三种胰腺癌细胞株Mesothelin的表达及成瘤速度的比较

目的 比较3种人胰腺癌细胞株在体外和裸鼠体内Mesothelin的表达及裸鼠皮下种植瘤生长速度的差异.方法 培养人胰腺癌细胞株SW1990、BxPC3、PANC1,取对数生长期分别注射于裸鼠左腋窝皮下,每周测量裸鼠皮下种植瘤的长、短径,计算体积,SW1990、BxPC3组裸鼠观察3周,PANC1组裸鼠观察5周;用蛋白质印迹法分别检测3种细胞及裸鼠皮下种植瘤组织中的Mesothelin表达,用免疫组化染色检测3种裸鼠皮下种植瘤组织中Mesothelin表达.结果 人胰腺癌细胞株体外Mesothelin表达的强弱顺序是BxPC3＞ PANC1＞ SW1990,体内种植瘤组织表达的强弱顺序是SW1990＞ BxPC3＞ PANC1.3种人胰腺癌细胞种植于裸鼠皮下的成瘤率均为100％,各组肿瘤的生长速度顺序为SW1990＞ BxPC3＞ PANC1.结论 不同人胰腺癌细胞株Mesothelin的表达量不同,裸鼠皮下种植瘤的生长速度亦不同,两者无相关性.     

胰腺癌伴神经浸润动物模型的建立

目的 建立胰腺癌伴神经浸润的动物模型.方法 32只裸鼠分为4组,每组8只.将人胰腺癌细胞SW1990、CAPAN-2、PANC1分别注射于裸鼠的坐骨神经周围,以不做任何处理的裸鼠作为对照组.观察术后裸鼠体质量变化、成瘤情况、成瘤时间、造模成功率等指标.结果 对照组裸鼠体质量增加,各癌细胞注射组裸鼠成瘤后体质量明显下降,甚至呈现恶液质,成瘤侧肢体活动受限.CAPAN-2注射组及SW1990注射组的8只裸鼠最终均成瘤,PANC1注射组只有5只成瘤.以肿瘤最长径长至约0.8 cm为时间截点,CAPAN-2注射组、PANC1注射组、SW1990注射组裸鼠的成瘤时间分别为（49.8±5.0）、（56.6±2.4）、（25.4±3.0）d.SW1990注射组成瘤时间最短,PANC1注射组成瘤时间最长,3组间成瘤时间的差异具有统计学意义（F=73.51,P＜0.01）.CAPAN-2注射组、PANC1注射组、SW1990注射组裸鼠神经浸润造模成功率分别为87.5％ （7/8）、20.0％（1/5）、50.0％ （4/8）.结论 成功建立了胰腺癌伴神经浸润动物模型,但不同的胰腺癌细胞系建立的动物模型具有不同的特点.     

MMI-166对人胰腺癌SW1990细胞凋亡及其相关蛋白表达的影响

目的 观察MMI-166对人胰腺癌SW1990细胞及其移植瘤组织凋亡相关蛋白表达的影响,探讨其可能机制.方法 应用人胰腺癌细胞株SW1990建立裸鼠胰腺癌皮下移植瘤模型,按完全随机法将荷瘤裸鼠分为对照组和MMI-166组,分别给予口服生理盐水和MMI-166(200 mg·kg-1·d-1),持续28 d.采用TUNEL法和蛋白质印迹法检测移植瘤组织的细胞凋亡指数(AI)及p53、c-Myc、Bax、Bcl-2、Survivin、Caspase-1、Fas蛋白的表达.应用不同浓度(0、50、100 μg/ml) MMI-166作用于人胰腺癌SW1990细胞24 h,蛋白质印迹法检测c-Myc、Survivin的表达.结果 MMI-166组移植瘤组织的AI为81.1±7.9,显著高于对照组的21.3±2.2 (P =0.000);c-Myc、Survivin的表达量分别为7715±2229、4594±1240,显著低于对照组的16870±2446、15208±1903(P值均为0.000);p53、Bax、Bcl-2、Caspase-1、Fas的表达与对照组比较无显著变化.50、100 μg/ml的MMI-166处理后,人胰腺癌SW1990细胞的c-Myc表达量显著下调(0.098±0.003、0.073±0.008比0.169±0.007,F=189.361,P＜0.05);Survivin 的表达量无明显变化.结论 MMI-166可能通过下调c-Myc的表达诱导人胰腺癌SW1990细胞凋亡.     

