基于DNA序列的石斛属药用植物鉴定研究进展

本文从核基因组、线粒体基因组和叶绿体基因组三方面,综述了目前常用DNA序列在石斛属药用植物的分子鉴定和物种分类研究中的进展。文献显示,目前用于石斛属物种分子鉴定研究的DNA序列主要有核ITS/ITS2、LEAFY,叶绿体rbcL、matK、trnH-psbA、rpoB、rpoC1、trnL-F、rbl16、trnl intron和线粒体基因组nad1 intron2,这些DNA序列均对石斛属药用植物鉴定具有借鉴意义。笔者对叶绿体全基因组序列作为“超级条形码”在石斛属植物中应用的可行性进行了展望,以期为石斛属药用植物的鉴定研究提供参考。     

基于DNA条形码的玉叶金花属植物鉴定研究

目的利用DNA条形码进行玉叶金花属植物的分子鉴定。方法对玉叶金花属20种、89份个体进行叶绿体片段rbc L、mat K和trn H-psb A以及核基因片段ITS的PCR扩增和测序,计算种内和种间Kimura 2-parameter(K2-P)遗传距离,利用序列相似性法和邻接法进行单一片段、核心片段、组合片段以及ITS2片段的分析。结果单一片段分析结果表明玉叶金花属种间遗传距离(0.002~0.012)明显大于种内遗传距离(0.000 3~0.000 7)。trn H-psb A扩增率最低,ITS2片段的分辨率最高,其次是mat K和ITS片段,rbc L片段的分辨率最低。片段组合后的分辨率明显提高,基于序列相似性法和邻接法,mat K+rbc L+ITS和mat K+rbc L+trn H-psb A+ITS的分辨率相当,且比其他片段组的分辨率更高,分别为77%和75%,成功鉴定了15个近缘类群,包括2个药用种类广西玉叶金花和黐花。结论鉴于trn H-psb A扩增率较低,建议mat K+rbc L+ITS作为玉叶金花属物种鉴定的DNA条形码,并作为其药用种类的分子鉴定工具。     

DNA条形码等分子鉴定技术与动植物类中药材的鉴定

中药材鉴定是控制中药质量、确保用药安全与效果的首要环节。DNA分子鉴定是从基因层面上进行中药材鉴别的手段,准确率高。DNA分子鉴定包括电泳技术、免疫技术、随机扩增多态性DNA(RAPD)、限制性内切酶片段长度多态性(RFLP)、扩增片段长度多态性(AFLP)、简单重复序列(ISSR)及DNA条形码等,以DNA条形码应用最为广泛。DNA条形码是基因组中相对较短的、可用于物种鉴定的特异性基因片段。植物类中药材的条形码多选用核基因和叶绿体基因DNA片段,如叶绿体psbA-trnH基因、内转录间隔区(ITS)、叶绿体核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶大亚基(rbcL)和RNA转录体Ⅱ型内含子剪切酶基因(matK)等;动物类中药材的条形码多来自核基因和线粒体基因DNA,主要有线粒体细胞色素C氧化酶亚基1(COⅠ)、核糖体RNA(rRNA)和线粒体细胞色素b基因(CytB)等。综述动植物类中药材DNA分子标记与鉴定技术应用进展,并探讨DNA条形码在药用动植物类中药材鉴定中存在的局限性及发展前景,为中药质量控制提供参考。     

3种藏药基原植物遗传多样性研究

通过野外采集、分类学鉴定及多基因组多片段相结合,对2012年版《西藏自治区藏药材标准》中"桑蒂"、"莪德哇"和"叶兴巴"3种藏药基原植物的遗传多样性进行分析研究。经鉴定它们的基原植物分别为毛萼獐牙菜Swertia hispidicalyx、全萼秦艽Gentiana lhassica和齿叶玄参Scrophularia dentata;直接测定各样品的核糖体DNA ITS区、叶绿体matK,rbcL,rpoC1,trnL(UAA),psbA-trnH,atpB-rbcL,trnS(GCU)-trnG(UCC),rpl20-rps12,trnL(UAA)-trnF(GAA)及线粒体nad1第2内含子序列共93条;毛萼獐牙菜、齿叶玄参的ITS区存在杂合,通过TA克隆法获得60条克隆序列。将克隆序列分为不同的基因型;基于所获全部序列及近缘物种相关序列,探讨3种藏药基原植物的遗传多样性,构建了全萼秦艽的DNA条形码。该工作可为不同遗传背景的藏药基原植物物种鉴定DNA条形码的建立提供新思路及基础资料。     

