甘草3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因多态性对其编码酶催化效率的影响

目的:利用GC-MS方法分析甘草不同3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGR)基因型表达蛋白的催化效率,为揭示甘草HMGR多态性在优质甘草药材形成中的作用奠定基础.方法:以从甘草中克隆的4种HMGR基因突变型构建表达载体,转化Escherichia coli BL21,进行诱导表达、检测、纯化及体外酶促反应,采用TLC及GC-MS对反应产物进行定性及定量分析.结果:L/V型突变(-HSL,-HSV)催化活性近似,GA插入型突变(GALLV,GALSV)催化活性近似,但插入型突变的催化活性显著高于前者,是前者的2倍左右.结论:甘草功能基因HMGR基因多态性可能是甘草优质药材形成的分子基础.     

甘草β-香树酯醇合成酶编码区SNP与甘草酸含量的相关性研究

目的:探讨甘草β-香树酯醇合成酶(β-amyrin synthase,bAS)编码区SNP与甘草酸含量之间的相关性。方法:采用HPLC法测量80株人工栽培甘草的甘草酸含量,采用SAS 9.0软件将80株甘草按照甘草酸含量极显著水平(P0.000 1)进行分组;采用RT-PCR技术,扩增出甘草bAS编码区序列,运用DNAman分析软件找出该序列的SNP位点,进而分析该位点与甘草酸含量高低的相关性。结果:bAS基因编码区共有94,254 bp 2个突变位点,在94 bp位点发生G/A转换,为错义突变,导致该位点处甘氨酸/天冬氨酸转换,254 bp处发生C/T转换,为同义突变,根据序列变异将所测样品划分成G-T基因型、A-T基因型、G-C基因型和A/G-C基因型。结论:A-T基因型、G/A-C基因型和G-T基因型和高含量甘草酸形成具有显著的相关性。     

阳春砂3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因的克隆及分析

目的 克隆阳春砂萜类生物合成途径上游关键酶--3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase, HMGR)(EC:1.1.1.34)的编码基因;分析基因的功能及其在阳春砂不同组织中的表达.方法 用基于RT-PCR的方法从阳春砂叶片中获得编码HMGR的cDNA全长序列,克隆基因编码区;用生物信息学的方法对其编码蛋白进行相似性检索和功能分析;用半定量RT-PCR法比较基因在阳春砂不同组织中的表达差异.结果 获得了全长2 023 bp的编码阳春砂HMGR的cDNA序列,命名为AvHMGR(GenBank登记号:FJ455511).AvHMGR编码的蛋白与其他植物来源的HMGR有很高相似性,含有NADPH结合基序和底物HMG-CoA结合基序,N-端有两个跨膜结构域.保守功能结构域的分析结果表明AvHMGR属于3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶家族.AvHMGR在包括茎、根、果皮和种子团的广泛组织中表达,且在这些组织中的表达量均高于在叶片中的表达.结论 从阳春砂中克隆了AvHMGR基因,为进一步鉴定基因功能、探明阳春砂萜类生物合成的基因调控机制打下基础.     

三七3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶基因的克隆和生物信息学分析

目的克隆三七总皂苷甲羟戊酸合成途径中的1个关键酶3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme-A reductase,HMGR)基因,为进一步研究HMGR蛋白的功能及开展三七皂苷的合成生物学研究奠定基础。方法根据NCBI上已公布的同属人参的HMGR基因全长序列(登录号GU565097.1)设计特异性引物。利用RT-PCR技术,以三七愈伤组织总RNA反转录的cDNA为模板扩增基因片段;并对其编码的蛋白进行生物信息学预测和基因表达分析。结果序列分析表明,获得的三七HMGR(命名为PnHMGR)基因的cDNA序列大小为1 893 bp,该序列与人参、刺五加和杜仲中HMGR基因的一致性分别达到98%、93%、80%,且含有大小为1 725 bp的开放阅读框,经Genbank查询为一新的cDNA。生物信息学预测PnHMGR基因编码蛋白包含2个跨膜区,不含信号肽,具有HMGR催化作用的活性中心结构域。实时荧光定量PCR检测到PnHMGR基因在三七细胞生长30 d表达量最高。结论首次从药用植物三七中克隆得到HMGR基因的编码区序列,为进一步鉴定PnHMGR的功能和开展三七皂苷的合成生物学研究奠定了基础。     