STAT3基因沉默对人胰腺癌SW1990细胞的裸鼠移植瘤生长的影响

目的 观察信号转导与转录激活因子3（STAT3）基因表达沉默后对人胰腺癌SW1990细胞的裸鼠移植瘤生长的影响,探讨其机制.方法 构建靶向STAT3短发卡RNA（shRNA）表达载体,稳定转染胰腺癌SW1990细胞（SW1990-RNAi组）,以转染阴性对照shRNA表达载体细胞（SW1990-Con组）及亲本SW1990细胞（SW1990组）作为对照.应用蛋白质印迹法检测各组细胞STAT3、血管内皮生长因子（VEGF）、基质金属蛋白酶2（MMP-2）蛋白的表达.建立各组细胞的裸鼠皮下移植瘤模型,观察移植瘤的生长,应用免疫组化法检测移植瘤的CD34表达,计算肿瘤的微血管密度（MVD）.结果 SW1990组、SW1990-Con组、SW1990-RNAi组细胞的STAT3蛋白表达量分别为84.69±9.31、82.00±7.76、7.93±1.24,VEGF蛋白表达量分别为82.94±8.97、80.86±10.28、39.04±6.23,MMP-2蛋白表达量分别为40.88±5.09、38.26±5.71、12.54±2.15,SW1990-RNAi组均显著低于其他两组（P值均＜0.05）,而SW1990-Con组与SW1990组细胞的3种蛋白表达量差异均无统计学意义.SW1990组、SW1990-Con组、SW1990-RNAi组裸鼠移植瘤的重量分别为（2.2±0.4）、（2.2±0.3）、（0.5±0.3）g,瘤组织的MVD分别为每高倍视野（20.35±2.41）、（18.79±1.94）、（9.62±1.06）个,SW1990-RNAi组均显著低于其他两组（P值＜0.05或＜0.01）,而SW1990组与SW1990-Con组间的差异均无统计学意义.结论 STAT3基因表达被抑制后SW1990细胞的裸鼠移植瘤生长减缓,其机制可能是通过下调VEGF及MMP-2的表达、抑制肿瘤血管形成所致.     

雷公藤内酯醇抑制胰腺癌细胞生长及血管生成的实验研究

目的 探讨雷公藤内酯醇(TL)对胰腺癌细胞生长及肿瘤新生血管生成的抑制作用.方法 采用CCK-8试剂盒检测TL对胰腺癌SW1990细胞的生长抑制作用;采用TUNEL法检测TL对细胞凋亡的诱导作用;观察尾静脉注射TL对裸鼠移植瘤生长抑制作用和对瘤组织VEGF表达、微血管密度(MVD)的影响.结果 TL呈浓度和时间依赖性抑制SW1990细胞增殖,160 mg/ml的TL干预SW1990细胞24 h,细胞抑制率达50.6%,细胞凋亡率从对照组的9.6%升高到45.1%(P<0.01);TL0.5 mg/kg体重瘤内注射对移植瘤的抑瘤率达89.9%,瘤组织VEGF表达减少,MVD从36.25±8.64减少到9.87±3.34(P<0.01).结论 TL可显著抑制胰腺癌细胞增殖并诱导细胞凋亡;通过抑制肿瘤新生血管生成可抑制裸鼠SW1990细胞移植瘤的生长.     

