三七皂苷对TGF-β1诱导的大鼠肾小管上皮细胞EMT的影响

目的:研究三七皂苷(PNS)对转化生长因子-β_1(TGF-β_1)诱导的大鼠肾小管细胞上皮-间充质转化(EMT)的干预作用,并从沉默信息调节因子2相关酶1(SIRT1)/TGF-β_1/Smad通路分析其可能机制。方法:在DMEM培养基中,用10%胎牛血清培养大鼠肾小管上皮细胞(NRK-52E),分为正常组,TGF-β_1组(5μg·L~(-1)),白藜芦醇组(50 mg·L~(-1)),SIRT1阻断剂EX527组(10μmol·L~(-1)),PNS组(100 mg·L~(-1)),EX527+PNS组(EX527 10μmol·L~(-1),PNS 100 mg·L~(-1)),48 h后收集细胞;采用实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测SIRT1,α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA),E-钙黏附蛋白(E-cadherin),TGF-β_1,Smad3,Smad4 mRNA表达;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测SIRT1,α-SMA,E-cadherin,TGF-β_1蛋白表达。结果:与正常组比较,TGF-β_1组α-SMA mRNA及蛋白表达明显增多(P 0. 05),E-cadherin表达显著减少(P 0. 01);与TGF-β_1组比较,PNS,白藜芦醇组,E-cadherin mRNA及蛋白表达均显著增加(P 0. 01),α-SMA表达显著减少(P 0. 01),EMT发生被抑制,同时,SIRT1表达显著增加(P 0. 01),TGF-β_1,Smad3,Smad4表达显著降低(P 0. 01)。在SIRT1阻断剂EX527的干预下,PNS则不能发挥明显抑制作用。结论:PNS可以阻止TGF-β_1诱导的肾小管上皮细胞EMT的发生,其机制可能是通过激活SIRT1进而抑制TGF-β_1/Smad通路实现的。     

鳖甲煎丸通过TGF-β/Smad信号通路抑制DEN诱导肝癌大鼠上皮间质转化的机制

目的:通过研究鳖甲煎丸对二乙基亚硝胺(DEN)诱导肝癌模型大鼠中转化生长因子-β(TGF-β)/Smad通路信号分子及下游靶基因的影响,探讨鳖甲煎丸抗肝癌侵袭转移的分子机制。方法:大鼠分为正常组、模型组、鳖甲煎丸组(2.2 g·kg-1·d-1),对模型组及鳖甲煎丸组大鼠使用DEN进行腹腔注射,诱导大鼠肝脏发生肝炎-肝硬化-癌变病理改变,鳖甲煎丸组在肝硬化阶段给予鳖甲煎丸连续灌胃6周,收集血清及肝脏标本。采用试剂盒检测大鼠血清丙氨酸氨基转移酶(ALT),天门冬氨酸氨基转移酶(AST),总胆红素(TBIL),白蛋白(Alb),γ-谷氨酰转肽酶(GGT),碱性磷酸酶(ALP);苏木素-伊红(HE)染色观察大鼠肝脏病变;实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测转化生长因子(TGF)-β1的mRNA转录水平;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测TGF-β/Smad通路中TGF-β1,Smad2/3,磷酸化Smad2/3及上皮间质转化标志物N-钙黏蛋白(N-cadherin),E-钙黏蛋白(E-cadherin)和波形蛋白(Vimentin)的蛋白表达水平。结果:鳖甲煎丸组与模型组之间肝功能指标差异均无统计学意义。与模型组比较,鳖甲煎丸能改善大鼠肝癌组织中细胞呈气球样变性、水肿、凝固性坏死的病理变化,降低肝癌组织中TGF-β1mRNA转录及蛋白表达水平(P0.01),下调磷酸化Smad2蛋白表达水平(P0.01),同时下调下游靶基因蛋白N-cadherin,Vimentin蛋白表达水平(P0.01)。结论:鳖甲煎丸可能通过减少肝癌组织中TGF-β1的表达水平,抑制由TGF-β/Smad通路激活介导的肝癌细胞上皮间质转化(EMT),从而达到抗肝细胞癌转移侵袭的作用。     

