布鲁氏菌的脂肪酸分型研究

目的探索脂肪酸分型方法对布鲁氏菌进行分型的可能性。方法选择90株布鲁氏菌经化学方法提取菌体脂肪酸后,用气相色谱分析,获得布鲁氏菌脂肪酸成分的数据资料。并利用SPSS11.5统计软件对获得的数据资料进行聚类分析。结果布鲁氏菌脂肪酸分型方法将90株布鲁氏菌分为5组:第1组为部分牛种菌;部分羊种菌;部分猪种菌;部分绵羊附睾种;部分变异牛种;部分变异羊种;沙林鼠种标准株。第2组为猪种1、2、3、5型标准株和疫苗株S2;羊种疫苗株M28和Rev.1;绵羊附睾种标准株。第3组为部分羊种;部分变异羊种菌;部分牛种3型和6型;犬种;部分绵羊附睾种。第4组为犬种菌标准株。第5组为部分羊1型;部分变异羊种;部分牛1型;部分猪1型和3型。结论依据布鲁氏菌菌体脂肪酸含量差异可以对布鲁氏菌进行分型;依据19∶0CYCLOω8c,18∶1ω7c,16∶0三种脂肪酸含量差异可以区分猪种布鲁氏菌和犬种布鲁氏菌;脂肪酸分型结果进一步提示犬种布鲁氏菌不只1个生物型;脂肪酸分型结果进一步证实牛3型和牛6型布鲁氏菌高度同源。     

布鲁氏菌强毒株16M和疫苗株M5差异探索

目的探索布鲁氏菌强毒株16M和疫苗株M5之间的差异。方法用气相色谱测定两株菌的脂肪酸组成,用脉冲场凝胶电泳方法电泳两株菌的DNA酶切产物,寻找两者在脂肪酸组成和酶切电泳图谱上的差异。结果两株菌在脂肪酸的种类上一致,但含量有差异,强毒株16M脂肪酸16∶0含量较疫苗株M5高10%左右,而脂肪酸19∶0CYCLOω8c较疫苗株M5低15%左右。脉冲场凝胶电泳图谱显示在167.1kb和138.9kb之间强毒株16M比疫苗株M5多出一个条带。结论脂肪酸分析和脉冲场凝胶电泳技术都可以用于鉴别布鲁氏菌强毒株16M和疫苗株M5。     

云南鼠疫耶尔森氏菌脂肪酸成分分析

目的利用脂肪酸成分分析方法获得云南鼠疫耶尔森氏菌菌株脂肪酸组成的本底资料,并建立云南鼠疫耶尔森氏菌菌株的数据库。方法选择历年来从云南不同疫源地分离到的146株鼠疫耶尔森氏菌进行了菌体脂肪酸成分分析。结果云南鼠疫耶尔森氏菌菌株的主要脂肪酸成分为16∶0酸,环式17∶0酸,3羟基14∶0酸和ω7 c16∶1酸以及十八碳单烯酸,与宋亚军等的分析结果一致,与M ID I公司Sherlock系统的菌库中的数据存在一些差异。结论建立云南鼠疫耶尔森氏菌菌株的脂肪酸组成数据库。     

2018年江苏省人感染布鲁氏菌分离株分子特征分析

目的 掌握江苏省2018年人感染布鲁氏菌主要流行株的种型和基因型。方法 运用普通PCR及AMOS多重PCR确认分离株的生物种型;采用多位点序列分型(Multilocus sequence analysis, MLSA)和多位点串联重复序列分析(Multiple-locus variable number tandem repeat analysis, MLVA)鉴定基因型,并与国内外流行株进行聚类分析。结果 2018年共分离到56株布鲁氏菌,MLSA分型显示一株菌为猪种布鲁氏菌ST (Sequence type)17型,其他均为羊种布鲁氏菌ST8型。MLVA将56株菌分为47个基因亚型(46个羊种,1个猪种),聚类显示羊种布鲁氏菌全部为“东地中海簇”。结论 2018年江苏省人感染布病主要为“东地中海簇”的ST8型羊种布鲁氏菌,并首次发现一例人感染ST17型猪种布鲁氏菌。     

