大鼠Cx43基因慢病毒表达载体的构建及转染骨髓间充质干细胞表达的观察

目的:构建大鼠缝隙连接蛋白43(Cx43)基因的重组慢病毒表达载体,并转染大鼠骨髓间充质干细胞(BMSC),观察Cx43的表达。方法:采用RT-PCR技术获得大鼠Cx43基因,并将其连接到含有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的慢病毒表达载体pGC-FU中,重组获得慢病毒质粒pGC-FU-Cx43,将其与辅助包装质粒(pHelper1.0、pHelper2.0)一起共转染293T细胞,包装生产病毒并测定滴度。所获慢病毒感染大鼠BMSC后,采用荧光显微镜和Western blot方法检测Cx43的表达。结果:酶切证实Cx43基因已定向连入目的载体,测序结果显示,所构建的pGC-FU-Cx43重组慢病毒质粒序列与目标序列完全一致。获得的病毒滴度为2×109TU/ml。经分离、纯化得到BMSC;pGC-FU-Cx43转染BMSC后,可见大量EGFP表达,Cx43的表达量明显增加。结论:成功构建并包装获得较高滴度的重组慢病毒pGC-FU-Cx43。pGC-FU-Cx43可高效转染BMSC,Cx43表达增加,且实现稳定转染。     

人肿瘤抑素Tumstatin基因慢病毒表达载体的构建及其蛋白表达

目的 构建Tumstatin基因慢病毒表达载体,进一步研究Tumstatin基因的功能及其在肿瘤治疗中的应用.方法 采用PCR技术从含有Tumstatin基因的质粒pSPORT1-Sfi扩增目的 基因Tumstatin,并将基因克隆到慢病毒载体表达质粒PGC-Fu[含增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因]中,构建慢病毒载体表达质粒pGC-FU-Tum,通过酶切、测序验证Tumstatin基因后,将pGC-FU-Tum质粒和包装质粒pHelper1.0、pHelpe2.0共同转染人胚胎肾上皮细胞系293T细胞,获得携带Tumstatin基因和EGFP基因的重组慢病毒GC-Fu-Tum,并转染人脐静脉血管内皮细胞HUVEC,Wstem blot检测目的 蛋白Tumstatin的表达.结果 pGC-FU-Tum中携有正确的Tumstatin基因;pGC-FUTurn共转染包装细胞293T能产生高浓度的重组慢病毒GC-FU-Tum;目的 基因Tumstatin能被重组慢病毒高效地转导入HUVEC,荧光显微镜下能直接观察到EGFP,Western blot能检测到Tumstatin蛋白在靶细胞中的表达.结论 成功构建了携带Tumstatin基因的重组慢病毒载体;其蛋白表达与EGFP-致..     

慢病毒载体介导人缝隙连接蛋白43基因在大鼠骨髓间充质干细胞中的表达

目的构建带有缝隙连接蛋白43基因的慢病毒载体,并实现该基因在大鼠骨髓间质干细胞中的表达。方法通过逆转录聚合酶链反应获得人缝隙连接蛋白43基因,利用infusion技术重组构建慢病毒载体质粒FUGW-缝隙连接蛋白43,在脂质体介导下与包装质粒和包膜质粒VSVG共转染293T细胞包装生产慢病毒。所获慢病毒感染大鼠骨髓间充质干细胞后,在荧光显微镜下观察缝隙连接蛋白43蛋白表达情况。结果所获缝隙连接蛋白43基因经测序后与GeneBank报道序列完全一致;重组慢病毒载体质粒FUGW-缝隙连接蛋白43经鉴定正确;三质粒共转染293T细胞成功,收集、浓缩病毒后测定其滴度为1×1011TU/L;感染大鼠骨髓间充质干细胞后荧光显微镜观察到胞膜位置点线状荧光分布。结论成功构建带有缝隙连接蛋白43基因的慢病毒载体并实现在大鼠骨髓间充质干细胞中的表达,为间充质干细胞移植治疗心肌梗死的应用奠定了基础。     

网素蛋白1和增强绿色荧光蛋白基因共表达慢病毒载体构建和鉴定及在结直肠癌细胞SW480中表达

目的构建和鉴定网素蛋白基因(PLS)1和增强绿色荧光蛋白(EGFP)共表达慢病毒载体,并检测其在人结直肠癌细胞株SW480中的表达水平。方法采用聚合酶链反应(PCR)方法克隆PLS1基因;将PLS1基因连接到带有EGFP的慢病毒表达载体p EZ-Lv201中构建慢病毒载体;将构建的慢病毒载体质粒p EZ-PLS1-SV40-e GFP-IRES-Puro(p EZ-PLS1)与慢病毒包装质粒混合物Lenti-Pac HIV mix共转染293T细胞,收集慢病毒悬液;重组病毒转染H1299细胞,定量PCR法检测重组病毒滴度;将构建的p EZ-PLS1感染SW480细胞,荧光显微镜观察和Western印迹检测感染后SW480细胞中EGFP和目的基因PLS1表达。结果基因测序分析证实克隆的PLS1基因与Gen Bank提供的序列完全一致;构建的重组慢病毒载体经双酶切、琼脂糖凝胶电泳鉴定证实PLS1正确插入p EZ-Lv201;定量PCR测定慢病毒滴度为0.1×10~9~1.0×10~9TU/ml。在SW480细胞中重组病毒感染96 h后在荧光显微镜下可检测到较强的绿色荧光蛋白表达,Western印迹检测到在SW480细胞中PLS1蛋白过表达。结论成功构建携带PLS1基因的重组慢病毒载体,在SW480细胞中有效表达。     