胰腺癌细胞株原钙黏附蛋白8基因的甲基化状态

目的 分析原钙黏附蛋白8(protocadherin 8,PCDH8)基因在胰腺癌细胞株的甲基化状态.方法 抽提6株胰腺癌细胞株PANC1、ASPC1、BxPC3、CFPAC、PaTu8988、SW1990和2例正常胰腺组织的总RNA,以甲基化特异性PCR(MSP)法检测PCDH8甲基化情况.应用DNA甲基化转移酶(DNMT)抑制剂5-氮杂2'-脱氧胞苷(5-Aza-dC)处理6株胰腺癌细胞株,采用实时定量PCR法检测处理前后细胞的PCDH8 mRNA表达.结果 2例正常胰腺组织PCDH8基因未发生甲基化,PANC1、BxPC3、CFPAC胰腺癌细胞株PCDH8基因部分甲基化,而PaTu8988、ASPC1、SW1990细胞完全甲基化.PCDH8mRNA在PANC1、SW1990、PaTu8988胰腺癌细胞株中有表达,表达的相对值(RQ)分别为1.576±0.648、0.013±0.008、0.002±0.001;BxPC3、CFPAC、ASPC1细胞株无PCDH8 mRNA表达.5-Aza-dC处理后,胰腺癌细胞株PANC1、ASPC1、BxPC3、CFPAC、PaTu8988、SW1990均有PCDH8 mRNA表达,表达量较处理前明显升高,相对表达量分别为7.463±2.628、10.696±1.539、7.852±2.762、421.815±1.493、118.595±4.089、6.690±1.884.结论 PCDH8基因启动子高甲基化是导致该基因在胰腺癌细胞株表达下降的主要原因之一.     

Jagged1基因沉默对人胰腺癌细胞SW1990和PANC1血管相关因子分泌及迁移能力的影响

目的 以RNA干扰技术靶向沉默人胰腺癌细胞株Jagged1基因,观察细胞VEGF、Angiopoietin2、bFGF、MMP9的分泌及细胞迁移能力的变化.方法 应用靶向Jagged1的siRNA、对照siRNA(c-siRNA)转染人胰腺癌细胞株SW1990和PANC1,实时PCR法和蛋白质印迹法检测细胞Jagged1 mRNA和蛋白的表达,ELISA法检测细胞培养上清中VEGF、angiopoietin2、bFGF、MMP9的分泌量,Transwell小室观察细胞的迁移能力.结果 SW1990和PANC1细胞均高表达Jagged1基因.15 nmol/L Jagged1 siRNA转染胰腺癌细胞72 h后,SW1990、PANC1细胞的Jagged1 mRNA表达被抑制,分别为c-siRNA组的(59.62 ±2.75)％和(76.96 ±6.16)％,Jagged1蛋白表达几乎完全被抑制.SW1990、PANC1细胞的VEGF分泌量均较c-siRNA组显著减少[(867.93±58.69) pg/ml比(1516.24±37.58)pg/ml,(951.13±120.49) pg/ml比(1413.68±33.56) pg/ml,P＜0.05],但angiopoietin2、bFGF、MMP9蛋白分泌无明显变化.另外,Jagged1 siRNA转染后,SW1990细胞VEGF mRNA表达水平为c-siRNA组的(52.26 ±4.85)％ (P＜ 0.05);PANCI细胞为c-siRNA组的(59.75±4.91)％(P＜0.05).转染后的SW1990和PANC1细胞的穿膜细胞数分别为(65.25±5.56)、(57.50±8.58)个,较c-siRNA组的( 122.25±11.09)、(112.00±12.52)个显著减少(P＜0.05).结论 人胰腺癌细胞高表达Jagged1,沉默Jagged1基因可明显抑制人胰腺癌细胞VEGF的产生和分泌,并且可降低癌细胞的体外迁移能力.     