基于TGF-β/smad信号通路探讨七方胃痛颗粒对人胃腺癌AGS细胞上皮间质转化过程的影响＊

目的 探究七方胃痛颗粒对转化生长因子-β1（TGF-β1）诱导人胃腺癌细胞AGS上皮间质转化（Epithelial-mesenchymal transition， EMT）过程的影响及其潜在分子机制。方法 为了探究七方胃痛颗粒对TGF-β1处理的AGS细胞增殖、迁移和侵袭的影响，实验分为四组：AGS细胞对照组，EMT空白模型组，中药血清组，TGF-β/smad通路抑制剂组，分别利用CCK8、细胞划痕实验和Transwell实验检测细胞增殖、迁移和侵袭能力。此外，通过免疫荧光检测EMT过程中相关蛋白（E-cadherin、N-cadherin、14-3-3ζ、Smad2和p-Smad2/3）的表达水平。结果 与AGS细胞对照组相比，TGF-β1诱导EMT过程，显著促进AGS细胞增殖、迁移和侵袭，下调了E-cadherin的表达，上调了N-cadherin、14-3-3ζ、Smad2和p-Smad2/3的表达；与EMT空白模型组相比，中药血清组、TGF-β/smad通路抑制剂组显著抑制了细胞增殖、迁移和侵袭，上调了E-cadherin的表达，降低了N-cadherin、14-3-3ζ、Smad2和p-Smad2/3的表达。结论 七方胃痛颗粒通过调控TGF-β/smad信号通路从而抑制人胃腺癌AGS细胞的EMT过程。     

补肺益肾方对TGF-β1/BMP-4诱导的肺血管平滑肌细胞TGF-β1/Smad信号通路的影响

目的:探讨补肺益肾方对转化生长因子-β1(TGF-β1)/骨形成蛋白-4(BMP-4)诱导的肺血管平滑肌细胞增殖及TGF-β1/Smad信号传导的影响,并探讨其相关的作用机制。方法:应用TGF-β1/BMP-4诱导人肺动脉平滑肌细胞增殖。细胞分为正常组(10%正常大鼠血清),诱导增殖组(含7.5μg·L-1TGF-β1与5.0μg·L-1BMP-4的10%正常大鼠血清),4%补肺益肾方含药血清(含7.5μg·L-1TGF-β1与5.0μg·L-1BMP-4,6%正常大鼠血清及4%补肺益肾大鼠血清),6%补肺益肾方含药血清(含7.5μg·L-1TGF-β1与5.0μg·L-1BMP-4,4%正常大鼠血清及6%补肺益肾大鼠血清)及8%补肺益肾方含药血清组(含7.5μg·L-1TGF-β1与5.0μg·L-1BMP-4,2%正常大鼠血清及8%补肺益肾大鼠血清)。24 h后,显微镜下观察细胞的密度,5-溴脱氧尿嘧啶核苷(5-bromo-2-deoxyuridine,Brd U)法检测细胞增殖,蛋白免疫印迹法(Western blot)检测Smad1,2,3和5以及p-Smad2/3蛋白表达,实时荧光定量聚合酶链式反应法(Real-time PCR)检测纤溶酶原激活物抑制物-1(PAI-1),结缔组织生长因子(CTGF),分化抑制因子-1(ID-1)和ID-2 mRNA的表达。结果:TGF-β1/BMP-4作用24 h后,细胞密度增加、细胞增殖率显著增加(P0.05),补肺益肾方抑制TGF-β1/BMP-4诱导的细胞增殖,显示出浓度依赖性,其中8%浓度显著抑制细胞增殖(P0.01)。TGF-β1/BMP-4及补肺益肾方均不影响Smad1,2,3和5蛋白的表达;但TGF-β1/BMP-4诱导p-Smad2/3的表达(P0.05),8%补肺益肾方显著抑制TGF-β1/BMP-4诱导的p-Smad2/3表达(P0.05)。TGF-β1/Smad2通路的下游效应基因的检测发现,TGF-β1/BMP-4及补肺益肾方均不影响PAI-1,ID-1和ID-2 mRNA的表达;但TGF-β1/BMP-4诱导后,CTGF mRNA表达水平的显著增加(P0.01),8%补肺益肾方抑制TGF-β1/BMP-4诱导的CTGF mRNA的表达(P0.05)。结论:补肺益肾方抑制TGF-β1与BMP-4合用诱导的肺动脉平滑肌细胞的增殖,抑制p-Smad2/3/CTGF通路的活化是可能的作用途径。     