2018-2019年福建省人感染布鲁氏菌分离株种型鉴定及分子特征分析北大核心CSCD

目的探讨福建省人感染布鲁氏菌分离株主要流行株的种型和分子特征,为制定预防控制策略提供依据。方法将布鲁氏菌分离株转种培养并提取基因组DNA,采用传统生物学鉴定和BCSP31-PCR、AMOS-PCR、MLST及MLVA-16等方法进行布鲁氏菌分离株分子鉴定和分型,通过Bionumerics 6.6软件对其进行聚类分析。结果2018-2019年福建省人感染布鲁氏菌22株分离株分子检测结果与传统分型基本相符,为2个种(羊种和猪种)和2个生物型(羊3型和猪3型),其中羊种布鲁氏菌占多数(95.45%);20株布鲁氏菌分离株MLST基因型为ST8,1株为ST17型,1株为新的ST型:ST99的gap基因与已报道的等位基因型不同,被定义为一个新的等位基因型gap(32)。MLVA-16分型为羊种和猪种2个种群,21株羊种布鲁氏菌分为17种基因型,1株猪种布鲁氏菌分为1种基因型,其中15种基因型为单分离株,3种基因型为共享基因型(共7株,占31.82%)。聚类分析显示福建分离株与内蒙古、辽宁、山东和广东地区存在4种共享基因型,均为羊种布鲁氏菌,其他部分菌株与外省菌株遗传距离较近。结论福建省布鲁氏菌主要流行株为ST8型,且MLVA-16分型显示呈高度基因多样性。MLST/MLVA作为传统生物学鉴定补充技术方法,可用于布鲁氏菌遗传多样性分析和分子流行病学溯源调查,以提高布鲁氏菌病监测能力。     

2018-2019年福建省人感染布鲁氏菌分离株种型鉴定及分子特征分析

目的探讨福建省人感染布鲁氏菌分离株主要流行株的种型和分子特征,为制定预防控制策略提供依据。方法将布鲁氏菌分离株转种培养并提取基因组DNA,采用传统生物学鉴定和BCSP31-PCR、AMOS-PCR、MLST及MLVA-16等方法进行布鲁氏菌分离株分子鉴定和分型,通过Bionumerics 6.6软件对其进行聚类分析。结果 2018-2019年福建省人感染布鲁氏菌22株分离株分子检测结果与传统分型基本相符,为2个种(羊种和猪种)和2个生物型(羊3型和猪3型),其中羊种布鲁氏菌占多数(95.45%);20株布鲁氏菌分离株MLST基因型为ST8,1株为ST17型,1株为新的ST型:ST99的gap基因与已报道的等位基因型不同,被定义为一个新的等位基因型gap(32)。MLVA-16分型为羊种和猪种2个种群,21株羊种布鲁氏菌分为17种基因型,1株猪种布鲁氏菌分为1种基因型,其中15种基因型为单分离株,3种基因型为共享基因型(共7株,占31.82%)。聚类分析显示福建分离株与内蒙古、辽宁、山东和广东地区存在4种共享基因型,均为羊种布鲁氏菌,其他部分菌株与外省菌株遗传距离较近。结论福建省布鲁氏菌主要流行株为ST8型,且MLVA-16分型显示呈高度基因多样性。MLST/MLVA作为传统生物学鉴定补充技术方法,可用于布鲁氏菌遗传多样性分析和分子流行病学溯源调查,以提高布鲁氏菌病监测能力。     

广东省布鲁氏菌分离株的分子特征分析

目的了解广东省布鲁氏菌分离株的分子特征。方法应用传统分型鉴定方法和PCR扩增布鲁氏菌属特异性基因BCSP31,对广东省历年布鲁氏菌分离株作鉴定分型,进一步采用脉冲场电泳技术(PFGE)进行分子分型,分析比较菌株分子指纹图谱的相似性,以探讨不同年份和地域菌株之间的相关性。结果1965年广东省布鲁氏菌分离株以羊种和猪种为主,1985年的分离株均为猪种3型,2006和2007年的分离株均为羊种3型;PFGE电泳图谱经聚类分析结果显示,历年布鲁氏菌分离株分成三大簇(Clusters):1965年羊种、1965年猪种与1985年猪种3型、2006年和2007年羊种3型。近两年珠三角地区布鲁氏菌病的流行优势菌型为羊种3型,且同源性达100%,但与1965年羊种分离株的同源性只有77.7%。结论近两年我省布鲁氏菌的优势菌型为羊种3型,各地区分离株之间的遗传关系高度相关,与20年前的分离株同源性差。PFGE可作为传统生物分型的补充手段,可在种的水平对布鲁氏菌分离株分型。     