5-LOX基因沉默对人胰腺癌细胞SW1990裸鼠移植瘤生长的影响

目的 观察裸鼠的人胰腺癌细胞SW1990移植瘤内注射靶向5-脂氧合酶(5-LOX)的短发夹RNA(shRNA)对移植瘤以及瘤组织5-LOX和血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响,探讨其临床应用价值.方法 将胰腺癌细胞SW1990接种至裸鼠背部皮下,待移植瘤生长至100 mm3左右后随机分为shRNA1组、shRNA2组、阴性对照shNC组和脂质体组.每组6只,雌雄各半.实验组瘤内注射相应shRNA 50μg/次,1次/3 d,共7次.对照组瘤内注射脂质体液100 μl/只.每3 d测体重及移植瘤长、短径一次.第29天处死动物,取肿瘤组织,称瘤重.应用免疫组化和RT-PCR法检测移植瘤组织5-LOX、VEGF的mRNA和蛋白的表达.结果 shRNA1组、shRNA2组、shNC组和脂质体组的瘤重分别为(32.5±19.0)mg、(30.1±14.1)mg、(50.5±15.6)mg和(71.7±25.4)mg,shRNA1组、shRNA2组、shNC组抑瘤率分别为54.7%、58.0%和29.5%,shRNA1组、shRNA2组较shNC组和脂质体组相差显著(P值均＜0.05).shRNA1组和shRNA2组移植瘤的5-LOX、VEGF mRNA和蛋白的表达较shNC组和脂质体组均显著减少,但两治疗组之间未见明显差异,shNC组和脂质体组之间也无明显差异.结论 靶向5-LOX的RNA干扰治疗通过直接抑制5-LOX的表达、间接抑制VEGF的表达而抑制SW1990裸鼠移植瘤的生长.     

胰腺癌细胞株HOXA7基因表达及其启动子区甲基化状态

目的 检测HOXA7 mRNA在胰腺癌细胞株中的表达及其启动子区的甲基化状态,探讨两者的相关性.方法 采用RT-PCR法检测人胰腺癌细胞株BxPC3、CFPAC1、PANC1和SW1990细胞的HOXA7 mRNA的表达水平.采用重亚硫酸盐测序PCR(bisulfite sequencing PCR,BSP)和结合重亚硫酸盐的限制性内切酶法(combined bisulfite restriction analysis,COBRA)检测启动子区域甲基化状态.应用去甲基化药物5-氮杂-2'-脱氧胞苷(5-aza-2-deoxycytidine,5-aza-dC)处理各细胞株,检测处理前后细胞HOXA7 mRNA表达和甲基化状态的变化.结果 胰腺癌细胞株BxPC3、CFPAC1和SW1990细胞均表达HOXA7 mRNA,而PANC1细胞不表达HOXA7 mRNA.CFPAC1、BxPC3、PANC1和SW1990中HOXA7启动子甲基化率分别为93.16%、90.65%、90.09%、52.30%,SW1990细胞的HOXA7甲基化率较其他三株细胞均明显降低(P值均＜0.01).经5-aza-dC处理后,PANC1细胞的HOXA7 mRNA重新表达,BxPC3的HOXA7 mRNA表达增强;而CFPAC1和SW1990细胞的HOXA7 mRNA在5-aza-dC处理前后无明显变化.结论 胰腺癌细胞株BxPC3和PANC1细胞的HOXA7mRNA表达与启动子区甲基化状态密切相关,而CFPAC 1和SW1990细胞两者无明显相关性.     

人类真核翻译延长因子1A2过表达对胰腺癌SW1990细胞体外侵袭及体内转移的影响

目的 探讨人类真核翻译延长因子1A2(EEF1A2)过表达对人胰腺癌SW1990细胞体外侵袭和肺转移潜能的影响.方法 通过携带EEF1A2的慢病毒感染人胰腺癌SW1990细胞建立EEF1A2稳定过表达的SW1990/EEF1A2细胞株及空质粒对照的SW1990/GFP细胞株,并以亲本SW1990细胞作为空白对照.采用实时PCR和蛋白质印迹法检测各组细胞EEF1A2mRAN和蛋白的表达.应用Transwell小室检测细胞的体外侵袭能力.通过裸鼠尾静脉注射癌细胞方法构建肺转移模型,8周后观察并计数肺表面的转移结节.结果 SW1990/EEF1A2细胞EEF1A2 mRNA相对表达量为3.252±0.344,显著高于SW1990/GFP细胞的1.000±0.060及亲本细胞的0.944±0.041(t值分别为2.255、2.305,P值均＜0.01);EEF1A2蛋白表达量为0.833±0.050,显著高于SW1990/GFP细胞的0.247±0.035及亲本细胞的0.273 ±0.041(t值分别为0.572、0.559,P值均＜0.01);穿膜细胞数为(60 ±4)个,显著多于SW1990/GFP细胞的(33 ±4)个和亲本细胞的(26 ±3)个(t值分别为31.33、34.78,P值均＜0.01);裸鼠肺转移结节显著多于SW1990/GFP细胞及亲本细胞组(5/5比1/5、1/5,P值均＜0.05).结论 EEF1A2过表达可以明显增强胰腺癌SW1990细胞的体外侵袭和肺转移能力.     

