总丹参酮对HSC-T6细胞增殖和产生胶原的影响

目的 研究总丹参酮对体外肝星状细胞(HSC-T6)增殖和胶原合成的影响.方法 采用血清刺激HSc-T6细胞,用[3H]-TdR和[3H]-Proline掺入法分别检测其增殖和胶原合成的活性.结果 总丹参酮在1.0～16.0 mg·L<'-1>浓度范围内能够浓度依赖性地抑制血清促进的HSC-T6细胞增殖和产生胶原.结论 总丹参酮对HSC-T6细胞的增殖和产生胶原有明显的抑制作用.该作用可能是总丹参酮抗肝纤维化的机理之一.     

不同工艺制备的复方黄芪有效部位对肝星状细胞增殖及产生胶原的影响

目的:研究复方混合提取工艺和单味药提取工艺制备的黄芪总苷(ATS)、黄芪多糖(APS)、丹参总酚酸(TSA)和总丹参酮(TTS)对肝星状细胞(HSC)的抑制作用,考察不同制备工艺对相同有效部位生物活性的影响。方法:采用血清刺激HSC,用[3H]-TdR和[3H]-Proline掺入法分别检测其增殖和胶原合成的活性。结果:以增殖抑制率为指标时,单提工艺制备的ATS、TSA、TTS的效价强度分别是混提工艺ATS、TSA、TTS的1.05、1.16和1.14倍,而以胶原抑制率为指标时,效价强度则分别是0.97、1.27、1.03倍。结论:两种工艺制备的相同有效部位基本等效。     

不同时间收集的KCCM对HSC-T6细胞的增殖和胶原合成的影响

 目的 研究不同时间收集的枯否细胞条件培养基(KCCM)对体外HSC—T₆细胞的增殖和胶原合成的影响。方法 用CCl₄急性损伤的大鼠肝制备KCCM,采用大鼠肝星状细胞——HSC—T₆细胞株以及[³H]-TdR和[³H]-Proline掺入法分别检测其增殖和胶原合成的活性。结果 系列倍比稀释的KCCM与HSC-T₆细胞共同孵育48 h后,KCCM稀释比为1:4时促增殖和胶原合成的能力最强。每隔48 h收集1次KCCM,共7次,前6次收集的KCCM能明显促进HSC-T₆细胞合成胶原(P<0.01);前5次收集的KCCM能明显促进HSC-T₆细胞增殖。结论 制备KCCM时,最多可收集6次。     

苦杏仁苷对大鼠肝星状细胞HSC—T6增殖和Bax基因表达的影响

目的：研究苦杏仁苷对大鼠肝星状细胞HSC—T6增殖的影响和对凋亡基因Bax的调控作用。方法：利用噻唑蓝染色法动态检测不同浓度的苦杏仁苷对大鼠HSC—T6细胞增殖的影响。利用PCR法检测苦杏仁苷对HSC—T6细胞凋亡基因Bax的表达水平。结果：苦杏仁各实验浓度组对HSC—T6细胞的增殖无直接抑制作用,但其高浓度10^－3mol／L和中浓度10^-4mol／L可以使HSC—T6细胞提前到达增殖高峰期;而各浓度组对HSC—T6细胞的Bax基因都有一定的诱导作用,并且存在量效关系。结论：苦杏仁苷不能直接抑制HSC—T6细胞的增殖,但可能通过诱导或上调凋亡基因Bax的过度表达,使细胞提前进入凋亡程序阶段,最终使活化的HSC—T6发生细胞凋亡,以起到抗肝纤维化的作用。     

保肝宁对HSC—T6细胞增殖及I型胶原表达的影响

目的：探讨复方保肝宁对HSC－T6细胞增殖及I型胶原表达的影响。方法：复方保肝宁给正常大鼠灌胃，制备药物血清，温育培养HSC－T6细胞48小时。MTT法测定星状细胞增殖，ELISA法测定培养上清的I型胶原表达量。结果：复方保肝宁药物血清能明显抑制HSC－T6细胞增殖，抑制细胞的I型胶原分泌。实验表明，在抑制HSC－T6细胞增殖和I型胶原蛋白分泌方面，高剂量组药物血清无低、中剂量组明显，是否为血清药物浓度对细胞的影响，尚需进一步研究。结论：复方保肝宁能明显抑制HSC－T6细胞的活化，对HSC－T6细胞I型胶原表达的抑制可能是该方抗肝纤维化的主要作用机制之一。     

复方861含药血清对HSC-T6细胞Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原mRNA表达影响的研究

