白对照组(PTFC 0 mg/mL)比较,细胞存活率明显降低(P0.05),对Kasumi-1的IC_(50)(24、48 h)分别为1.99、0.89 mg/mL,对K562的IC_(50)(24、48 h)分别为1.23、1.03 mg/mL;通过AnnexinⅤ/PI流式细胞术检测,0.125～2 mg/mL PTFC作用24 h可诱导Kasumi-1、K562细胞凋亡,诱导Kasumi-1凋亡率分别为2.98%、3.2%、3.66%、8.6%、19.8%,K562的凋亡率分别为3.19%、3.19%、3.49%、7.25%、16.87%;Hoechst 33258染色法检测发现PTFC作用后Kasumi-1、K562细胞中出现明显凋亡小体;与空白对照组比较,Caspase-3、Caspase-9、PARP被激活(P0.05)。结论 PTFC可抑制Kasumi-1、K562细胞增殖并诱导其凋亡,其凋亡相关机制与PARP、Caspase-3,Caspase-9蛋白表达变化相关。     

复方君子汤诱导白血病K562细胞凋亡的机制研究

目的本研究探讨复方君子汤(FFJZ)对抑制白血病K562细胞生长增殖和诱导凋亡的作用机制。方法用不同浓度复方君子汤作用于K562细胞,应用MTT法观察复方君子汤对K562细胞生长增殖的影响,Annexin V/PI染色和流式细胞仪(FCM)检测细胞凋亡,Western blot检测Caspase-8蛋白及Fas蛋白的表达。结果在一定浓度的复方君子汤作用后的K562细胞的增殖被抑制,随着浓度的增加及使用时间的延长,K562细胞的增殖抑制率及凋亡比例明显增加;同时,Caspase-8蛋白及Fas蛋白的表达明显上升。结论一定浓度的复方君子汤可抑制K562细胞增殖并诱导其凋亡,其机制可能与上调Caspase-8蛋白及Fas蛋白的表达有关。     

小檗胺对多药耐药K562/Adr细胞作用的研究

目的研究小檗胺诱导人白血病K562／Adr细胞凋亡及逆转多药耐药的作用及机理。方法采用MTT法测IC50值,流式细胞仪Annexin V FITC-PI法检测细胞凋亡发生率,PI染色法检测凋亡峰及细胞周期,同时以FCM检测Caspase-3、P-GP蛋白表达及细胞内药物积聚能力,RT-PCR法检测mdr-1基因表达。结果小檗胺能抑制人白血病K562／Adr细胞生长且呈剂量依赖关系,并能诱导细胞凋亡,使Caspase-3蛋白表达及细胞药物外排能力增加,同时降低mdr-1基因mRNA和蛋白表达水平。结论小檗胺能激活Caspase-3以诱导人白血病K562／Adr细胞凋亡,同时能通过降低mdr-1表达逆转多药耐药。     

益气养阴解毒方对K562/A02裸鼠移植瘤逆转作用研究

目的:研究益气养阴解毒方对K562/A02多药耐药移植瘤的逆转作用。方法:建立K562/A02裸鼠移植瘤多药耐药模型;选用维拉帕米作阳性对照,用流式细胞仪(FCM)检测各组移植瘤耐药细胞P糖蛋白(P-gp)与bcl-2的表达情况和移植瘤细胞内注射用盐酸多柔比星(ADM)蓄积浓度及移植瘤耐药细胞的凋亡情况。结果:移植瘤P-gp表达与维拉帕米组相比,生理盐水组与中药小剂量组有差异(P<0.05);bcl-2的表达与维拉帕米组相比,中药大剂量组有差异(P<0.05);益气养阴解毒方能使移植瘤耐药细胞内ADM的浓度升高。结论:益气养阴解毒方具有部份逆转白血病K562/A02移植瘤多药耐药性的作用,其逆转移植瘤裸鼠多药耐药性的机制不是通过下调肿瘤细胞膜上P-gp的表达实现的,而与降低bcl-2的表达、促进耐药细胞凋亡有关。     

人参皂苷Rh_2通过激活p38诱导K562细胞自噬凋亡的实验研究

为了研究人参皂苷Rh2对人白血病细胞K562的凋亡作用,并从自噬角度来探讨其机制。实验采用CCK-8方法检测人参皂苷单体Rh2对人白血病K562细胞增殖抑制作用;流式细胞术检测细胞凋亡;Hoechest染色观察细胞核染色质的形态;吖啶橙和MDC染色观察Rh2对细胞自噬的影响;Western blot和RT-PCR检测Rh2对白血病细胞自噬重要基因的表达的影响;运用自噬抑制剂(3-MA)研究自噬对细胞增殖和凋亡的影响。CCK-8显示人参皂苷Rh2在低浓度时能有效抑制白血病细胞增殖,且其抑制作用具有浓度和时间依赖性;FCM和Hoechest显示Rh2能增加细胞的凋亡和染色质呈凋亡形态改变;吖啶橙和MDC染色发现Rh2组细胞的绿色荧光增强,并出现大量酸性自噬小泡;Western blot和RT-PCR结果发现Rh2能上调Beclin-1,LC3A,LC3B,激活型Caspase-3和p-p38的表达;运用细胞自噬剂(3-MA)会削弱Rh2对K562的增殖抑制和促凋亡作用。人参皂苷Rh2可能通过激活磷酸化的p38,诱导细胞自噬途径,从而抑制K562细胞增殖和促进凋亡作用。     