12-脂氧合酶在胰腺癌中的表达及其临床意义

目的 检测胰腺癌组织和胰腺癌细胞株SW1990和PANC1的12-脂氧合酶(12-lipooxygenase,12-LOX)表达,探讨其与胰腺癌临床病理参数的关系.方法 分别应用免疫组化染色、RT-PCR和蛋白质印迹法检测胰腺癌组织、癌旁正常胰腺组织及胰腺癌细胞株SW1990和PANC1中12-LOX mRNA和蛋白的表达.分析胰腺癌组织12-LOX表达与临床病理参数的相关性.结果 30例胰腺癌组织12-LOX表达阴性8例,弱阳性7例,强阳性15例,总阳性率为73.3％.SW1990和PANC1细胞均表达12-LOX.阳性表达的胰腺癌组织及两株胰腺癌细胞株均表达12-LOX mRNA,而癌旁正常胰腺组织不表达12-LOX mRNA及蛋白.胰腺癌组织12-LOX强阳性表达与肿瘤TNM分期、肿瘤病理分级和淋巴结转移相关(P＜0.05),而与患者年龄、性别无关.结论 12-LOX在胰腺癌中表达上调,与胰腺癌的恶性生物学行为有关.     

STAT3基因沉默对胰腺癌细胞株的增殖及对吉西他滨敏感性的影响

目的 探讨信号转导与转录激活因子3（STAT3）基因沉默对吉西他滨介导的胰腺癌细胞株增殖和凋亡及对吉西他滨治疗敏感性的影响.方法 以STAT3荧光素慢病毒及对照的海肾萤光素酶慢病毒感染6株胰腺癌细胞株（BxPC3、L3.6pl、CFPAC-1、MPanc-96,PANC1、MiaPaCa-2）及人胰腺癌导管上皮细胞株（HPDE）,检测各细胞STAT3及磷酸化STAT3（pSTAT3）蛋白的表达.应用RNA干扰技术沉默6株胰腺癌细胞株STAT3基因表达,应用蛋白质印迹法检测细胞STAT3蛋白表达,MTS法检测细胞的增殖,流式细胞仪检测细胞的凋亡.结果 6株胰腺癌细胞株STAT3及pSTAT3蛋白表达量均显著高于HPDE细胞,但胰腺癌细胞的表达量与其对吉西他滨耐药性及敏感性无明显相关.转染靶向STAT3的siRNA（siSTAT3）的BxPC3、MiaPaCa-2、PANC1、L3.6pl、CFPAC-1、MPanc-96细胞STAT3蛋白表达量分别为0.40±0.04、0.09±0.01、0.38±0.02、0.27 ±0.06、0.10±0.02、0.24±0.04,较转染阴性对照siRNA（siNC）细胞的表达量2.27±0.21、1.83 ±0.12、2.27±0.17、2.23±0.21、0.33±0.05、1.24±0.19均显著下降（P值均＜0.05）.但对细胞的增殖及凋亡无明显影响.STAT3基因沉默可以增加所有6株细胞对吉西他滨的敏感性,吉西他滨的杀伤效应增加了10％～15％.结论 STAT3表达水平同胰腺癌的化疗药物耐药性无明显相关性,沉默STAT3基因表达可增加细胞对吉西他滨耐治疗的敏感性.     