慢病毒重组ACE2基因表达载体的构建及其感染人脐静脉内皮细胞的研究

目的构建携带血管紧张素转换酶2（ACE2）基因的慢病毒表达载体,观察其感染人脐静脉内皮细胞后ACE2基因的转录及表达水平。方法采用PCR技术从含有ACE2基因的质粒克隆模板pc—DNA3．1-hygro（＋）一mACE2上钓取ACE2基因,并将ACE2基因重组到慢病毒载体表达质粒pGC—FU中,构建重组慢病毒载体表达质粒pGC—FU—ACE2,通过酶切、测序验证ACE2基因后,将pGC—FU—ACE2质粒和包装质粒pHelper1．0、pHelper2．0共同转染人胚胎肾上皮细胞系293T细胞,获得携带ACE2基因的重组慢病毒Lentiviral—ACE2;然后感染人脐静脉内皮细胞,通过RT—PCR、Western—blot检测ACE2基因的转录和蛋白表达水平。结果成功构建携带ACE2基因的慢病毒表达载体Lentiviral—ACE2,并获得大量高纯度的慢病毒浓缩液。目的基因ACE2能被重组慢病毒高效地导入人脐静脉血管内皮细胞,并能高水平表达。结论慢病毒表达载体Lentiviral—ACE2成功构建并能高效率感染人脐静脉内皮细胞,为研究ACE2对血管内皮细胞的影响和更深入地探索ACE2基因的功能奠定了基础。     

Cx43基因shRNA慢病毒载体的构建及其对大鼠心肌细胞Cx43基因的作用

目的构建缝隙连接蛋白(Cx)43基因shRNA慢病毒载体,并检测其对大鼠心肌细胞Cx43基因的作用。方法针对Cx43基因序列,设计RNA干扰靶点序列,合成靶序列的双链DNA,接入pGCL-GFP载体,挑选阳性克隆行PCR鉴定及测序。用pHelper1.0和pHelper2.0质粒转染293T细胞,包装产生具备感染能力的慢病毒。以293T细胞中绿色荧光蛋白的细胞数量计算病毒滴度;以最适感染复数感染大鼠心肌细胞,通过荧光显微镜观察感染效率;应用real-time PCR和Western blot法检测大鼠心肌细胞Cx43 mRNA及Cx43蛋白表达,并评价其抑制效果。结果经PCR鉴定和测序证实,Cx43慢病毒载体构建正确,其病毒滴度为8×108TU/mL、转染效率为82.59%。荧光定量real-time PCR法检测Cx43 mRNA的抑制率为96.10%,Western blot法检测Cx43蛋白的抑制率为77.16%。结论成功构建了Cx43基因shRNA慢病毒载体,其能显著抑制大鼠心肌细胞Cx43基因的表达。     

重组人GDNF基因逆转录病毒真核表达载体的构建及表达

目的 构建含有胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)和加强型绿色荧光蛋白基因(EGFP)的逆转录病毒载体,将其导入包装细胞PT67,检测基因在细胞中的表达.方法 PCR法扩增GDNF基因及IRES2-EGFP基因,测序验证正确后与逆转录病毒载体pLXSN连接,构建重组逆转录病毒质粒pLXSN-IRES2-EGFP-GDNF.EcoR I酶切鉴定重组质粒.脂质体Lipofectamine 2000介导下转染包装细胞PT67,G418筛选并检测病毒滴度.流式细胞仪和荧光显微镜分别检测转染效率和基因表达.结果 PCR扩增得到大小约558 bp和1 308 bp的特异性条带,测序证实,获得正确的人GDNF序列和EGFP序列.经EcoR I酶切鉴定,成功构建重组质粒pLXSN-IRES2-EGFP-GDNF.荧光显微镜检测显示GDNF基因获得良好表达,流式细胞仪检测转染效率为24.4%.结论 正确克隆了人GDNF基因全序列并构建重组逆转录病毒pLXSN-IRES2-EGFP-GDNF质粒.基因转染包装细胞PT67获良好表达.     