观察复方 86 1含药血清对HSC T6细胞Ⅰ型胶原 (CoL Ⅰ )、Ⅲ型胶原 (CoL Ⅲ )mRNA表达影响。以不同剂量复方 86 1灌胃大鼠制备的含药血清 ,作用HSC T6细胞 4 8h ,应用逆转录定量PCR方法测定其对HSC T6细胞CoL Ⅰ、CoL ⅢmRNA表达的影响。结果表明 :复方 86 10 5、1.0、2 .0、6 .0g kg等不同剂量含药血清HSC T6细胞CoL Ⅰ、CoL ⅢmRNA表达。与空白对照组比较 ,具有显著性 (P <0 .0 5或P ,0 .0 1)。因此 ,复方 86 1可降低HSC T6细胞CoL Ⅰ、CoL ⅢmRNA表达水平 ,具有抗肝纤维化作用。     

乙肝散对肝星状细胞增殖及凋亡的影响

目的通过观察中药乙肝散的药物血清对肝星状细胞(HSC/T6)的增殖及凋亡的影响,从细胞学和分子生物学水平探讨中药乙肝散的抗纤维化的作用机制,为临床用药提供理论依据。方法①MMT法测定细胞增殖。②用流式细胞仪测定各组各浓度药物血清对HSC/T6作用后的DNA含量,低于G1期DNA含量主峰(亚G1期峰)的细胞为凋亡细胞。结果5%,10%和20%浓度的乙肝散的药物血清均对HSC/T6的增殖有显著的抑制作用,对HSC/T6的凋亡率分别为8.63%,14.56%和21.95%。结论中药乙肝散能抑制HSC/T6的增殖,诱导HSC/T6的凋亡,因此促进活化的HSC的凋亡可能是乙肝散抗肝纤维化的细胞分子学重要机制之一。     

抗纤软肝颗粒药物血清对肝星状细胞整合素信号及凋亡的影响

目的：探讨抗纤软肝颗粒药物血清对肝星状细胞增殖、凋亡的影响及整合素信号通路的下游信号分子FAK在其中的作用。方法：将传代培养的大鼠肝星状细胞系（HSC—T6）与中药复方抗纤软肝颗粒药物血清（5％、10％、20％）共同培养48h后，应用MTT法测定细胞增殖；应用流式细胞仪测定细胞凋亡；采用逆转录-聚合酶链反应（RT—PCR）方法检测FAKmRNA的表达。结果：抗纤软肝颗粒药物血清，均能显著抑制HSC—T6增殖，20％药物血清组作用最强（P〈0．05）；流式细胞仪测定结果显示抗纤软肝颗粒药物血清均可诱导HSC凋亡（P〈0.05）；抗纤软肝颗粒药物血清能够使HSC的FAKmRNA的表达下调。结论：抗纤软肝颗粒能够抑制HSC增殖及诱导凋亡HSC。其作用可能与其抑制整合素信号通路下游信号分子FAKmRNA的表达有关。     

抗纤复方药物血清对HSC-LI90细胞Ⅰ型、Ⅳ型前胶原和基质金属蛋白酶及其组织抑制因子-1基因表达的影响

目的：探讨抗纤复方药物血清对肝星形细胞(HSC)L190细胞(HSC—L190)I型、Ⅳ型前胶原和基质金属蛋白酶(MMPs)及其组织抑制因子(TIMP—1)基因表达的影响。方法：以0．5、2．0、4．0g／kg等不同剂量抗纤复方灌胃大鼠,制备药物血清,作用于HSC—L190细胞48h,应用Northern印迹杂交的方法,检测I型、Ⅳ型前胶原、基质金属蛋白酶-2(MMP-2)及膜型基质金属蛋白酶(MT1-MMP)及其组织抑制因子(TIMP-1)基因的表达,并用酶图法检测基质金属蛋白酶-2的活性：结果：(1)抗纤复方不同浓度药物血清能抑制HSC—L190细胞I型、Ⅳ型前胶原及其组织抑制因子TIMP-1的基因表达(P<0．05或P<0．01);(2)能增加膜型基质金属蛋白酶基因表达(P<0．01);(3)对基质金属蛋白酶-2基因表达及活性无影响(P>0．05)。结论：(1)抗纤复方具有抗肝纤维化作用;(2)抗纤复方抑制HSC-LI90细胞TIMP-1基因表达水平,促进胶原降解,可能是抗肝纤维化的作用机制之一。     