MUC2基因甲基化在胰腺癌细胞株、胰腺癌患者外周血中的检测及意义

目的 检测MUC2基因在胰腺癌细胞株、胰腺癌患者外周血中的甲基化情况,探讨MUC2基因甲基化对胰腺癌早期诊断的价值.方法 收集长海医院消化内科实验室保存的人胰腺癌细胞系SW1990、ASPC、PANC1、BxPC3、PaTu8988、CFPAC1及40例胰腺癌、15例慢性胰腺炎患者和25例正常对照者外周血标本,应用甲基化敏感性限制性内切酶(methylation-sensitive restriction endonuelease,MS-RE)为基础的PCR法检测MUC2基因甲基化.结果 人胰腺癌细胞系PANC1、BxPC3、PaTu8988未发生MUC2基因甲基化;ASPC、CFPAC1、SW1990胰腺癌细胞系发生MUC2基因甲基化.外周血标本中,40例胰腺癌标本甲基化率为40.0%(16例),15例慢性胰腺炎无甲基化,25例正常对照甲基化率4.0%(1例).胰腺癌与慢性胰腺炎、正常对照之间的甲基化率有显著差异(P＜0.01).外周血标本MUC2基因启动子CpG岛甲基化检测诊断胰腺癌的敏感性为40%、特异性为97.5%、诊断准确性68.8%、阳性预测值94.1%、阴性预测值61.9%.结论 用甲基化限制性酶切PCR法对外周血进行MUC2基因启动子区高甲基化检测可望成为新的胰腺癌诊断的重要实验室辅助手段.     

干细胞相关基因Oct-4在人肿瘤细胞系中的表达及其意义

目的探讨干细胞相关基因Oct-4在多种人肿瘤细胞系中的表达。方法体外培养人胰腺癌、宫颈癌、肝癌、乳腺癌、结肠癌细胞系,应用RT-PCR和Western blot法分别检测Oct-4mRNA和蛋白在各种人肿瘤细胞系中的表达。结果Oct-4mRNA和蛋白在胰腺癌细胞系SW1990、PANC1、BxPC3、PC3,宫颈癌细胞系HELA,肝癌细胞系HepG2,乳腺癌细胞系MCF-7和结肠癌细胞系CaCo2中均有表达。结论干细胞相关基因Oct-4在肿瘤细胞中的表达,一方面说明恶性肿瘤与干细胞具有密切的关系,另一方面也说明Oct-4基因在这些肿瘤的发生中起到重要作用。     

抑制5-脂氧合酶表达对胰腺癌细胞增殖和凋亡的影响

目的 应用RNA干扰(RNAi)技术阻断5-脂氧合酶(5-LOX)的表达,观察其对人胰腺癌细胞SW1990增殖及凋亡的作用.方法 构建4个靶向5-LOX的小干扰RNA(small interference,siRNA)和1个阴性对照siRNA质粒表达载体,采用Lipofectamine TM2000法转染SWl990细胞,RT-PCR和Western blot检测RNAi后SWl990细胞的5-LOX mRNA和蛋白表达,MTT法检测细胞的增殖抑制率,流式细胞仪检测细胞凋亡率.结果 阴性对照和4个序列特异性的siRNA对SWl990细胞5-LOXmRNA表达的抑制率分别为(3.0±1.4)%、(18.8±1.5)%、(53.5±2.3)%、(56.1±2.0)%、(52.4±2.5)%;5-LOX蛋白表达抑制率分别为(4.5±2.0)%、(18.1±2.5)%、(50.4±4.3)%、(48.9±4.4)%、(45.9±4.0)%.转染24 h后癌细胞增殖抑制率分别为(2.1±1.0)%、(5.5±1.3)%、(11.9±1.2)%、(13.4±1.1)%、(13.8±1.3)%.;48 h的增殖抑制率分别为(3.0±1.3)%、(16.0±2.2)%、(25.7±2.5)%、(25.3±3.1)%、(27.2±3.2)%.转染24 h细胞凋亡率分别为(2.0±0.8)%、(5.3±1.0)%、(10.6±1.2)%、(12.4±1.0)%、(10.6±0.9)%;转染48 h的凋亡率分别为(3.0±1.0)%、(7.1±1.1)%、(17.5±0.9)%、(21.5±1.1)%、(15.7±1.0)%.结论 通过RNAi可以有效、特异地阻断SWl990细胞5-LOX的表达,并可以有效抑制肿瘤细胞的增殖,促进肿瘤细胞凋亡.