一个新的丹参3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶3基因的克隆及其表达分析

目的:对丹参3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(3-hydroxy-3methylglutary CoA reductase,HMGR3)基因的cDNA克隆并进行序列分析。方法:利用丹参转录组文库克隆一种新的丹参次生代谢途径上的功能基因;利用BLAST进行序列比对,ORF Finder寻找开放阅读框,Clustal W比对丹参中已有的3条HMGR的氨基酸序列,构建系统进化树,QRT-PCR检测丹参HMGR3基因在根、茎、叶中的mRNA水平,并检测Ag+诱导子诱导后丹参毛状根中该基因的转录水平。结果:克隆得到一个新的丹参HMGR3基因,该基因ORF全长1 692 bp,编码563个氨基酸,具有HMGR基因家族的特征序列,与SmHMGR1和SmH-MGR2分别具有75.04%,80.64%的同源性,QRT-PCR分析表明该基因在丹参根茎叶中均有表达,在叶中表达量最高,Ag+诱导24 h时mRNA水平达到最高值。结论:首次克隆得到了1条新的丹参HMGR家族基因SmHMGR3,这一结果为进一步研究丹参次生代谢途径提供了新的思路和靶点。     

滇龙胆3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因克隆、表达及分析

目的:从药用植物滇龙胆中克隆得到3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl CoA reductase,HMGR)基因的c DNA全长,构建原核表达载体使其在大肠埃希菌中表达,对其进行定量表达并进行生物信息学分析。方法:利用PCR扩增克隆得到滇龙胆HMGR基因c DNA全长。构建p EASY-E1-HMGR表达载体,IPTG诱导表达。利用生物信息学方法分析克隆到的c DNA序列并预测结构和功能。采用实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)分析滇龙胆根、茎、叶在4个不同发育时期的HMGR表达情况。结果:克隆出两组HMGR基因,其中一组HMGR c DNA全长1 747 bp,开放阅读框长1 697 bp,编码565个氨基酸,定名为GRHMGR-1;另一组HMGR c DNA全长1 731 bp,开放阅读框长1 572 bp,编码523个氨基酸,定名为GRHMGR-2。SDS-PAGE显示重组质粒成功表达目的蛋白。Blastp发现,GRHMGR-1,GRHMGR-2与同属植物黄龙胆、秦艽的亲缘关系最为相近。结构分析显示都含有2个HMG-CoA结合位点,2个NADPH结合位点,预测都定位于内质网上。HMGR在滇龙胆根、茎、叶这4个不同发育期均有表达,表达量最高的是叶。结论:首次从滇龙胆中克隆到可能编码HMGR酶的基因,可为深入探讨滇龙胆龙胆苦苷生物合成奠定基础。     

鱼腥草HMGR基因cDNA克隆、差异表达及蛋白质结构分析

目的克隆鱼腥草3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGR)基因并分析其差异表达。方法采用实时荧光定量PCR(RT-PCR)方法获得HMGR基因cDNA序列并对HMGR蛋白进行理化性质、蛋白二级结构及三维结构预测分析,并预测该蛋白功能;利用RT-PCR方法检测HMGR基因在鱼腥草的地下茎、地上茎、叶、花中的表达情况。结果克隆获得的HMGR基因cDNA全长为1 626 bp,编码541个氨基酸。生物信息学预测HMGR蛋白含2个跨膜区,不含信号肽。HMGR基因主要在鱼腥草的花中表达,其他器官中表达相对较低,地下茎中表达量最低。结论首次从鱼腥草中克隆了HMGR基因,为进一步阐明该基因在鱼腥草萜类化合物代谢途径中的作用奠定基础。     