丹参酮ⅡA抗大鼠肝星状细胞氧应激脂质过氧化作用的研究

目的：探讨丹参酮ⅡA(tanshinoneⅡA，Tsn)对大鼠肝星状细胞(hepatic stellate cells，HSC)氧应激所致脂质过氧化的抑制作用。方法：HSC与FeNTA共同培养产生氧应激；以MTT法检测丹参酮ⅡA对HSC增殖的效应；LDH法检测丹参酮ⅡA对HSC的毒性作用；以ELISA法测定细胞培养液中I型胶原的水平；以试剂盒推荐方法分别测定细胞培养液中MDA、GSH、GSH—Px、SOD水平。结果：HSC与FeNTA共同培养，细胞内MDA、GSH水平明显升高，GSH-Px、SOD活力明显降低。FeNTA与HSC共同培养，能明显促进HSC增殖和提高细胞培养上清中I型胶原的水平，丹参酮ⅡA可以逆转上述所有FeNTA所致效应。结论：丹参酮ⅡA的抗肝纤维化作用可能与其抑制脂质过氧化有关。     

黄芪对HSC-T6细胞Col-I、TIMP1mRNA影响表达的研究

观察黄芪对HSC—T6细胞I型胶原 (Col-I)、基质金属蛋白酶组织抑制因子 1(TIMP1)mRNA表达的影响。用黄芪 0 .5mg/ml、1.0mg/ml浓度作用于HSC—T6细胞 4 8h ,以逆转录定量PCR方法测定其对HSC—T6细胞Col -I、TIMP1mRNA表达的影响。提示黄芪 0 .5mg/ml、1.0mg/ml浓度HSC—T6细胞Col-ImRNA表达水平为 2 .5± 0 .71、1.5±0 .0 1,与空白对照组比较 ,具有显著性差异 ;TIMP1mRNA表达水平依次为 4 .0 0± 0 .0 1、4 .0 0± 1.4 1,与空白对照组比较 ,无显著性差异。指出黄芪可明显降低HSC—T6细胞Col-ImRNA表达水平 ,而对TIMP1mRNA表达水平无明显影响。     

瑶药猛老虎提取物对大鼠肝星状细胞Ⅰ、Ⅲ型胶原、MMP-1和TGF-β1表达的影响

目的：观察瑶药猛老虎提取物对大鼠肝星状细胞（HSC）Ⅰ、Ⅲ型胶原、基质金属蛋白酶（MMP-1）和转化生长因子-β1（TGF-β1）表达的影响。方法：制备猛老虎乙酸乙酯部位分离物药物血清，分离培养大鼠肝HSC，温育HSC，EIJSA法检测上清液中Ⅰ、Ⅲ型胶原含量；MTT检测HSC的生长情况；逆转录多聚酶链反应（RT—PCR）法观察MMP-1的表达；免疫组化法观察TGF-β1的表达。结果：猛老虎乙酸乙酯部位各分离物和秋水仙碱药物血清对体外培养的HSC细胞增殖无抑制作用。与空白对照血清组比较，无显著性差异（P〉0．05）。分离物E中和高剂量组的药物血清均能明显促进体外培养HSC细胞MMP-1基因表达水平、抑制Ⅰ、Ⅲ型胶原的分泌和TGF-β1表达并呈现剂量依赖关系，与空白对照血清组比较，均具有显著性的统计学意义（P〈0．05或P〈0．01），效果与秋水仙碱相当。结论：瑶药猛老虎抗肝纤维化作用不是直接抑制HSC的增殖，而是与其促进HSC细胞MMP-1基因表达水平、抑制Ⅰ、Ⅲ型胶原的分泌和TGF-β1的表达有关。     

抗纤软肝冲剂对肝星状细胞胶原降解相关基因表达的影响

目的 从细胞分子水平研究抗纤软肝冲剂对肝星状细胞(HSC)胶原降解的影响。方法 抗纤软肝冲剂药物血清温育传一代HSC，以生理盐水和秋水仙碱为对照。ELISA法测定细胞上清I型胶原，并测定细胞层总蛋白以校正胶原含量；半定量RT—PCR法检测间质胶原酶(MMN)和金属蛋白酶组织抑制因子-1(TIMP-1）的mRNA表达。结果 抗纤软肝冲剂组细胞上清中的I型胶原含量明显低于其他两组(P＜0．05或P＜0．01)；明显促进细胞MMN的mRNA表达(P＜0．05或P＜0.01)，显著抑制细胞TIMP-1的mRNA表达(P＜0．05或P＜0．01)。结论 抗纤软肝冲剂能促进MMN基因表达，抑制TIMP-1基因表达，从而促进胶原降解，这可能是该方抗肝纤维化的细胞分子学机制之一。     