基于DNA条形码技术的北柴胡种子分子鉴定

目的:建立基于核糖体DNA内转录间隔区(ITS)序列的北柴胡种子分子鉴定方法,保障北柴胡栽培种子的物种准确。方法:收集北柴胡及主要栽培柴胡属物种种子、市售北柴胡种子样品共59份,探究不同取样量和不同水浴条件对种子DNA提取质量的影响,建立柴胡属种子DNA提取方法;通过聚合酶链式反应(PCR)和双向测序得ITS条形码序列。从GenBank下载34条北柴胡、红柴胡、黑柴胡等主要栽培柴胡属物种ITS序列,丰富北柴胡种子鉴定数据库;利用MEGA-X10. 0. 5进行变异位点分析并构建邻接(NJ)系统发育树,考察ITS序列对北柴胡种子的物种鉴定能力;基于BLAST方法和NJ系统发育树法对市售北柴胡种子进行DNA条形码鉴定。结果:共获得59条北柴胡、红柴胡、三岛柴胡及市售北柴胡种子的ITS序列,北柴胡ITS序列可分为6个单倍型,包含7个变异位点,NJ系统发育树表明北柴胡所有单倍型可形成独立的枝,与所收集样品中其他柴胡属栽培物种可相互区分,具备北柴胡种子物种鉴定能力。基于ITS条形码序列鉴定发现19份市售北柴胡种子中有3份为三岛柴胡,伪品率15. 8%。结论:基于ITS序列的DNA条形码技术可以准确可靠地鉴定北柴胡种子及其易混品,可为我国中药材种子规范化建设提供参考。     

石斛属叶绿体DNA序列的系统发育及变异位点分析

目的对石斛属叶绿体IRa(trn V-GAC~trn R-ACG)序列进行系统发育和变异位点分析,深入了解石斛属10个物种此序列所含9个基因的异同,为石斛属植物的系统进化历程及DNA条形码的研究作重要探索。方法用改良试剂盒法提取石斛属10个样本总DNA,自行设计引物,采用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)及T载体对PCR产物进行克隆转化,扩增石斛属叶绿体IRa序列的DNA序列,并与NCBI数据库进行序列比对完成序列拼接;绘制此区域序列的基因结构图,对10条目的序列进行差异位点、遗传距离、系统进化关系等分析。结果目的序列长约7 800 bp,10条目的序列共存在55个差异位点,在基因trn V-GAC、rrn16、trn I-GAU、trn A-UGC、orf42、rrn23及基因间隔区上分布的个数分别是1、8、12、6、1、9和18个;系统发育分析将石斛属10个样本聚为4个类群。结论建立了测定石斛属叶绿体IRa序列的方法,对石斛属这一序列的系统发育和变异位点分析表明,此区域序列丰富,且较为集中分布的变异位点将为石斛属DNA条形码的进一步研究、石斛属资源的道地性评价及相关的种质资源鉴定提供较好的理论依据。     

基于叶绿体全基因组的贝母属特异性DNA条形码的筛选

本研究通过对贝母属4个物种叶绿体基因组进行全局分析,分别查找基因区域和基因间区的高变异区域,筛选用于高效鉴别贝母属植物的新DNA条形码序列。相关研究发现贝母属植物的基因区域序列相似度极高,不适用于DNA条形码鉴定研究;共有7个基因间区可以作为潜在的贝母属植物鉴定的特异性DNA条形码。本研究所构建的DNA条形码筛选方法,为筛选用于难鉴定科属的新的DNA条形码提供了通用的方法体系。     

中国黄芪属药用植物DNA条形码（ITS2）鉴定

中国黄芪属植物种类繁多，具有重要的药用及生物学价值。本文采用了植物DNA条形码候选序列之一的ITS2片段来探讨在黄芪属药用植物中的鉴定能力。结果显示，ITS2基因区通用性强，序列在黄芪属物种间的差异较大，具有明显的Barcoding Gap，能够正确鉴定41个黄芪属植物物种，仅6个物种不能鉴定。此外，ITS2的二级结构也具有一定的系统学及分类学意义。本研究表明ITS2能够作为黄芪属药用植物鉴定的DNA条形码序列，具有重要的应用价值。     