罗汉果内参基因筛选和3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶时空表达分析

目的筛选罗汉果Siraitia grosvenorii基因表达分析的内参基因,研究苷V生物合成关键酶3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGR)时空表达特性。方法克隆罗汉果看家基因甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、微管蛋白(α-tubulin)、肌动蛋白(β-actin)和泛素(UBQ5)的基因片段,评价了4个基因在不同部位(叶、茎和果)及果实发育不同时期的稳定性,筛选内参基因,分析HMGR的时空表达特性。结果 UBQ5表达最稳定,适宜作为内参基因;叶片的HMGR相对表达量较低,茎和果实相对表达量较高;果实不同发育时期,HMGR的相对表达量呈现先升高再降低然后再升高再降低的波动式变化,70 d后HMGR的相对表达量最高,然后依次是5、30、10、50 d。结论 UBQ5是适宜的内参基因。叶片、茎和果实中,HMGR的相对表达量差异明显。果实发育不同时期,HMGR的相对表达量呈波动式变化,与苷V合成积累变化规律相似。     

乌拉尔甘草HMGR基因cDNA的克隆与序列分析

目的:对乌拉尔甘草3.羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(3-hydroxy-3methylglutary CoA reductase,HMGR)的cDNA克隆并进行序列分析.方法:根据NCBI数据库中的豆科其他物种HMGR的cDNA保守区设计引物,利用同源扩增和cDNA末端快速扩增技术从甘草根中获得目的基因;利用BLAST进行序列比对,ORF Finder寻找开发阅读框,Prosite分析蛋白质的基本结构域,Clustal x比对已有HMGR的氨基酸序列,并构建进化树.结果:得到1个全长为1 842 bp的HMGR的cDNA序列,含有1 722 bp的开放阅读框(open reading frame,ORF),编码573个氨基酸,具有HMGR家族的特异序列,推测的氨基酸序列与豌豆、蒺藜苜蓿的氨基酸序列一致性分别为84%,76%.结论:对甘草HMGR基因的cDNA进行了克隆,为进一步研究3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A在甘草酸生物合成途径中的作用提供了理论依据.     

18β-甘草酸和18α-甘草酸对大鼠原代肝细胞 CYP3A酶表达的影响

目的:研究甘草中的2种成分18β-甘草酸和18α-甘草酸对原代培养大鼠肝细胞中细胞色素P450 3A(CYP3A)在mRNA及蛋白水平表达的影响,并探讨其剂量.效应关系.方法:原位两步胶原酶灌流法分离大鼠肝细胞并采用"胶原蛋白凝胶三明治"培养原代肝细胞,无血清条件下培养细胞,并用不同剂量的18β-甘草酸和18α-甘草酸处理细胞,RT-PCR法测定CYP3A mRNA表达水平,Western-blot法测定CYP3A蛋白表达.结果:实验条件下对照组、18β-甘草酸、18α-甘草酸处理组CYP3A基因及蛋白均可被检测,18βv甘草酸浓度依赖性诱导CYP3A mRNA(25～100 μmol·L~(-1))及蛋白表达(50～400μmol·L~(-1)),而18α-甘草酸浓度依赖性抑制CYP3A mRNA(25～100 μmol·L~(-1))及蛋白表达(25～100 μmol·L~(-1))表达.结论:18β-甘草酸和18αv甘草酸在转录水平上分别上调和下调大鼠肝细胞CYP3A的表达.     

