中药DNA条形码分子鉴定技术的应用与展望

中药材品种广泛,存在多基原的情况,质量差异较大,使临床用药安全性和有效性难以得到保证。因传统中药鉴定方法的局限性,对准确鉴别多基原中药材带来了一定的挑战。为了保证中药临床用药安全有效可控,中药鉴定学已成为最重要的研究课题之一,也是当前中医药事业急需解决的关键技术要求。DNA基因鉴别是从基因层面对中药材进行快速、准确的鉴定,包括DNA分子标记法、核酸探针杂交法和DNA条形码技术,其中DNA条形码技术应用最为广泛。DNA条形码是利用标准的DNA片段对物种进行鉴定的技术,2015年版《中国药典》收载了DNA条形码技术指导原则,建立了动物类采用细胞色素C氧化酶亚基I(COI)序列为主,转录间隔区间(ITS)2为辅;植物类采用ITS2/ITS为主,叶绿体psb A-trn H为辅的中药材鉴定体系。该技术的广泛应用为中药鉴别提供更高效快速的方法,并且有效地应用于多基原中药材的鉴别中,使中药品种混乱现象得到极大改观。文章首先对DNA条形码技术的原理、目的及意义、标准片段的选择进行介绍,着重阐述该技术在中药鉴定中的应用以及存在的局限性,并提出展望,以期为中药材的鉴定研究提供参考。     

分子鉴定技术在中药中的应用

对近些年来兴起的分子鉴定技术进行了分析总结,主要包括随机扩增多态性DNA(RAPD)、扩增性简单序列重复(ISSR)、限制性内切酶切片段长度多态性(RFLP)、扩增限制性内切酶片段长度多态性(AFLP)、单核苷酸多态性(SNP)、DNA条形码序列分析等技术。从中药材真伪鉴定、中药材正品与替代品鉴定、中药材多基原鉴定和遗传多样性、中药材产地鉴别、中药材年限鉴别5个方面对分子鉴定技术在中药中的应用进展进行了归纳总结,阐述了分子鉴定技术存在的一些问题及其未来的发展方向。     

貂心线粒体mtDNA鉴定及特征分析

 目的探讨貂心肌线粒体DNA(mtDNA)的特征,建立中药利心丸中貂心的分子遗传学鉴定方法。方法从新鲜的貂心组织提取mtDNA,采用DNA限制性内切酶片段长度多态性(mtDNA-RFLP)分析技术和聚合酶链反应(PCR)扩增细胞色素b基因部分序列片段。结果新鲜的貂心组织可提取完整的mtDNA,并能扩增出310 bp大小的Cytb基因,与鸡心脏mtDNA限制性内切酶酶切图谱有差异。结论2种方法可以作为利心丸中貂心物种的区分提供方便有效的分子标记。     

中药材DNA条形码鉴定的基因序列比较

该文综述了中药材DNA条形码的研究现状,在此基础上分析了叶绿体基因和核基因在中药材系统进化及鉴定中的优缺点。ITS序列在植物中进化速率较快,适合属、种等较低分类阶元的系统关系研究,而ITS2更适合于中药材的鉴定。因此,中药材系统进化与鉴定研究应当根据研究问题选择相应DNA条形码序列。随着测序成本不断下降,叶绿体全基因组条形码在药用植物鉴定中的应用将更卓有成效。     

我国药用动物分子遗传标记鉴别研究进展

药用动物是中国重要的中药资源,在中药市场、药品及临床上得到广泛的应用。但目前动物类药材鉴定工作尚面临着一定的困难。在生物技术不断进步和日益成熟的今天,利用分子遗传标记鉴定药用动物成为了可能。目前DNA分子标记技术已有数十种,限制性片段长度多态性（RFLP）标记、随机扩增多态性DNA（RAPD）标记、微卫星DNA（SSR）标记、线粒体DNA（mitochondrial DNA,mtDNA）标记等几种是在药用动物鉴别中较常用的DNA分子标记技术,DNA条形码技术在药用动物鉴别中也得到了很好的应用。     

基因片段的序列分析在中药质量研究中的应用

综述常用于中药质量研究的基因片段，介绍基因片段的序列分析在中药品种鉴定资源评价、亲缘关系及中药材道地性研究中应用的进展，为中药在基因水平的更深、更系统的研究及药用动植物的开发和可持续利用提供资料，常用于中药研究的DNA基因片段，主要包括叶绿体DNA、核DNA、线粒体DNA三大类。基因片段的序列分析在中药质量研究中初步显示了优越性，也向我们提出了许多新的课题。     