氧化苦参碱对TGF-β1诱导心肌细胞损伤的保护作用

目的:探讨氧化苦参碱(OMT)对转化生长因子-β_1(TGF-β_1)诱导的新生SD乳鼠心肌细胞损伤的保护作用及机制。方法:胰酶消化差速贴壁法分离纯化SD乳鼠原代心肌细胞。实验分为4组,包括正常组,模型组[转化生长因子-β_1(TGF-β_1),20×10-5g·L~(-1)],OMT高剂量组(TGF-β_1+0.1 g·L~(-1)OMT),OMT低剂量组(TGF-β_1+0.05 g·L~(-1)OMT)。OMT预保护2 h后,采用TGF-β_1孵育48 h建立心肌细胞损伤模型。利用噻唑蓝(MTT)法检测细胞存活率,生化法检测乳酸脱氢酶(LDH)外漏量,蛋白质免疫印迹法(Western blot)检测p38,细胞外信号调节蛋白激酶(ERK),c-Jun氨基末端激酶(JNK)蛋白的表达水平。结果:TGF-β_1显著引起心肌细胞损伤,OMT(0.1,0.05 g·L~(-1))能够抑制TGF-β_1诱导的心肌细胞存活率下降及LDH外漏量增加。OMT高剂量组(0.1 g·L~(-1))可下调TGF-β_1诱导的心肌细胞p-p38,p-ERK1/2,p-JNK的蛋白表达,但对p38,JNK,ERK1/2总蛋白表达无影响。结论:OMT对TGF-β_1诱导的心肌细胞损伤具有保护作用,其机制与其抑制p38,ERK1/2,JNK蛋白的磷酸化有关。     

化痰通瘀解毒方水提取物通过Wnt/β-catenin信号通路抑制人胃癌细胞株MKN-45上皮-间质转化及侵袭迁移

目的:观察化痰通瘀解毒方对人胃癌细胞MKN-45侵袭迁移能力和上皮-间质转化(Epithelial-mesenchymal transformation,EMT)的影响,并探讨其与Wnt/β-catenin信号通路的相关性。方法:以转化生长因子-β1(Transforming growth factor-β1,TGF-β1) 10 ng/m L诱导MKN-45细胞构建EMT模型;采用Transwell小室实验和划痕愈合实验检测细胞的侵袭、迁移能力;采用Western Blot法检测EMT标志蛋白E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、Snail和Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白表达水平。结果:TGF-β1能够明显增强MKN-45细胞侵袭、迁移能力,诱导MKN-45细胞发生EMT:E-cadherin蛋白表达下调,N-cadherin、Vimentin和Snail蛋白表达上调;同时,TGF-β1能诱导MKN-45细胞Wnt1和β-catenin蛋白表达上调。化痰通瘀解毒方(10、20、40μg/m L)均可显著抑制TGF-β1诱导的MKN-45细胞侵袭迁移及EMT:E-cadherin蛋白表达上调,N-cadherin、Vimentin和Snail蛋白表达下调;同时,化痰通瘀解毒方(10、20、40μg/m L)还可下调Wnt1和β-catenin蛋白表达,且上述结果中化痰通瘀解毒方在10、20、40μg/m L剂量组间存在剂量依赖性; Wnt/β-catenin信号通路特异性抑制剂XAV939与化痰通瘀解毒方40μg/m L均可明显抑制TGF-β1诱导的MKN-45细胞EMT和侵袭迁移,且XAV939可协同化痰通瘀解毒方40μg/m L抑制TGF-β1诱导的EMT和侵袭迁移。结论:化痰通瘀解毒方能通过Wnt/β-catenin信号通路抑制TGF-β1诱导的EMT,进而降低MKN-45细胞侵袭迁移能力。     

艳山姜挥发油对TGF-β1诱导人脐静脉内皮细胞间质转分化的保护作用

目的:研究艳山姜挥发油(EOFAZ)对转化生长因子-β_1(TGF-β_1)诱导人脐静脉内皮细胞(HUVECs)间质转分化的干预保护作用。方法:采用TGF-β_1(10μg·L~(-1),孵育48 h)诱导建立内皮-间质转化(End MT)细胞模型。实验分组为正常组,模型组(10μg·L~(-1)TGF-β_1),EOFAZ高剂量组(10μg·L~(-1)TGF-β_1+4μg·L~(-1)EOFAZ)及EOFAZ低剂量组(10μg·L~(-1)TGF-β_1+2μg·L~(-1)EOFAZ)。EOFAZ于造模前干预给药2 h,加入TGF-β_1共孵育复制End MT细胞模型。倒置显微镜下观察细胞形态,划痕实验分析细胞迁移能力,蛋白免疫印迹法(Western blot)检测EOFAZ对内皮细胞特异性标志物血管内皮细胞钙粘素(VE-cadherin),间充质细胞特异性标志物α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA),锌指转录因子(Snail)及核转录因子-κB(NF-κB)p-p65蛋白表达的影响。结果:TGF-β_1诱导孵育后,细胞形态多呈长梭形,并可见明显的细胞丝状伪足,细胞间的紧密连接减少;划痕实验结果表明模型组细胞迁移能力增强(P0.01);VE-cadherin蛋白表达显著减少(P0.01),α-SMA,Snail,NF-κB p-p65蛋白表达量明显增多(P0.01)。EOFAZ高、低剂量组干预给药后,能够明显抑制TGF-β_1诱导的细胞迁移能力(P0.01),同时能增加VE-cadherin的表达,降低α-SMA,Snail及NF-κB p-p65蛋白的表达。结论:艳山姜挥发油对TGF-β_1诱导的HUVECs间质转分化具有干预保护作用,其机制与抑制NF-κB p65的磷酸化激活有关。     