中国黄芪属药用植物DNA条形码(ITS2)鉴定

中国黄芪属植物种类繁多,具有重要的药用及生物学价值.本文采用了植物DNA条形码候选序列之一的ITS2片段来探讨在黄芪属药用植物中的鉴定能力.结果显示,ITS2基因区通用性强,序列在黄芪属物种问的差异较大,具有明显的Barcoding Gap,能够正确鉴定41个黄芪属植物物种,仅6个物种不能鉴定.此外,ITS2的二级结构也具有一定的系统学及分类学意义.本研究表明ITS2能够作为黄芪属药用植物鉴定的DNA条形码序列,具有重要的应用价值.     

黄精属药用植物DNA条形码鉴定研究

目的：评价DNA条形码候选序列对黄精属药用植物的鉴定能力。方法：对44份黄精属样品应用通用引物扩增其叶绿体rbcL、matK、psbA-trnH及核ITS2和ITS序列,分析其种内种间变异和barcoding gap,应用BLAST和Nearest Distance方法计算物种鉴定效率。结果：ITS2和ITS序列通用引物扩增效率低,叶绿体matK序列获得率最低,rbcL最高,三条序列种内与种间变异均较小,无明显的barcoding gap。基于BLAST和Nearest Distance方法计算,三条叶绿体序列对黄精属药用植物的鉴定效率均较低。结论：DNA条形码候选序列psbA-trnH、matK及rbcL不适用于黄精属药用植物的鉴定,叶绿体全序列或通过叶绿体全序列筛选合适的DNA片段可能是该属药用植物分子鉴定的方向。     

基于通用DNA条形码序列的黄精属药用植物分子鉴定

目的 分析4个通用植物DNA条形码序列(trnH-psbA、matK、rbcL和ITS2)及其组合对黄精属药用植物的物种鉴定分辨率，挖掘适用于黄精属种间鉴定的高分辨率分子标记。方法 以《中国药典》2020年版中收录的黄精属药用植物黄精Polygonatum sibiricum、滇黄精P. kingianum、多花黄精P. cyrtonema、玉竹P. odorati及其地方常见同属替代品、混伪品共12种79个野生个体为对象，将4个通用DNA条形码序列独立、联合分析，评估其种间、种内变异情况，并分别基于建树法(tree-based method)和PWG距离法(PWG-distance method)评估不同条形码及其组合的物种鉴定分辨率。结果 ITS2序列扩增成功率低，trnH-psbA、matK、rbcL序列的引物在黄精属植物中通用性较好；3组叶绿体序列的种间变异依次为matK＞trnH-psbA＞rbcL，种内变异差异不显著，种间、种内遗传距离无明显的Barcoding gap；各条形码独立及联合分析的物种鉴定分辨率普遍偏低，其中，组合条形码trnH-psbA＋matK＋rbcL在建树法分析中的分辨率最高，为25%，trnH-psbA＋rbcL在距离法分析中的分辨率最高，为50%。结论 4个通用DNA条形码序列及其组合都并非黄精属药用植物不同种间有效区分鉴定的理想分子标记，但多序列联合分析能在一定程度上提高物种鉴定成功率。     

罂粟属植物核心DNA条形码的筛选

DNA条形码(DNA barcoding)技术是一种准确、高效且对操作人员要求不高的物种鉴定技术。为了筛选出适合罂粟属的DNA条形码,从GenBank上获得罂粟属植物共69条序列,包括21条ITS序列,10条matK序列,8条psbA-trnH序列,14条rbcL序列和16条trnL-trnF序列。应用Mega 6.0软件分析了罂粟属的ITS,matK,psbA-trnH,rbcL,trnL-trnF序列的特征,通过计算序列的种内、种间距离,评估序列的Barcoding Gap和构建NJ,UPGMA系统发育树进行分析。分析结果表明:trnL-trnF不仅种内变异和种间变异差别最大,而且有明显的barcoding gap,种内变异和种间变异重合较少,能较好地区分不同种类的罂粟;所构建的NJ和UPGMA系统发育树,也能将全部物种区分开。综合考虑,建议把trnL-trnF作为鉴定罂粟属植物的核心条形码,结合其他片段作为组合条形码。     