药用植物功能基因的研究思路与展望——以甘草为例

近些年来有关功能基因的研究已成为药用植物研究领域的热点,研究内容涉及基因克隆、功能鉴定、多态性分析、表达模式分析以及功能基因与代谢途径的相关性分析等诸多方面。甘草是我国最常用的大宗药材之一,其主要活性成分为甘草酸,具有多种药理功能,在国内外市场上应用广泛。本文以甘草为例,对甘草酸代谢途径中已报道的功能基因进行调查研究,在基因克隆、基因功能、基因多态性等方面进行分析,以期为揭示甘草酸合成代谢的分子机制奠定基础,并为其他药用植物功能基因的研究提供思路。     

甘草鲨烯合酶基因多态性对其编码酶催化效率影响的研究

目的:分析甘草鲨烯合酶(squalene synthase,SQS)基因多态性及其对编码酶催化效率的影响,为揭示优质甘草形成的分子机制奠定基础.方法:提取甘草总RNA; PCR扩增其SQS基因编码序列;测序后分析SQS序列的多态性;将具有明显差异的4个甘草SQS序列(SQS1C,SQS1F,SQS2A,SQS2B)连入表达载体pET-32a(+),转化大肠杆菌BL21;IPTG诱导蛋白表达,纯化后用于体外酶促反应;GC-MS鉴定产物并比较相对含量.结果:甘草SQS1基因存在单核苷酸多态性(single nuclear polymorphisms,SNPs)、插入与缺失多态性(InDel)、选择性剪接(AS)多态性;SQS2基因只存在SNPs.氨基酸序列分析显示,SQS1非保守替换占53.94％,结构域中有2个位点突变;SQS2非保守替换占60％,结构域中有1个位点突变.在4种编码酶的体外酶促反应中,利用GC-MS均能检测到产物生成;SQS1F编码酶积累鲨烯的能力高于其他序列.结论:甘草SQS基因具有丰富的多态性,其编码酶催化效率差异显著,这可能是优质甘草形成的分子基础.     

短时外源甘草酸刺激下的甘草次生代谢产物影响关系研究

试验拟在人工模拟的高甘草酸含量环境下,探寻甘草中次生代谢产物间的相互影响关系,筛选出与甘草酸含量明显相关的次生代谢产物.通过根部浸泡甘草酸铵溶液,分析浸泡后72 h内甘草根中4种次生代谢产物含量的变化,统计学软件分析各成分与甘草酸含量的相关性.结果表明高浓度1.0mmol· L-1甘草酸的根部浸泡对于在甘草中模拟高甘草酸含量环境是切实可行的,且在短时外源甘草酸刺激时,甘草中甘草酸和甘草苷的含量存在明显的正相关关系.外源甘草酸刺激对甘草植株体内甘草酸的合成积累产生一定的影响,且甘草酸的积累与甘草苷含量密切相关.     

微量元素养分平衡剂对甘草生长、生理特性以及有效成分含量的影响

目的:研究微量元素养分平衡剂对一年生甘草各项生长指标和生理指标以及主要有效成分甘草苷和甘草酸含量的影响.方法:分别对生长在内蒙古赤峰中药材种植基地和北京中医药大学药用植物园的大田甘草进行2次施肥.采用LI-6400光合仪测定其光合生理指标以及植物生理学常规方法进行甘草叶片色素和抗氧化酶活性的测定.使用HPLC测定甘草根中甘草苷和甘草酸的含量.结果:该微量元素养分平衡剂的施加对甘草株高,叶绿素a,叶绿素b等叶片色素,净光合速率(Pn)、气孔导度(Gs)、胞间C02浓度(Ci)等光合生理指标以及地上鲜重和根干重均有显著的促进作用.并且与对照(CK)相比,微肥300倍(T1)和微肥600倍(T2)均显著促进甘草酸含量的增加,分别增加了24.72%,20.23%,各处理间差异显著(P＜0.05).结论:微量元素养分平衡剂可以促进甘草生长、生理和有效成分含量的提高,其中微肥300倍的效果优于600倍.     