内蒙古布鲁氏菌临床分离株多位点序列分型研究

目的探讨临床分离布鲁氏菌的种群结构和遗传进化特征。方法布鲁氏菌标准参考菌株羊种16M,牛种544A和猪种1 330 S作为对照菌株,采用多位点序列分型(Multiple locus sequence typing,MLST)方法对内蒙古地区分离的116株羊种布鲁氏菌进行分析,确定待测菌株的序列型(STs),用软件BioNumerics(Version 5.0)构建菌株的最小生成树。结果116株羊种布鲁氏菌全部为ST8型,9个MLST位点的变异完全相同,分离株种群结构单一;羊种菌的生物型与ST型无明显关联,ST8型菌系该地区的主要流行菌种,并与内蒙古地区先前分离羊种布鲁氏菌进化程度相同,且有密切的亲缘关系。结论羊种布鲁氏菌的序列分型(ST)与常规生物分型存在差异,ST8型菌可能具有较强的环境适应性和致病性。MLST是一种较好的羊布鲁氏菌种群和进化关系研究方法,但更适合于具有较大时间跨度和地理分布菌株间的流行病学调查。     

福建省2008-2017年人间布鲁氏菌病流行特征及分离株MLVA分型研究

目的 探讨福建省人间布鲁氏菌病流行特征,并对其分离株进行分子分型,为制定预防控制策略提供依据。方法 收集中国疾病预防控制信息系统中2008-2017年福建省布鲁氏菌病报告数据,进行流行特征分析;采用传统生物学鉴定和BCSP31-PCR、AMOS-PCR、MLVA-16进行布鲁氏菌分离株分子鉴定和分型,并进行聚类分析。结果 福建省2008-2017年布鲁氏菌病发病呈逐年上升趋势,年均发病率0.11/10万;疫情波及福建省80%的县区,呈高度散发态势;发病高峰为4-8月;40~64岁发病数占62.7%,60~64岁组发病率最高(0.27/10万);男女比为2.50:1,农牧民占50.7%。40株布鲁氏菌分离株分子检测结果与传统分型基本相符,为2个种(羊种和猪种)和2个生物型(羊3型和猪3型),其中羊种布鲁氏菌占绝大多数(87.5%); MLVA-16分型将其分为羊种和猪种2个种群,35株羊种菌分为28种基因型,5株猪种菌分为4种基因型,其中26种基因型为单分离株,6种基因型为共享基因型(共14株,35.0%)。同国内147株布鲁氏菌进行聚类分析显示,福建省菌株与广东和内蒙古地区存在4种共享基因型,均为羊种菌,其他部分菌株与外省菌株存在着较近的遗传距离,主要集中在panel 2B上,仅存在1~3个位点的差异。结论 福建省布鲁氏菌病流行强度逐年增高,建议相关部门加强传染源的管控、对疫情高发地区的重点人群采取必要防控措施,控制其发生与流行。福建省布鲁氏菌MLVA-16分型显示高度基因多态性,提示MLVA-16可用于遗传多样性分析和分子流行病学溯源调查,可以提高布鲁氏菌病监测能力。     