益气除痰方干预TGF-β信号途径逆转A549细胞上皮间质转化研究

目的:观察益气除痰方是否能通过干预TGF-β信号途径,逆转肺癌A549细胞上皮间质转化(EMT)。方法:通过暴露于TGF-β_1环境中,诱导肺腺癌细胞株A549发生EMT,并以益气除痰方含药血清进行干预,相差显微镜下观察各组细胞形态变化;划痕实验、Transwell实验检测各组细胞迁移及侵袭能力;Western-blot检测各组细胞EMT相关蛋白及TGF-β信号通路蛋白Smad2/3的表达。结果:镜下可见经TGF-β_1孵育的A549细胞呈现明显的间质细胞形态,益气除痰方含药血清作用24 h后细胞A549细胞出现凋亡且间质化程度较低;划痕实验结果显示:与空白血清组比较,TGF-β_1+空白血清组A549细胞迁移及侵袭能力显著升高,益气除痰方可降低TGF-β_1所升高的细胞迁移及侵袭能力;Western-blot检测显示TGF-β_1可以激活Smad2/3通路下调E-cadherin的表达,上调Vimentin的表达,而益气除痰方含药血清可抑制该过程。结论:益气除痰方可能通过干预TGF-β/Smad信号通路上调E-cadherin表达,下调Vimentin表达,从而逆转肺癌A549细胞上皮间质转化,抑制肿瘤细胞的侵袭迁移。     

当归-红芪超滤膜提取物对糖尿病肾病大鼠肾组织TGF-β1表达的影响

目的:研究当归-红芪超滤膜提取物对糖尿病肾病(DN)大鼠肾组织转化生长因子-β_1(TGF-β_1),Smad信号通路的调控作用,探讨其对DN大鼠的作用及产生该作用可能的机制。方法:采用一次性大剂量(60 mg·kg-1)腹腔注射链脲佐菌素(STZ)诱导建立DN大鼠模型。将DN大鼠随机分为正常组、模型组、厄贝沙坦组及当归-红芪超滤膜提取物低、中、高剂量组,之后开始灌胃给药,每天1次,8周后测空腹血糖(FBG),尿素氮(BUN),血肌酐(SCr),24 h尿蛋白;光镜观察肾组织结构变化;酶联免疫吸附测定(ELISA)检测大鼠TGF-β_1,Smad2/3含量;免疫组化法检测肾组织TGF-β_1,Smad2/3蛋白的表达;实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)法检测肾组织TGF-β_1,Smad2/3的mRNA表达。结果:与正常组比较,模型组大鼠FBG,BUN,SCr,24 h尿蛋白水平明显升高,ELISA检测大鼠TGF-β_1,Smad2/3含量明显升高,肾组织病理结构异常较为明显,TGF-β_1,Smad2/3蛋白量表达明显升高(P0.05,P0.01);与模型组比较,当归-红芪超滤膜提取物各组均不同程度降低了DN大鼠FBG,BUN,SCr,24 h尿蛋白水平(P0.05);ELISA检测大鼠TGF-β_1,Smad2/3含量降低(P0.05),肾组织病理结构异常得到改善,TGF-β_1,Smad2/3蛋白量表达减少(P0.05,P0.01),TGF-β_1,Smad2/3 mRNA表达减少(P0.05,P0.01)。结论:当归-红芪超滤膜提取物可改善DN大鼠肾功能病变,延缓DN慢性病理进展,其机制可能与其抑制TGF-β_1/Smad信号通路有关。     

柔肝方含药血清对TGF-β1 诱导人肝星状细胞表达骨桥蛋白的影响及其机制

目的:研究柔肝方含药血清对转化生长因子β1(TGF-β1)诱导人肝星状细胞表达骨桥蛋白(osteopontin,OPN)的影响及其作用机制。方法:30只SD大鼠,随机分成正常组、柔肝方低剂量(9 g·kg-1)给药3 d及5 d组、柔肝方高剂量(18 g·kg-1)给药3 d及5 d组,每组6只,按10 m L·kg-1·d-1灌服饮用水或柔肝方药液,制备含药血清。用含10%正常血清或含药血清的DMEM培养基体外培养LX-2人肝星状细胞株,MTT法检测细胞增殖;LX-2细胞经含10%正常血清或含药血清的培养基预处理24 h,再予TGF-β1(终质量浓度10μg·L-1)刺激24 h,收集细胞,RT-PCR法检测OPN mRNA表达,Western blot法检测OPN及磷酸化蛋白激酶B(p-protein kinase B,p-PKB)蛋白表达。结果:与正常组比较,各含药血清组均能抑制LX-2细胞增殖(P0.05,P0.01);予含药血清预处理再经TGF-β1刺激的细胞,与正常组细胞比较,OPN mRNA,OPN和p-PKB蛋白表达明显下调(P0.05,P0.01)。结论:柔肝方含药血清对TGF-β1诱导的人肝星状细胞表达OPN具有抑制作用,其机制可能与抑制PI3K/PKB信号通路活化有关。     