中药地枫皮及其伪品假地枫皮的DNA条形码鉴定

目的:评价和比较几个常用DNA条形码候选序列对地枫皮及伪品假地枫皮的鉴定作用。方法:采集不同产地的地枫皮及假地枫皮样品,进行总DNA提取,选取核基因内转录间隔区2(ITS2)序列、叶绿体rbcL,mat K基因序列进行聚合酶链式反应(PCR)扩增,纯化产物测序,利用Condon Code Aligner V3. 7. 1校对拼接。结果:地枫皮及假地枫皮rbcL序列进行多次PCR扩增及测序结果均不理想,初步推测地枫皮及假地枫皮rbcL序列太长,进化较慢,不适合作为地枫皮及假地枫皮种间鉴别;地枫皮及假地枫皮的matK基因序列测序成功率分别为0和76. 8%,可能是不同类群的植物matK序列的引物标准不一;对地枫皮及假地枫皮的ITS2序列PCR扩增及测序结果最为理想,测序的成功率分别为89. 3%及91. 2%,对测序结果序列进行分析,地枫皮的ITS2序列总长度均为268个碱基,存在2个变异位点;假地枫皮的ITS2序列总长度均为430个碱基,存在4个或3个变异位点。实验结果说明地枫皮及假地枫皮ITS2序列较短,有明显的变异性,便于扩增,表明ITS2序列用于地枫皮及假地枫皮的分子鉴定优于rbcL和matK序列。结论:ITS2序列作为标准的DNA条形码能够有效地鉴定地枫皮及其伪品假地枫皮。     

中国红树类海桑属植物DNA条形码研究＊

目的 对中国的6种红树类海桑属植物进行DNA条形码研究，为该属植物鉴定、资源保护、合理开发等提供参考依据。方法 以核基因ITS2片段及叶绿体基因片段psbA-trnH作为DNA条形码，对分布在中国的海桑属植物进行基因组DNA提取、PCR扩增和双向测序。所得序列经CodonCode Aligner拼接获得叶绿体psbA-trnH基因间区序列和核ITS2序列，用软件MEGA6.0进行相关数据分析，构建NJ（邻接）树。结果 我国6种红树类海桑属植物的ITS2序列间存在明显差异，psbA-trnH序列间也存在一定的碱基差异，表明6种海桑属植物具有其各自独特的DNA条形码，可以相互区别，同时基于ITS2序列及psbA-trnH序列构建的邻接（NJ）树可以看出6种海桑属植物具有或近或远的亲缘关系。结论 核ITS2和叶绿体psbA-trnH序列作为DNA条形码可以有效地区分和鉴别我国6种红树类海桑属植物，为后续药用资源开发等相关研究提供了参考。     

ITS和psbA-trnH序列鉴别绿绒蒿属藏药植物

目的 应用核基因ITS和叶绿体psbA-trnH序列对绿绒蒿属Meconopsis Vig. 藏药进行鉴别。方法 采集欧贝3种基原植物罂粟科绿绒蒿属毛瓣绿绒蒿Meconopsis torquata、红花绿绒蒿Meconopsis punicea、全缘叶绿绒蒿Meconopsis integrifolia,才温2种基原植物罂粟科绿绒蒿属总状绿绒蒿Meconopsis racemosa、多刺绿绒蒿Meconopsis horridula,对植物核糖体DNA内转录间隔区、叶绿体psbA-trnH非编码区序列进行测定与分析。结果 ITS序列分析显示,总状绿绒蒿与多刺绿绒蒿序列一致,其余任意两种间具有变异位点;psbA-trnH序列分析显示,任意两种间均有变异位点;两者结合可有效对所有5种植物进行区分鉴定。结论 ITS和psbA-trnH序列相结合可用于绿绒蒿属藏药欧贝和才温的分子鉴定。     