基于DNA条形码技术的中药小蓟基原植物的分子鉴定

目的:对中药小蓟的基原植物进行分子鉴定,以确保药材质量及其临床疗效。方法:以核基因ITS2片段及叶绿体基因片段psbA-trnH作为DNA条形码,对研究材料进行PCR扩增并双向测序,所得序列经CodonCode Aligner拼接后,用软件MEGA4.0进行相关数据分析,并构建NJ(邻接)树。结果:所研究的刺儿菜复合体样本的ITS2序列间存在明显差异,psbA-trnH序列间也存在稳定差异,基于ITS2序列及psbA-trnH序列构建的邻接(NJ)树可以看出大刺儿菜与小刺儿菜不同样本均能聚为独立一支,表明中药小蓟的基原植物刺儿菜复合体确为两个独立的物种。结论:ITS2和psbA-trnH序列作为DNA条形码可以有效地区分和鉴别物种,在中药原植物物种分类与中药鉴定方面具有广阔的应用前景。     

DNA指纹图谱与测序技术在中药品质鉴定中的研究概述

DNA指纹图谱可从分子水平对中药材的种质进行准确的鉴定。文章介绍了随机扩增多态性DNA技术、限制性片段长度多态性分析技术、mRNA差异显示技术、微卫星DNA技术、单核苷酸多态性技术在中药品质鉴定的应用。     

基于DNA条形码的藤类药材鉴定

目的:对《中国药典》中记载的14种藤类药材进行分子鉴定。方法:以核基因ITS2片段作为DNA条形码,对研究材料进行PCR扩增并双向测序,所得序列经CodonCode Aligner拼接后,用软件MEGA4.0进行相关数据分析,并构建NJ(邻接)树。结果:14种藤类药材的ITS2序列长度为190-284 bp;各药材种内K2P遗传距离为0-0.053,远远小于种间K2P遗传距离(平均值为0.852,最小值为0.309);由所构建的系统聚类树图可以看出,本研究中具有不同产地来源样品的药材均表现出了单系性,同时又与其它药材明显分开。结论:ITS2序列作为条形码适用于鉴定《中国药典》中藤类药材,在中药材的鉴定领域具有重要的应用前景。     

金银花中几种分子的真伪鉴别方法比较及其研究进展

中药材的真伪对于中医临床用药具有至关重要的作用。作为中药鉴定的重要组成部分,DNA分子标记技术已越来越广泛地应用于中药材的真伪鉴别。近年来,涌现出许多中药分子鉴定新方法,但对于这些新方法的系统比较分析尚未见报道。本文以药材金银花真伪鉴别为例,比较了表达序列标签-简单重复序列多态性、聚合酶链式反应-限制性酶切长度多态性、位点特异性PCR、DNA条形码技术和环介导等温扩增技术的原理、特点、检测方法以及检测时间和应用范围等,并针对各方法的缺陷提出相应的改进措施,以期筛选到适合金银花快速真伪鉴别的方法,也为其他中药材分子鉴别研究提供示范。     

DNA条形码用于动物类中药鉴定的应用与展望

对DNA条形码技术的概念与特点、基因的标准与鉴别原理、操作步骤与分析方法及建立动物类中药DNA条形码鉴定新平台进行综述,对该技术在动物类中药鉴定中的应用前景进行展望。     

动物类中药DNA条形码鉴定研究进展

DNA基因鉴定是近年来应用在中药鉴定中较为重要的分子生物技术,该技术能够很好地从基因层面上鉴别药材,具有较高的准确性。DNA基因鉴定包括DNA分子遗传标记,核酸探针杂交,DNA条形码分子鉴定法等,其中发展最快的为DNA条形码分子鉴定法。DNA条形码分子鉴定法是利用基因组中一段公认的、相对较短的DNA序列来进行物种鉴定的一种分子生物学技术,是传统形态鉴别方法的有效补充。由于不同物种的DNA序列是由腺嘌呤(A),鸟嘌呤(G),胞嘧啶(C),胸腺嘧啶(T)4种碱基以不同顺序排列组成,因此对某一特定DNA片段序列进行分析即能够区分不同物种。Hebert等在2003年提出了通过测定线粒体细胞色素C氧化亚基I(COI)基因序列来鉴定动物的种类。陈士林等则在大量实验的基础上提出了鉴别动物的基因以COI基因为主,ITS2基因为辅的动物类药材DNA条形码鉴定体系。大量的实验表明,通过DNA条形码来鉴别动物具有准确性、可行性、简便性、通用性,为鉴别动物物种及发现新物种提供了新的方法,为鉴别动物药材的真伪提供了科学的依据。但由于该技术是通过基因进行鉴定,对实验材料及提取方法有较高要求,对一些年代较久的动物药材,其DNA降解较为严重,为DNA提取技术提出了较高的要求;该技术只能鉴别其来源是否准确却不能鉴别其药用部位是否准确,这就需要结合其他鉴别方法来准确鉴别其药用部位。本文通过综合国内外对DNA条形码的研究,为日后的研究和应用提供理论依据。     