复方苦参注射液对放射性肺损伤的肺保护作用

目的:观察复方苦参注射液对放射性肺损伤模型模型小鼠转化生长因子-β_1(TGF-β_1),Smad3蛋白(Smad3),糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β),β-连环蛋白(β-catenin)表达的影响,并探讨其作用机制。方法:使用美国XStrahl小动物精准放疗辐照研究平台(SARRP),实施单次20 Gy双侧肺野照射建立放射性肺损伤小鼠模型,将32只小鼠随机分为正常组、模型组、复方苦参注射液组(5 g·kg~(-1)),地塞米松注射液组(0.5 mg·kg~(-1))。正常组和模型组给予等体积0.9%氯化钠溶液,连续腹腔注射4周。苏木素-伊红(HE)染色观察肺组织病理;免疫组化(IHC)检测小鼠肺组织E-钙粘蛋白(E-cadheren),波形蛋白(Vimentin)表达;实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测组小鼠肺组织中TGF-β_1,Smad3,GSK-3β和β-catenin mRNA的表达;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测组小鼠肺组织中TGF-β_1,Smad3,GSK-3β和β-catenin通道蛋白的表达。结果:与正常组比较,模型组小鼠肺系数显著升高(P0.01),且小鼠肺脏出现炎症细胞浸润,肺间质水肿、充血,肺泡结构破坏,部分肺泡萎缩。与模型组比较,复方苦参注射液组小鼠肺脏炎症细胞浸润及肺间质病变减轻,小鼠肺组织E-cadheren的水平显著升高(P0.01),小鼠肺组织Vimentin的水平显著降低(P0.01),TGF-β_1,Smad3,GSK-3β和β-catenin表达水平显著降低(P0.01)。与地塞米松注射液组比较,复方苦参注射液小鼠肺部病理形态学改变相仿,E-cadheren,Vimentin,TGF-β_1,Smad3,GSK-3β和β-catenin表达水平未见明显差异。结论:复方苦参注射液能够改善放射性肺损伤模型小鼠肺纤维化,其机制可能与抑制上皮间质转化(EMT)相关的TGF-β_1,Smad3,GSK-3β和β-catenin mRNA及通道蛋白表达,进而促进E-cadheren表达、抑制Vimentin蛋白表达,最终抑制EMT的发生有关。     

薯蓣丸联合紫杉醇抑制三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231上皮间质转化作用和机制研究

目的:探究薯蓣丸联合紫杉醇抑制人三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞上皮间质转化(EMT)的作用和机制。方法:运用血清药理学方法制备SD大鼠空白血清和薯蓣丸含药血清,体外培养MDA-MB-231细胞。实验将其分组为空白组、紫杉醇组、薯蓣丸联合紫杉醇组三组。运用CCK8实验检测MDA-MB-231细胞的增殖情况;Transwell小室实验法检测细胞的侵袭、迁移能力变化;Western blot检测上皮间质转化相关分子标志物E-cadherin、Vimentin、N-cadherin、MMP2和PI3K/Akt/mTOR信号通路相关蛋白的表达;RT-qPCR检测E-cadherin、Vimentin、N-cadherin、MMP2 mRNA的表达。结果:与空白组相比,紫杉醇组和薯蓣丸联合紫杉醇组可显著抑制细胞的增殖、侵袭和迁移(P<0.01);与紫杉醇组相比,薯蓣丸联合紫杉醇组对细胞增殖、侵袭和迁移的抑制能力增强(P<0.01)。与空白组相比,紫杉醇组和薯蓣丸联合紫杉醇组细胞中E-cadherin蛋白表达上调,PI3K、Akt、mTOR、N-cadherin、Vimentin蛋...     