丹参不同组分对大鼠血管平滑肌细胞增殖的影响

[目的]探讨丹参的水溶性有效成分 (总丹酚酸 )和脂溶性有效成分 (总丹参酮)对大鼠血管平滑肌细胞(VSMC)增殖的影响 ,以寻找药物的作用靶点。[方法]分离大鼠主动脉中层平滑肌 ,贴壁法培养平滑肌细胞 ,无血清培养基培养静止后 ,以5 %胎牛血清(FCS)刺激VSMC增殖 ,分别加入不同浓度的总丹参酮或丹酚酸 ,以四甲基偶氮唑蓝 (MTT)法观察药物对VSMC增殖的影响 ;以Bradford法检测细胞总蛋白 ;流式细胞仪检测药物对细胞周期的影响。[结果]与对照组相比丹参酮使VSMC增殖活性下降(P<0.05) ,细胞总蛋白合成降低 (P<0.05) ,并呈浓度依赖性,而丹酚酸组与对照组相比无显著性差异 ;此外流式细胞术检测结果显示丹参酮使VSMCG0/G1 期比例升高 ,S期比例下降 ,而丹酚酸组与对照组相比仍无显著性差异。[结论]丹参的脂溶性有效成分总丹参酮具有抑制血管平滑肌细胞增殖的作用 ,而丹酚酸对VSMC不具有以上作用     

抗纤软肝冲剂药物血清对肝星状态细胞胶原代谢及其相关基因表达的影响

目的：从细胞分子学水平探讨抗纤软肝冲剂抗肝纤维化的作用机制。方法：抗纤软肝冲剂药物血清温育传一代HSC，以生理盐水和秋水仙碱为对照。ELISA测定细胞上清Ⅰ型胶原，并测定细胞层总蛋白以校正胶原含量；半定量法RT－PCR法和检测Ⅰ型胶原，间质胶原酶（MMPI）的mRNA表达。结果：抗纤软肝冲剂组细胞上清中的Ⅰ型胶原含量明显低于其它两组（P＜0．01）；能明显抑制细胞的Ⅰ型胶原mRNA表达（P＜0．01），且能促进MMP1的mRNA表达（P＜0．01）。结论：抗纤软肝冲剂能明显抑制HSC的胶原基因表达和促进间质胶原酶基因表达，从而可达到抑制胶原合成，促进胶原降解，这可能是抗纤软肝冲剂抗肝纤维化的细胞分子学机制之一。     

大黄虫丸对大鼠肝星状细胞基质金属蛋白酶表达及活性的影响

目的观察大黄[庶虫]虫丸对大鼠肝星状细胞间质胶原酶（MMP-1）基因表达及分泌到培养基中的明胶酶A（MMP-2）活性的影响。方法分离培养大鼠肝星状细胞（HSC）,制备大黄[庶虫]虫丸大鼠药物血清,温育HSC。逆转录多聚酶链反应（RT-PCR）法观察MMP-1的表达。酶谱法检测MMP-2的活性。结果大黄[庶虫]虫丸药物血清可明显促进HSC对MMP-1的基因表达,同时可明显增加HSC合成的MMP-2的含量和活性（P〈0．05）。结论大黄[庶虫]虫丸的抗肝纤维化作用与其促进HSC的MMP-1基因表达,增加MMP-2的含量和活性有关。     

消痰化瘀抗纤方药物血清对肝星状细胞增殖及胶原降解基因表达的影响

目的:观察消痰化瘀抗纤方(简称抗纤方)药物血清对肝星状细胞(HSC)增殖,Ⅰ型胶原含量及相关基因表达水平的影响,探讨该方抗肝纤维化的细胞分子学机制。方法:正常大鼠血清和药物血清干预HSC-T6细胞24h,MTT法检测抗纤方药物血清对HSC增殖,ELISA法测定细胞上清液Ⅰ型胶原含量变化,RT-PCR法检测细胞中金属蛋白酶组织抑制剂-1(TIMP-1)和基质金属蛋白酶-1(MMP-1)的mRNA表达量。结果:抗纤方高(13.5倍)、中(4.5倍)、低(1.5倍)剂量组药物血清能明显抑制HSC增殖(P<0.05),且增殖抑制率与剂量呈正相关;对上清液中Ⅰ型胶原含量影响,随药物剂量增加明显降低(P<0.05);能明显抑制TIMP-1mRNA表达(P<0.05),促进MMP-1mRNA表达(P<0.05)。结论:抗纤方药物血清能抑制HSC增殖,减少Ⅰ型胶原含量,抑制TIMP-1表达,促进MMP-1表达,具有抗肝纤维化作用。     