千斤拔属药用植物DNA条形码鉴定研究

目的筛选一种可准确、高效鉴别千斤拔属Flemingia Roxb.ex Ait.et Ait.f.药用植物的DNA条形码序列。方法对4种14份千斤拔属药用植物的ITS2、rbc L、psb A-trn H序列进行扩增和测序,同时查找NCBI数据库中千斤拔属植物的相应序列,共计7种20份,比较不同序列的扩增效率及测序成功率,并对其进行种内、种间变异分析,barcoding gap检验及NJ聚类图分析,以评估不同序列对千斤拔属植物的物种鉴别能力。结果测序成功率方面,ITS2与rbc L序列对所分析样品的测序成功率为100%,psb A-trn H的测序成功率为85.71%;3条序列中,只有ITS2在barcoding gap检验中具有显著gap;从NJ聚类图来看,ITS2可明显区分千斤拔属植物的不同物种(除F.philippinensis与F.stricta外)。结论 ITS2序列能准确鉴别千斤拔属药用植物,可作为千斤拔药材基原植物鉴定的条形码序列。     

枸杞属植物中甜菜碱类物质功能价值研究进展与产业化展望

世界范围内枸杞属植物有80余个生物种,我国有7个生物种、3个变种。宁夏枸杞是主产于我国西北地区大宗药食同源资源性植物。甜菜碱是《中华人民共和国药典》2020年版规定的枸杞子药材质量控制成分之一,在宁夏枸杞的果实、根、茎、叶中均有分布。甜菜碱类物质是从食物中获取的一类重要的人体营养素,在日常生活及生产中应用广泛,作为枸杞属中的重要资源性物质,其在枸杞属植物中的资源价值尚未被充分挖掘。通过系统梳理甜菜碱类物质在自然界及枸杞属植物中的分布及功能价值,结合国内外专利分析,探讨了甜菜碱类资源性物质在枸杞产业化发展中的应用价值,以期为深入挖掘枸杞产业潜在资源价值和有效延伸枸杞资源产业链提供参考。     

不同地理居群破布叶的psbA-trnH和ITS2序列及其聚类分析

目的探讨破布叶Microcos paniculata不同地理居群间的DNA序列变异与地理分布的关系,为其种质资源评价和基原植物的分子鉴定提供参考。方法对破布叶14个居群14份个体样品以改良的3×CTAB法提取基因组DNA,选择特异的引物扩增ITS2和psb A-trnH序列;PCR扩增产物直接双向测序分析。DNAMAN 8.0软件处理测序数据,MEGA6.0软件计算K2P遗传距离,运用NJ法构建系统聚类树。结果破布叶14个居群的ITS2序列均为462 bp,共检测到14个变异位点,居群间遗传距离0.000 0~0.019 8。除云南景洪居群样本的psb A-trnH序列存在8 bp缺失外,其他13个居群样本的psb A-trnH序列均长387 bp,无变异,居群间遗传距离为0.000 0。结论不同地理居群破布叶的psb A-trnH较ITS2更为保守,二者PCR扩增引物特异性好,扩增效率和测序成功率高,对其药材及基原植物的分子鉴定可采用psb A-trnH为主,ITS2序列为辅的DNA条形码技术。     

基于DNA条形码的芦荟属6种植物的分子鉴定

目的筛选出适合芦荟属6种植物的DNA条形码序列。方法采用试剂盒法提取芦荟属6个品种基原植物的18份样本基因组DNA,应用通用引物扩增其核基因ITS2序列和叶绿体psbA-trnH、rbcL、matK基因序列并进行双向测序,采用Sequencher 4.1.4软件对测序峰图进行校对拼接,应用MEGA 5.0软件分析不同候选序列的特征,计算物种的种内、种间Kimura 2-Parameter(K2P)遗传距离,比较其种内、种间变异的大小,评估序列的条形码间距(barcoding gap),采用邻接法(neighbor-joining,NJ)构建系统聚类树。结果共获得72条序列,ITS2、psbA-trnH、rbcL、matK基因序列各18条,测序成功率均为100%。比对后序列长度为255~723 bp,GC量范围为30.6%~68.2%。psbA-trnH基因序列的最大种内遗传距离均小于最小种间遗传距离,有明显的barcoding gap,ITS2、rbcL、matK序列的种内变异和种间变异有一些重叠,没有明显的barcoding gap。基于psbA-trnH序列的发育树能将芦荟属6个品种完全区分,而其他3个序列在区分这些芦荟属品种时存在模糊鉴定。结论 DNA条形码技术可以准确鉴别芦荟属植物,psbA-trnH序列可以作为鉴别芦荟属植物的优选序列。