肝乐颗粒对肝纤维化大鼠TGF-β1/Smad信号通路的调控作用

目的:明确肝乐颗粒对转化生长因子(TGF)-β_1/Smad信号通路的干预作用,探讨其防治肝纤维化的分子学机制。方法:SD大鼠随机分为正常组,模型组,肝乐颗粒(1.5,3.0,6.0 g·kg~(-1))和秋水仙碱(1.0×10~(-4)g·kg~(-1))。采用50%四氯化碳每周2次,连续12周皮下注射的方法,诱导肝纤维化大鼠模型。造模第7周起,给药组分别灌胃给予相应剂量的肝乐颗粒和秋水仙碱,每天1次,连续6周。末次给药8 h后,处置大鼠,取固定部位肝脏组织,苏木素-伊红(HE)和马松(Masson)染色观察肝脏病理组织学损伤程度,免疫组化和蛋白质免疫印迹(Western blot)检测肝组织中Ⅰ型胶原(CollagenⅠ),Smad2,TGF-β_1或TGF-βI型受体(TβRⅠ)蛋白的表达,实时定量荧光PCR(Real-time PCR)检测肝组织中CollagenⅠ,Smad2,TGF-β_1mRNA的表达。结果:与正常组比较,模型组大鼠肝纤维化损伤程度,肝组织中CollagenⅠ,TGF-β_1,Smad2,TβRⅠ蛋白及mRNA的表达明显增加(P0.01);与模型组比较,肝乐颗粒中、高剂量组不仅可减轻肝组织病理损伤程度,减少胶原沉积,还可显著降低CollagenⅠ,TGF-β_1,Smad2,TβRⅠ蛋白及mRNA的表达(P0.05,P0.01)。结论:肝乐颗粒对肝纤维化大鼠具有一定的保护作用,其机制可能与调控TGF-β_1/Smad信号通路,从而抑制HSC活化,减少细胞外基质过度沉积有关。     

常春藤皂苷元对肠癌SW480细胞上皮-间质转化(EMT)及侵袭的影响

目的:探讨常春藤皂苷元(HG)通过调控上皮-间质转化(EMT)途径抑制大肠癌侵袭转移的机制。方法:以肠癌细胞SW480细胞为研究对象,不同质量浓度HG干预转化生长因子-β1(TGF-β1)诱导的SW480细胞,作用24 h后噻唑蓝(MTT)法检测细胞增殖能力。转移小室(Transwell)实验检测细胞侵袭能力。实时荧光定量-聚合酶链式反应(q PCR)和蛋白质免疫印迹(Western blot)法分别检测EMT标志物E-钙黏蛋白(E-cadherin),N-钙黏蛋白(N-cadherin),波形蛋白(Vimentin),蜗牛同源物1(果蝇)样1蛋白(Snail)及侵袭转移标志分子信号传导蛋白和转录激活物(STAT3),基质金属蛋白酶-9(MMP-9),MMP~(-1)4,伴有Kazal域的富含半胱氨酸的逆转诱导蛋白(RECK)表达变化。结果:HG可抑制TGF-β1诱导的肠癌SW480细胞增殖、干预EMT和降低侵袭能力,降低EMT标志分子N-cadherin,Vimentin,Snail及侵袭转移标志分子STAT3,MMP-9,MMP~(-1)4表达,增强E-cadherin,RECK的表达,与TGF-β1组比较均具有统计学差异(P0.05)。结论:HG可通过抑制EMT途径影响大肠癌细胞SW480侵袭转移。     

抗纤灵方对肾纤维化大鼠TGF-β1/Smad信号通路表达的影响

目的:研究抗纤灵方对5/6肾切除所致肾纤维化大鼠的治疗效果,并探讨其分子作用机制。方法:将50只SD大鼠随机分为正常组(n=10),假手术组(n=10),5/6肾切除肾纤维化造模组(n=30)。将造模成功的大鼠随机分为模型组、抗纤灵组、氯沙坦钾组。氯沙坦钾组、抗纤灵方组每日分别给予氯沙坦钾(33. 3 g·kg-1)及抗纤灵方(21 g·kg-1)灌胃治疗,其余组都用等体积的生理盐水。持续8周灌胃后处死,检测各组大鼠血肌酐(SCr),尿素氮(BUN),24 h尿蛋白(24 h-Pro);苏木素-伊红(HE)染色观察肾脏组织病理学改变;马松(Masson)染色观察肾脏纤维化程度;蛋白免疫印迹法(Western blot)及实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)分别检测肾脏转化生长因子-β_1(TGF-β_1),Smad2,Smad3,Smad7蛋白和mRNA在肾脏组织中的表达。结果:与正常组和假手术组比较,模型组大鼠的SCr,BUN,24 h-Pro上升,纤维化面积和肾脏损伤评分增加,TGF-β_1,Smad2,Smad3 mRNA与蛋白表达升高,Smad7 mRNA与蛋白表达显著下降(P 0. 01)。与模型组相比,氯沙坦钾组、抗纤灵方组可减少纤维化面积,降低肾脏损伤评分,SCr,BUN,24 h-Pro,TGF-β_1,Smad2,Smad3 mRNA与蛋白的表达水平,Smad7mRNA与蛋白表达显著上调(P 0. 01),但低于正常组与假手术组的水平。结论:中药抗纤灵方可通过抑制TGF-β_1/Smad通路来延缓肾纤维化。     