我国甘草药用植物资源调查及质量评价研究

目的:摸清我国甘草药用植物野生分布区和人工种植区的资源现状,分析不同分布区甘草药材中甘草酸和甘草苷的含量。方法:采用走访调查、现地样方取样和实验室数据测定分析相结合的方法。结果:我国野生甘草分布范围没有发生明显变化,但种群密集程度发生了较大改变;当前全国野生甘草蕴藏量不足50万t,栽培甘草地里蓄积量不到25万t;99份野生甘草药材甘草酸和甘草苷的平均质量分数分别为3.48%,1.73%,仅61.6%的样品达到《中国药典》(2005年版)标准;11份栽培甘草药材甘草酸和甘草苷的平均质量分数分别为2.85%,1.53%,其中4份二年生样品中有3份低于药典标准。结论:甘草资源总蕴藏量仍然在减少,人工甘草将成为野生甘草的重要替代资源;栽培与野生甘草药材之间存在较大的质量差异;加强野生甘草资源保护,提高人工甘草药材质量,发展优质甘草栽培产业,是解决资源危机与实现甘草资源可持续利用的有效途径。     

根特异性过表达β-香树脂醇合成酶基因增加乌拉尔甘草毛状根中甘草酸的含量

Objsective: Glycyrrhizia uralensis, one of the most widely-used traditional Chinese medicines, is mainly cropped in China. However, many cultivars are less in glycyrrhizic acid than Chinese Pharmacopoeia requires. In this paper, we improved glycyrrhizic acid by regulating β-amyrin synthase gene(GuBAS).Methods: Tobacco root-specific promoter TobRB7 and Gu BAS c DNA were obtained and combined with linearized pCAMBIA1305.1 to construct root-specific plant expression vector which was later transformed into Agrobacterium rhizogenes ACCC10060 by electrotransformation. The cotyledons and hypocotyls of G.uralensis were infected by the recombinant A. rhizogenes ACCC10060 to induce hairy roots. The GA content was quantified by HPLC.Results: The PCR and sequencing results both showed that three transgenic hairy root lines were obtained. The copy number of Gu BAS in these transgenic hairy roots was intended by q RT-PCR to be 3, 7,and 4. GA was detected by HPLC, and the results showed that GA was present in the three transgenic hairy roots, while absent in wild hairy roots.Conclusion: Over-expressing Gu BAS root-specifically in hairy roots of G. uralensis enhanced GA accumulation.     

多年生乌拉尔甘草复合丛枝菌根真菌接种效应研究

目的:探究2种丛枝菌根真菌复合与独立接种对田间栽培多年生乌拉尔甘草生长与有效成分积累的长短期效应。方法:选取摩西斗管囊霉Funneliformis mosseae与根内根孢囊霉Rhiaophagus intraradices 2种丛枝菌根真菌菌种,在大田条件下对乌拉尔甘草进行单菌种与复合菌种接种处理,分别于栽培的第1年和第2年采集乌拉尔甘草样品,分析其形态指标和有效成分甘草酸、甘草苷含量。结果:田间试验结果表明,复合接种和摩西斗管囊霉单接种均对乌拉尔甘草中甘草酸与甘草苷含量有提升作用,其中复合接种提升效果最为显著,其次为摩西斗管囊霉单接种,根内根孢囊霉单接种处理无显著提升作用。接种处理组乌拉尔甘草种苗的生长指标与对照组差异无统计学意义。接种丛枝菌根真菌显著提高了甘草苷含量与甘草酸含量的比值,接种组甘草苷、甘草酸的积累速率呈显著正相关且与对照组有明显差异。结论:揭示了大田条件下复合丛枝菌根真菌接种的长期效应,发现摩西斗管囊霉与根内根孢囊霉复合接种可以提高大田栽培乌拉尔甘草的品质,并对甘草苷与甘草酸的含量比例有调节作用,为人工栽培乌拉尔甘草过程中丛枝菌根真菌利用提供参考。