Cariporide降低K562/DOX细胞株表达P-糖蛋白而逆转耐药的影响

 目的 探讨cariporide对耐药细胞株K562/DOX中P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）的影响，为抗白血病多药耐药（multidrug resistance, MDR）提供新方法。方法 应用cariporide对细胞进行酸化，应用激光共聚焦显微镜测定野生型细胞系K562及耐药细胞株K562/DOX细胞内pH值及细胞酸化对K562和K562/DOX细胞内阿霉素累积的影响。采用MTT法观察细胞酸化对细胞活力的影响。应用流式细胞术检测细胞酸化对K562/DOX细胞中P-gp功能的影响。采用实时定量RT-PCR技术检测MDR1基因在mRNA表达水平的变化。结果 Cariporide处理3 h对K562及K562/DOX细胞的活力影响较小。在K562/DOX细胞中，P-gp的外排药物能力随细胞内pH值的降低而减弱，cariporide明显增加了细胞对罗丹明123（rhodaminel 123，Rh123）和阿霉素的累积。细胞酸化还在mRNA水平抑制了K562/DOX细胞中P-gp的表达。结论 Cariporide能够抑制K562/DOX耐药细胞株中MDR1基因表达和P-gp的功能。     

MAPK信号转导通路在人参多糖诱导白血病K562细胞凋亡中的作用

目的 探讨人参多糖诱导白血病K562细胞凋亡的机制.方法 将对数生长期K562细胞分成对照组和人参多糖组,对照组细胞常规培养,人参多糖组细胞培养体系中加入人参多糖0.4 g/L.各组细胞培养48 h后,流式细胞术和Hoechst33258染色法检测K562细胞凋亡情况;RT-PCR检测细胞p38、JNK基因表达;采用免疫荧光实验检测细胞中p-p38、p-JNK蛋白表达,测定Caspase-3的活性;Western blotting检测细胞中p38、JNK、p-p38、p-JNK、cleaved Caspase-3蛋白的变化.结果 与对照组比较,人参多糖组K562细胞凋亡率显著增加(P＜0.05),出现明显的细胞核固缩现象,K562细胞p38 mRNA与JNK mRNA明显增多.免疫荧光检测显示,p-p38、p-JNK、cleaved Caspase-3表达明显增强且向胞核转移;Western blotting检测显示,人参多糖组K562细胞p38、JNK总蛋白无明显变化(P＞0.05); p-p38、p-JNK、cleaved Caspase-3有增加的趋势(P＜0.05).结论 人参多糖能促进K562细胞凋亡,其作用可能是通过影响MAPK信号传导通路实现的.     

硒化壳聚糖逆转K562/ADM细胞多药耐药的实验研究

目的:研究硒化壳聚糖对人慢性粒细胞白血病耐阿霉素细胞株( K562/ADM) mdr-1基因/P-糖蛋白(P-gp)表达及功能的影响,为逆转肿瘤多药耐药提供新的途径.方法:硒化壳聚糖100,200 mg·L-1作用K562/ADM细胞24 h,应用RTPCR法和免疫印迹法检测mdr-1/P-gp表达的改变;应用高效液相色谱法检测细胞内阿霉素积聚浓度;应用MTT法检测阿霉素对K562/ADM细胞增殖的影响.结果:硒化壳聚糖可增强K562/ADM细胞对阿霉素的敏感性,增加细胞内阿霉素集聚浓度,200 mg·L-1硒化壳聚糖作用效果显著强于100 mg·L-1硒化壳聚糖(P＜0.01);硒化壳聚糖能明显抑制K562/ADM细胞mdr-1/P-gp的表达(P＜0.01),100 mg·L-1硒化壳聚糖可使mdr-1/P-gp表达分别下降(40.87 -3.19)％和(35.08±0.09)％,200 mg·L-1硒化壳聚糖可使mdr-1/P-gp表达分别下降(78.24±3.42)％和(79.61±0.23)％.结论:硒化壳聚糖可明显抑制K562/ADM细胞mdr-1/P-gp表达,增加细胞内阿霉素含量,恢复细胞对化疗药物敏感性,逆转mdr-1编码蛋白P-gp介导的多药耐药.     