芪归益肾方对UUO小鼠肾组织TGF-β1/Smads/PI3K信号通路的影响

目的:利用单侧输尿管梗阻(UUO)模型探讨芪归益肾方通过调控转化生长因子-β1(TGF-β1)/Smads/磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)信号通路延缓肾脏纤维化进展的机制。方法:Balb/C小鼠32只,制造UUO肾病模型,根据干预的药物分为芪归益肾方组(中药组,10 g·kg~(-1)),洛汀新组(10 m L·kg~(-1)),模型组,假手术组。实验结束后取肾组织采用苏木素-伊红(HE)染色及Masson染色进行病理学检测,观察肾小管-间质指数的变化;采用免疫组化检测肾组织中TGF-β_1,Smads,PI3K,纤维连接蛋白(FN)蛋白的表达,蛋白免疫印迹(Western blot)及逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)方法对肾组织的TGF-β1,PI3K蛋白及mRNA表达进行分析。结果:与假手术组比较,模型组肾小管-间质指数明显升高,免疫组化显示TGF-β1,Smads,FN蛋白表达均明显升高,PI3K蛋白表达明显降低(P0.05),TGF-β_1蛋白及mRNA表达明显升高,PI3K蛋白及mRNA表达明显降低(P0.05);与模型组比较,中药组和洛汀新组明显降低肾小管-间质指数,免疫组化显示明显降低TGF-β_1,Smads,FN蛋白表达,明显升高PI3K蛋白表达(P0.05),明显降低TGF-β1蛋白及mRNA表达,明显升高PI3K蛋白及mRNA表达(P0.05)。结论:芪归益肾方对于UUO模型小鼠延缓肾脏纤维化有较好的治疗作用,其作用机制可能与调控TGF-β1/Smads/PI3K信号通路有关。     

IPF中医病机“气络失和”与TGF-β1/Smads信号传导通路活化的相关性探讨

目的:探析在特发性肺纤维化(IPF)病程中气络失和与转化生长因子-β1(TGF-β1)/Smads信号转导通路活化的相关性。方法:通过查阅文献,明确气络概念,结合导师吕晓东教授所提出的特发性肺纤维化"肺虚络瘀"病机观,提出气络失和为特发性肺纤维化的中医病机之一。基于吴以岭教授"气络-NEI"理论中气络与神经-内分泌-免疫网络存在高度相关性和内在一致性,神经递质、激素、细胞因子等信息分子及其受体是气络在分子水平上的生物学基础,以气络与细胞信号转导通路的结构、功能、疾病发生机制等为切入点,展开对气络失和与TGF-β1/Smads信号转导通路活化两者相关性的探讨。结果:气络通达内外,遍及周身上下,逐层细分,呈树枝状、网络拓扑状结构与细胞信号通路网络结构相近。气络运行气血津液,传递机体信息,并可双向调节,与信号转导通路传递信息,正负反馈调节功能相似。气络失和所致的痰、虚、瘀与TGF-β1/Smads信号转导通路活化所引起的免疫炎症机制、细胞外基质沉积等相似,且邪经气络逐层深入,与TGF-β1/Smads信号转导通路逐步活化过程相似。益气通络的中药复方治疗特发性肺纤维化的作用机制与抑制TGF-β1/Smads信号转导通路有关。结论:IPF中气络失和与TGF-β1/Smads信号转导通路活化的具有相关性,推测益气通络法可能通过调节TGF-β1/Smads信号转导通路发挥抗纤维化作用。     

二陈汤加味对COPD大鼠转化生长因子-β1，组蛋白去乙酰化酶2基因表达的影响

目的:观察二陈汤加味对慢性阻塞性肺疾病(COPD)大鼠肺组织中转化生长因子-β_1(TGF-β_1)及其受体(TGF-βRII)基因表达,外周血单个核细胞(PBMCs)中组蛋白去乙酰化酶2(HDAC2)基因表达及活性的影响。方法:采用烟熏加脂多糖方法制备COPD大鼠模型。随机分为正常组、模型组、二陈汤加味高、中、低剂量组(20,10,5 g·kg~(-1))。正常组、模型组灌胃生理盐水(10 g·kg~(-1)),二陈汤加味高、中、低剂量组分别灌胃,连续14 d。荧光酶联免疫法测定PBMCs中HDAC2活性,酶联免疫吸附测定(ELISA)法测定肺组织匀浆中TGF-β_1及PBMCs中HDAC2含量;实时荧光定量PCR(Real-time PCR)检测肺组织匀浆中TGF-β_1mRNA及PBMCs中HDAC2 mRNA表达;免疫组化检测TGF-β_1与TGF-βRⅡ蛋白在肺组织的原位表达,光镜观察组织结构。结果:与正常组比较,模型组大鼠肺组织匀浆中TGF-β_1含量升高(P0.05);肺组织中TGF-β_1mRNA,TGF-β_1与TGF-βRⅡ蛋白表达均显著增强(P0.01);模型组大鼠PBMCs中HDAC2 mRNA表达、含量及其活性均明显减低(P0.05,P0.01),差异均有统计学意义。与模型组比较,二陈汤加味高、中剂量组肺组织匀浆中TGF-β_1mRNA表达(P0.01)和TGF-β_1蛋白含量均显著降低(P0.05,P0.01),免疫组化检测肺组织中TGF-β_1与TGF-βRⅡ蛋白表达均显著弱于模型组(P0.01),PBMCs中HDAC2 mRNA表达、含量及其活性均升高(P0.05,P0.01),肺组织结构明显改善。结论:二陈汤加味对COPD有抗炎作用。其机制可能与增强PBMCs中HDAC2基因表达,提高HDAC2活性,抑制TGF-β_1及其受体基因的表达有关。     