结核分枝杆菌全细胞C_9～C_(20)脂肪酸成份分析

目的分析结核分枝杆菌全细胞脂肪酸的种类与数量构成,以进一步揭示其生物学特征,为结核分枝杆菌的其它基础研究提供依据。方法应用Middlebrook 7H10琼脂培养基对临床分离培养的初代分枝杆菌培养物进行纯培养,对被鉴定为结核分枝杆菌的87株及结核分枝杆菌标准株H37Rv、H37Ra各1株应用气相色谱技术、采用峰面积归一化法定量分析碱处理细菌细胞释放出来并甲基化的细胞脂肪酸。结果1.各菌株均含有C14:0、C16:0、C18:0、C18:1ω9、10-Me-C18:0脂肪酸,其平均相对含量分别为:2.08%、39.78%、10.09%、21.21%和14.17%。C15:0、C16:1ω6、C17:0、C20:0脂肪酸为90%以上菌株含有组分,其平均相对含量分别为:1.15%、4.07%、2.91%和1.38%。C12:0、C16:1ω9、C16:1ω7、8-Me-C16:0、10-Me-C16:0、C17:1ω7、C17:1ω8为含量少且为只有部分菌株具有的细胞脂肪酸组分。所有菌株均不含C9、C10、C11、C13、C19脂肪酸。2.临床分离株脂肪酸的相对含量构成与H37Rv接近,而与H37Ra有较大差别。结论在C9~C20脂肪酸中,结核分枝杆菌主要含有C16:0、10-Me-C18:0、C18:0饱和脂肪酸与C18:1ω9、C16:1ω不饱和脂肪酸,并提示脂肪酸的组成特征可能与结核分枝杆菌毒力有关。     

广东地区空调冷却塔水嗜肺军团菌分离株脂肪酸分型研究

目的探讨脂肪酸分析方法在种水平上对嗜肺军团菌的判断能力;将脂肪酸分型方法与传统的血清分型方法进行比较,了解不同血清型嗜肺军团菌株脂肪酸成分的异同。方法选取近3年从广东地区空调冷却塔水中分离到的112株嗜肺军团菌分离株,提取脂肪酸,利用MIDI公司Sherlock系统进行菌体脂肪酸成分分析,使用SPSS 13.0软件对获得的数据资料进行统计分析及聚类分析。结果脂肪酸分析法判定嗜肺军团菌的符合率为84.8%,所有菌株共有的脂肪酸成分有9种,主要脂肪酸成分有4种,分别为16∶0 iso、15∶0 anteiso、16∶1 w7c和14∶0 iso脂肪酸。血清1型菌株与血清6、7型菌株相比,有3种主要脂肪酸含量差异有统计学意义(P<0.05)。结论可以依据菌体脂肪酸分析方法对嗜肺军团菌进行快速鉴定;嗜肺军团菌菌株的脂肪酸成分稳定,但各血清型间脂肪酸含量存在一定差异;MIDI数据库中军团菌脂肪酸数据仍有待完善。本研究同时提供了广东地区空调冷却塔水嗜肺军团菌株脂肪酸组成及分型数据。     

2019年广东省梅州市首起人间布鲁氏菌病暴发疫情的调查

目的 分析广东省梅州市五华县暴发的一起人间布鲁氏菌病的流行及溯源情况,为布病防治提供科学依据。方法 采用描述性流行病学方法对广东省梅州市五华县发生的布鲁氏菌病疫情进行分析; 应用分子生物学方法对血液及羊奶样品中的布鲁氏菌进行检测。根据AMOS-PCR和血清凝集试验等方法对分离菌株进行种型鉴定,并采用MLST技术对分离菌株进行种间遗传关系分析。结果 在血液及羊奶样品中均检测到布鲁氏菌Omp22和16S rRNA基因。全血样品中共分离到14株布鲁氏菌,且均为羊种3型布鲁氏菌。经MLST技术聚类分析后,14株羊种布氏菌分离株与11株各生物种型标准株间的相似值介于82.0%~100.0%。结论 广东省梅州市五华县暴发的人间布鲁氏菌病疫情,其引起该病的主要原因是生饮鲜羊奶所致,这为广东地区布鲁氏菌病的防控提供了有利的数据。     