萝卜硫素诱导白血病细胞K562凋亡及其与化疗药协同作用的实验研究

目的:探讨萝卜硫素诱导K562白血病细胞作用及其与化疗药的协同作用。方法:琼脂半固体集落培养法和MTT法检测不同浓度的萝卜硫素对K562细胞增殖的影响;倒置显微镜观察萝卜硫素对细胞形态的影响,Annexin V-FITC/PI双标记法检测细胞凋亡情况;Western blot检测凋亡调控蛋白PARP的活性;观察萝卜硫素分别和高三尖杉酯碱、阿糖胞苷联合的抑瘤作用,用药物相互作用指数评价药物协同作用。结果:萝卜硫素能够抑制白血病K562的增殖,呈剂量依赖性;萝卜硫素引起了K562细胞形态的明显改变,显著提高了细胞的早期凋亡率,增加了促凋亡蛋白PARP的表达水平;萝卜硫素与化疗药物高三尖杉酯碱和阿糖胞苷存在明显的协同作用,其协同系数分别为0.64和0.66。结论:萝卜硫素可以诱导K562细胞发生凋亡,增加化疗药物的敏感性,具有良好的临床应用前景。     

瘀毒清诱导慢性粒细胞白血病K562细胞株凋亡的研究

目的探讨瘀毒清对诱导慢性粒细胞白血病K562细胞株凋亡的作用。方法采用血清药理学方法,取慢性粒细胞白血病K562细胞株悬液分组,分别加入不含药血清（空白对照组）、含伊马替尼血清、含高剂量瘀毒清血清、中剂量瘀毒清血清、低剂量瘀毒清血清、含伊马替尼加高、中、低剂量瘀毒清血清,不加血清作为正常对照组。分别于干预后第12h、24h、48h和72h通过ArmexinV／PI双染法、流式细胞仪检测不同时间、不同药物组的细胞凋亡率。结果正常对照组的原代细胞有较低凋亡率,而空白对照组K562细胞的凋亡率更低,二者比较差异有统计学意义（P〈0．05）。12h、24h内瘀毒清含药血清低、中、高组凋亡率与正常对照组、空白对照组比较存在统计学差异（P〈O．05）。药物组间相互比较亦有显著差异,并呈一定的时间剂量依赖性。瘀毒清高剂量组72h未见凋亡率（31．48±6．58）进一步升高,与48h比较无统计学差异,与瘀毒清中剂量组72h的诱导凋亡率（27．54±5．89）比较也无统计学差异（P〉0．05）。伊马替尼组12h开始即显示较高的凋亡率（23．80±6．94）,与空白对照组细胞的凋亡率相比有统计学差异（P〈0．05）。伊马替尼加瘀毒清各剂量组72h的凋亡率与伊马替尼组、瘀毒清低、中、高组的凋亡率比较均有明显差异（P〈0．05）。结论含瘀毒清血清对体外K562细胞有诱导凋亡作用,其作用呈一定时间、剂量依赖关系：瘀毒清与伊马替尼联合使用有增效作用。     

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??OBJECTIVE To investigate the protection of hepatocyte growth factor (HGF) on CML cell line K562 from apoptosis induced by etoposide (VP-16) and its molecular mechanism. METHODS Quantitative and qualitative analyses on cell morphological change of apoptosis were performed through acridine orange (AO) staining and HE staining, and fluorescent flow cytometry.The test analyzes membrane on the surface of the PS evagination and integrity of cell membrane surface and mitochondrial membrane potential changes were performed through Annexin V-FITC/PI double dyeing and JC-1 cell dyeing tests, and apoptotic factors such as Bcl-2, Bax, Caspase-3 and Caspase-9 were measured by SYBR Green (Takara) qRT-PCR. RESULTS The HE and AO staining revealed that apoptotic rates in HGF+VP-16 groups were significantly lower than those in VP-16 groups (P<0.05,P<0.05), HGF can inhibit the apoptosis of cells induced by VP-16; FCM (Annexin V-FITC/ PI and JC-1) tests showed that cells apoptotic rates in HGF+VP-16 groups were significantly lower than those in VP-16 groups (P<0.05,P<0.001), indicating that HGF has the anti-apoptosis function. Apoptosis related gene mRNA expression tests found that the Bcl-2 mRNA expression in HGF+VP group was obviously higher than that in the VP-16 group (P<0.001), while Bax mRNA, Caspase-3 mRNA, and Caspase-9 mRNA expressions were significantly lower than those in the VP-16 group (P<0.05, P<0.001, P<0.001),suggesting that HGF possesses antiapoptotic effect through inhibiting apoptosis gene expression and promoting the antiapoptotic gene expression simultaneously. CONCLUSION HGF can significantly protect K562 cells from apoptosis induced by VP-16 through the HGF/c-Met way to regulate PI3K/AKT pathway.