益气养阴活血通络法干预肺成纤维细胞TGF-β1/Smads信号传导通路的机制

目的:探讨益气养阴活血通络法调控肺成纤维细胞转化生长因子-β_1(TGF-β_1)/Smads信号传导通路机制。方法:SPF级雄性Wistar大鼠30只,采用随机数字法,将30只大鼠随机分为3组,中药含药血清组,西药含药血清组,正常血清组,第4天末次给药后提取含药血清。气管内注入博来霉素造肺纤维化大鼠动物模型,采用胰蛋白酶消化液消化法培养肺成纤维细胞。细胞分为模型组,中药组,西药组,抑制剂组。免疫荧光法鉴定肺成纤维细胞,并分别于第24,48,72 h取材,采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测TGF-β_1,Smad2,Smad4,Smad7 mRNA的表达及流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果:第24,48,72 h检测结果显示,与模型组比较,中药组、西药组、抑制剂组细胞内TGF-β_1,Smad2,Smad4 mRNA表达水平明显下调(P0.01);第24 h西药组TGF-β_1mRNA表达水平明显低于中药组(P0.05);第48,72 h检测结果均显示与中药组比较,西药组、抑制剂组TGF-β_1mRNA表达水平均明显下调(P0.05,P0.01);第24,48 h检测结果显示与模型组比较,中药、西药、抑制剂各组细胞内Smad2 mRNA表达水平下调明显(P0.01);中药组、西药组、抑制剂组3者表达水平相近,无统计学意义。第72 h检测结果显示与中药组比较,西药组、抑制剂组Smad2 mRNA表达水平均明显下调(P0.05);第24,48,72 h检测结果均显示与中药组比较,西药组、抑制剂组Smad7 mRNA表达水平均明显下调(P0.01)。第24,48,72 h检测结果均显示与模型组比较,中药组、西药组与抑制剂组凋亡率明显上调(P0.01);中药组细胞凋亡率明显高于抑制剂组(P0.01)。结论:益气养阴活血通络法可能通过下调肺成纤维细胞TGF-β_1,Smad2,Smad4含量和上调Smad7含量调控TGF-β_1/Smads信号通路,从而延缓特发性肺纤维化(IPF)进展。     

柴胡疏肝散对肝纤维化大鼠TGF-β1/Smad信号通路的影响

目的:探讨柴胡疏肝散对肝纤维化(hepatic fibrosis,HF)的作用机制。方法:60只Wistar大鼠被随机均分为6组:正常组、模型组、柴胡疏肝散高、中、低剂量组、柴胡疏肝散预防组。除正常组外,其余各组均采用猪血清ip诱发HF,0.5 m L/只,2次/周,连续10周,5周后即可形成HF。预防组于造模同时给药(以柴胡疏肝散6.3 g·kg-1),柴胡疏肝散高、中、低剂量组[(12.6,6.3,3.15)g·kg-1]于造模第6周给药,连续10周。采用RT-PCR法检测各组肝组织转化生长因子-β1(TGF-β1),Smad2,Smad3,Smad4和Smad7的mRNA表达,免疫组化法分别检测肝组织TGF-β1,磷酸化Smad 2/3(p-Smad 2/3)和Smad7蛋白表达。结果:与正常组比较,模型组TGF-β1,Smad2,Smad3的mRNA和TGF-β1,p-Smad 2/3蛋白表达均显著增加(均P0.01),Smad7基因表达显著降低(均P0.01);与模型组比较,柴胡疏肝散中剂量组TGF-β1和Smad3 mRNA表达均显著降低,p-Smad 2/3和TGF-β1蛋白表达显著减弱(P0.05,P0.01),Smad7基因表达显著增加(P0.01)。结论:柴胡疏肝散有明显的抗HF作用,其机制可能与抑制TGF-β1/Smad信号通路有关。