PCR-HRM方法快速鉴定布鲁氏菌的初步应用

目的 本研究旨在建立准确、快速地鉴定布鲁氏菌菌种及生物分型的PCR-HRM(高分辨率熔解曲线)方法。方法 根据目的基因序列,参考文献合成6对基因扩增引物(1对布鲁氏菌属特异引物,5对种间特异引物),应用PCR-HRM方法鉴定布鲁氏菌属6个种19个生物型的标准菌株,并初步应用到临床分离的35株布鲁氏菌中。结果 采用布鲁氏菌属特异引物(Bspp),6个种19个生物型的标准菌株均扩增出同样形状的溶解曲线,与其它对照菌株的曲线不同;采用5对种特异引物,6个种的标准菌株均有特征性PCR-HRM曲线;临床分离的35株布鲁氏菌的PCR-HRM曲线与羊种布鲁氏菌标准菌株的一致。结论 该研究采用的PCR-HRM分析方法,获得了布鲁氏菌属及6个种标准菌株的不同曲线图,可准确鉴定临床分离的羊种布鲁氏菌,可用于临床微生物实验室疑似布鲁氏菌感染的初步鉴定。     

多位点序列分型在新疆人间布鲁氏菌病临床分离株遗传进化研究中的应用

目的 探讨多位点序列分型(MLST)技术在新疆人间布鲁氏菌病分离株遗传进化研究中的应用价值,了解分离株的种群结构和遗传进化关系。方法 采用MLST对2015、2016年分离自新疆7个地州的24株人间布鲁氏菌病分离株和3株布鲁氏菌标准参考菌株进行分析,统计各菌株序列型(STs),运用BioNumerics软件构建菌株最小进化树,分析菌株间遗传关系;收集过往研究的186株全国不同地区布鲁氏菌分离株MLST结果,分析各ST型分布特点。结果 24株人间布鲁氏菌分离株全部为ST8型,3株标准参考菌株(羊种16M、牛种544A、猪种1330S)分别为ST7型、ST1型、ST14型;24株人间布鲁氏菌分离株的9个MLST位点变异完全相同,分离株种群结构单一。ST8型菌是我国主要流行的布鲁氏菌,且以北方流行为主;MLST能较好的区分布鲁氏菌种别,但不能有效区分生物型别。结论 ST8型菌(羊种3型)是新疆人间布鲁氏菌病的主要流行菌株,MLST技术可作为人间布鲁氏菌种群结构和遗传进化关系研究的补充手段。     

布氏菌分离株16SrDNA基因遗传进化分析

目的检测内蒙古布氏菌临床分离株的16SrDNA基因序列,构建16SrDNA遗传进化树,确定该菌株的分类地位。方法用BCSP31-PCR对临床分离株检测,再进行16SrDNA双向测序;从GeneBank下载标准参考菌株和与布氏菌有共同抗原细菌的16SrDNA基因序列;用Mega6.0进行序列比对并构建遗传进化树。结果BCSP31-PCR结果显示均有223 bp扩增条带,16SrDNA测序得到单一基因序列;比对后发现有4处特异片段,经Blast比对,位于844-1224包括380 bp的片段为布氏菌独有;进化树显示布氏菌临床分离株与标准菌株聚在1个末端分支上,遗传距离接近0,无法精细区分相互关系;与人苍白杆菌聚集在1个亚分支上,遗传距离0.019;与其它试验菌株如霍乱弧菌、小肠结肠炎耶尔菌遗传进化距离较远,遗传距离>0.02。结论从遗传进化角度对布氏菌分离株与标准菌株的亲缘关系进行分析,布氏菌所有种型遗传距离接近,提示布氏菌16SrDNA为高度保守序列,不宜做遗传进化分析的靶基因;布氏菌与人苍白杆菌有较近的亲缘关系;布氏菌属16SrDNA特有的380 bp的基因片段可作为布氏菌快速鉴定的靶序列。     

中国布鲁杆菌插入序列基因多态性的研究

目的分析国内83株布鲁杆菌基因组的插入序列(IS)IS711的遗传多态性。方法提取布鲁杆菌DNA,经内切酶EcoRI酶切、琼脂糖凝胶电泳、Southern转印后,与地高辛标记的IS711探针杂交,以酶免疫试验检测信号,比较布鲁杆菌各株的IS711指纹图谱。结果不同布鲁杆菌菌株在IS711探针杂交图谱上有明显的多态性,根据杂交的条带数及片段大小的差异,83株布鲁杆菌分属15个IS型。以IS10型分布最为广泛,其次是IS3型,其他型别则较分散,有的IS型只存在于某个菌株。结论布鲁杆菌插入序列IS711在基因分布上存在多态性。