抗纤软肝冲剂药物血清对肝星状细胞胶原代谢及其相关基因表达的影响

目的 :从细胞分子学水平探讨抗纤软肝冲剂抗肝纤维化的作用机制。方法 :抗纤软肝冲剂药物血清温育传一代HSC ,以生理盐水和秋水仙碱为对照。ELISA测定细胞上清Ⅰ型胶原 ,并测定细胞层总蛋白以校正胶原含量 ;半定量法RT -PCR法检测Ⅰ型胶原、间质胶原酶 (MMP1)的mRNA表达。结果 :抗纤软肝冲剂组细胞上清中的Ⅰ型胶原含量明显低于其它两组 (P <0 .0 1) ;能明显抑制细胞的Ⅰ型胶原mRNA表达 (P <0 .0 1) ,且能促进MMP1的mRNA表达 (P <0 .0 1)。结论 :抗纤软肝冲剂能明显抑制HSC的胶原基因表达和促进间质胶原酶基因表达 ,从而可达到抑制胶原合成 ,促进胶原降解 ,这可能是抗纤软肝冲剂抗肝纤维化的细胞分子学机制之一。     

复方中药861对大鼠肝星状细胞系一氧化氮合酶表达及其活性的影响

目的：研究复方中药861对大鼠肝星状细胞系（HSC－T6）一氧化氮合酶（NOS）表达及其酶活性的影响，并探讨该药预防、治疗早期门脉高压的可行性。方法：细胞密度为1×10^5/ml的HSC－T6接种于细胞培养皿中，95％O2，5％CO2，37℃，培养24h进行以下分组实验，每组重复6皿，继续培养24h。1组：HSC－T6空白对照组；2组：HSC－T6加复方中药861（2mg/ml)；3组：HSC－T6加复方中药861（4mg/ml)；4组：HSC－T6加复方中药861（8mg/ml)；5组：HSC－T6加复方中药861（4mg/ml)加L－硝基精氨酸甲酯（L－NAME,4mg/ml)。采用化学比色法测定NOS活性，采用硝酸还原酶法测定培养液一氧化氮（NO）水平。4％多聚甲醛固定细胞2h，采用免疫细胞化学法观察HSC－T6诱导型一氧化氮合酶（iNOS)表达。结果：复方中药861能增加HSC－T6 NOS活性（P＜0．01），上清液NO水平也平行增加（P＜0．01），L－NAME不能抑制复方中药861刺激的HSC－T6合成、分泌NO增加（P＞0．05）。免疫细胞化学研究发现活化的HSC－T6细胞浆有iNOS表达，复方中药861能增加HSC－T6 iNOS表达。结论：活化HSC－T6iNOS表达阳性，与自分泌NO有关；复方中药861能明显增加HSC－T6iNOS表达及其酶活性，NO合成、分泌增加。复方中药861可能通过增加肝星状细胞分泌NO途径，抑制肝星状细胞的收缩，从而降低肝窦阻力。因此，复方中药861在预防、治疗早期门脉高压中可能具有重要作用。     

丹红软肝胶囊药物血清对肝星状细胞增殖的干预作用

目的观察丹红软肝胶囊含药血清对肝星状细胞(HSC)增殖及分泌的相关细胞因子的干预作用。方法 15只SD大鼠按随机数字法分为3组,即丹红软肝胶囊组、复方鳖甲软肝片组和正常对照组,各5只,通过灌胃制备丹红软肝胶囊及复方鳖甲软肝片药物血清。将HSC-6细胞分为3组,分别加入含丹红软肝胶囊、复方鳖甲软肝片药物血清及正常小鼠血清的培养基,培养24 h后,采用噻唑蓝(MTT)法检测HSC的增殖率,收集培养上清,采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测Ⅰ型胶原及转化生长因子β1(TGF-β1)的含量。结果丹红软肝胶囊组、复方鳖甲软肝片组吸光度(OD)值均低于正常血清对照组(P<0.01);丹红软肝胶囊组、复方鳖甲软肝片组HSC细胞增殖的抑制率比较差异无统计学意义(P>0.05)。丹红软肝胶囊组、复方鳖甲软肝片组培养上清中Ⅰ型胶原、TGF-β1的含量与正常血清对照组比较均降低(P<0.01);丹红软肝胶囊组、复方鳖甲软肝片组培养上清中Ⅰ型胶原、TGF-β1的含量比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论丹红软肝胶囊可抑制活化的HSC产生TGF-β1,并对HSC分泌胶原产生抑制作用,进而抑制HSC的增殖,这可能是其抗纤维化作用机制之一。