基于COI条形码序列的《中国药典》动物药材鉴定研究

药用动物是我国中药资源的重要组成部分,线粒体COI 基因被公认为动物界中标准的DNA 条形码基因,但利用此技术系统研究药用动物或动物药材鉴定的报道不多。本研究选取药典中45 个动物药材,涉及基原物种51 种,分析样品COI 序列的种内种间变异情况,barcoding gap,鉴定效率等,考察COI 序列鉴定动物药材的有效性和准确性。结果表明,种间变异最小值远大于种内变异最大值,barcoding gap 图显示种间变异和种内变异重合较少,鉴定效率较高,除节肢动物门外,在物种水平和属水平上,鉴定效率均为100%,所构建的动物药材及其混伪品的NJ 树能很好地区分正品来源与其混伪品。因此COI 序列作为DNA 条形码适用于药典中动物药材的鉴定。本研究为COI 条形码准确鉴定药典中动物药材提供了分子依据,扩充了DNA 条形码数据库中药用动物序列,并建立了利用此技术鉴定动物药材的具体技术流程。     

中国动物药材DNA条形码数据库

课题组联合相关研究者开展动物药材DNA条形码分子鉴定研究,并结合分析GenBank序列,采用BLAST分析防错、系统树分析防错和Barcoding Gap检验防错等方法核验序列的可靠性,构建了中国动物药材DNA条形码数据库。该库由样品数据库、序列数据库和文献数据库组成,包含800余种动物药材和大量动物药材混伪品及密切相关物种。中国动物药材DNA条形码数据库可以通过中药材DNA条形码鉴定系统（www.tcmbarcode.cn）进行网络访问并实现未知动物样本的DNA条形码鉴定。该研究首次构建统一的中国动物药材DNA条形码数据库,对动物药材鉴定、资源可持续利用和濒危物种保护均有重要意义。     

夹竹桃科DNA条形码的初步筛选

DNA条形码(DNA barcoding)是一种新的物种鉴定技术,COI序列已成功应用于动物的鉴定,但目前国际上还没有找到一个通用序列能鉴定所有植物物种。为探索适合于夹竹桃科植物DNA条形码序列,拟用matK、ITS2、ITS 3个常规引物序列对夹竹桃科5个属的部分植物进行基因序列对比分析,并运用MEGA 7.0构建系统进化树进行系统发育分析、鉴定其亲缘关系。结果显示在ITS2、ITS、matK 3个引物序列中,只有matK引物序列能正常扩增目的基因,扩增成功率达到100%,并且该引物序列对比分析和系统发育树的聚类结果与传统分类学的鉴定结果一致。建议将matK序列作为夹竹桃科DNA条形码鉴定候选序列之一。     

DNA条形码技术鉴定一种植物样品的研究

目的：对一种未知的破碎的植物样品进行品种鉴定。方法：综合采用性状鉴定、显微鉴定、DNA条形码鉴定等方法,DNA条形码鉴定经过DNA提取、PCR扩增、测序,对ITS序列数据经Blast比对法、特异位点法、系统发育法三种方法进行分析。结果：该未知样品为伞形科植物茴香Foeniculum vulgare Mill. 去掉果皮的种子。结论：中药鉴定技术能够解决实际工作中的未知样品品种鉴定问题,DNA条形码技术为中药鉴定提供一种新的方法,在未知样品的鉴定中发挥重要的参考作用。     

中药材DNA条形码分子鉴定指导原则

随着中药材DNA条形码分子鉴定方法研究的深入与普及,国家药典委员会讨论通过在《中国药典》增补本中列入中药材DNA条形码分子鉴定指导原则,该指导原则通过对大样本量中药材进行DNA条形码分子鉴定研究,建立以ITS2为核心,psbA-trnH为辅的植物类药材DNA条形码鉴定体系和以COI为主、ITS2为辅的动物类药材DNA条形码鉴定体系.该文介绍了中药材DNA条形码分子鉴定指导原则及其起草说明,并对该原则在中药材鉴定方面的应用前景进行展望.     

基于COI 条形码序列的蛤蚧及其混伪品的DNA 分子鉴定

目的：利用COI 序列对蛤蚧药材及其常见混伪品进行DNA 条形码鉴定,为蛤蚧药材鉴定提供新的方法。方法：以COI 作为条形码序列,对蛤蚧实验样品进行DNA 提取,PCR 扩增和双向测序,用MEGA6.0 对所有11 个物种的103 份样品进行序列比对和邻接（NJ）树构建。结果：所有实验样品均可以获得COI 序列,蛤蚧COI 序列种内平均K2P 距离为0.005,种内最大K2P 距离为0.013,基于COI 序列构建的NJ 树中蛤蚧单独聚在一支,与其混伪品可以相互区分。结论：运用COI 条形码序列能够准确鉴定蛤蚧及其混伪品,为保障蛤蚧药材临床用药安全和市场监管提供新的方法。