Bcl-2基因修饰的骨髓间充质干细胞治疗急性肝衰竭的初步研究

目的 构建Bcl-2基因修饰慢病毒质粒,建立稳定表达Bcl-2基因的骨髓间充质干细胞系,探讨Bcl-2基因修饰的骨髓闸充质干细胞治疗ALF的可行性。方法 PCR合成Bcl-2基因片段并插入GV287空载体后扩增进行慢病毒包装,使用Bcl-2慢病毒液转染大鼠骨髓间充质干细胞,使用单纯未处理骨髓间充质干细胞,移植急性肝损伤模型大鼠,观察移植后大鼠存活情况及其肝脏病理改变。结果 得到纯化的骨髓间充质干细胞细胞株;成功分离Bcl-2基因DNA片段并构建Bcl-2基因重组慢病毒质粒,并成功转染到骨髓间充质干细胞中,经荧光显微镜检测GFP荧光及免疫印迹蛋白检测,转染后细胞可高表达Bcl-2基因,转染后细胞状态较好,可进行移植实验;模型鼠经过尾静脉移植骨髓间充质于细胞后,共聚焦显微镜下观察肝脏冰冻切片病理,骨髓间充质干细胞,可以定植到损伤肝脏组织。结论 初步证实,骨髓间充质干细胞能够在急性肝损伤大鼠肝脏归巢,并且能发挥一定程度治疗作用。     

胰腺癌CFPAC1细胞增殖诱导配体基因shRNA慢病毒表达载体的构建

目的 构建针对人胰腺癌细胞株CFPAC1增殖诱导配体(a proliferation-inducing ligand,APRIL)基因的shRNA慢病毒表达载体.方法 应用基因工程技术,筛选出针对APRIL基因的RNAi靶序列,与pGCL-GFP载体连接,构建慢病毒表达载体LV-shAPRIL;将连接产物转化到DHSα感受态细胞,经PCR筛选阳性克隆、测序鉴定.再用LV-shAPRIL、pHelper 1.0、pHelper 2.0共转染293T细胞,包装产生慢病毒颗粒.重组慢病毒感染CFPAC1细胞,实时定量PCR和Western blotting检测CFPAC1细胞APRIL mRNA和蛋白的表达.结果 PCR和测序结果与构建的慢病毒载体的预期结果一致,经包装产生的病毒滴度为5×107TU/ml.构建的慢病毒载体感染CFPAC1细胞后第4天、第4周和第8周,APRIL mRNA表达量较空载体慢病毒感染组分别下降了73%、70%和71%;APRIL蛋白表达量分别下降了66%、63%和62%(P＜0.05).而各时间段未感染慢病毒的细胞组与空载体组相比无明显差异(P＞0.05).结论 成功构建了APRIL基因的shRNA慢病毒表达载体LV-shAPRIL.     

AQP5基因重组慢病毒载体的构建与鉴定

目的构建人水通道蛋白5（AQP5）基因慢病毒载体。方法体外扩增出AQP5基因全长cDNA,将慢病毒载体pWPTS-GFP与扩增出的AQP5用MluⅠ和SalⅠ进行双酶切,将AQP5全长序列克隆入pWPTS-GFP,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,对长出的克隆用菌落PCR鉴定,再对阳性克隆进行测序和比对分析。重组病毒质粒与另外两种辅助包装原件载体质粒通过CaCl2共转染293T细胞（人胚肾细胞）,培养48 h后收集细胞培养上清液,将病毒浓缩后在293T细胞中测定病毒滴度,并检测慢病毒载体在工具细胞SGC7901细胞（胃癌细胞）的转染效率。Western blot检测SGC7901细胞中AQP5蛋白。结果测序结果和Western blot检测均证明AQP5重组慢病毒载体构建正确,并能在细胞中正确表达。与辅助质粒共转包装细胞获得慢病毒颗粒,并成功感染SGC7901细胞。包装慢病毒,浓缩病毒悬液的滴度为1×108 TU/ml。结论成功构建了稳定表达AQP5基因的重组慢病毒载体。     

mmu_circ_0001033过表达慢病毒载体的构建与鉴定

目的构建环状RNA mmu_circ_0001033慢病毒表达载体,作为在低氧性肺动脉高压功能学实验研究的基础。 方法首先设计引物将目的基因片段从原质粒上扩增下来,通过引物两端所含无缝克隆识别位点将其重组到酶切后的过表达载体上;将连接产物转入制备好的细菌感受态细胞,而后将其单克隆菌落送测序公司进行测序鉴定。其次通过PCR产物跑胶和测序验证成环情况。最后用构建的重组表达载体和包装质粒共同转染293T细胞,包装慢病毒,收集病毒原液,超滤浓缩,并测定滴度。 结果经过比对,重组克隆中插入片段序列与目的片段序列完全一致,表明质粒构建成功。PCR产物后经sanger测序确认环化位点处序列完全正确。将构建的过表达载体测序结果和质粒构建方案基因比对,重组克隆中插入片段序列与目的片段序列与预期完全一致,可实现转染质粒后目的基因的表达,PCR产物跑胶和测序结果表明mmu_circ_0001033成环成功。PCR产物跑胶和测序结果表明mmu_circ_0001033成环成功。最后通过比较RT-qPCR测定病毒滴度值为2.09×10⁸ TU/ml。 结论成功构建环状RNA mmu_circ_0001033慢病毒表达载体,能稳定转染293T细胞,可用于后续细胞实验。     

小鼠肝细胞SMAC基因特异干扰载体的构建及慢病毒包装

目的构建并鉴定小鼠SMAC特异干扰载体,并进行慢病毒包装。方法针对小鼠SMAC基因设计并合成3对干扰序列siRNA1、siRNA2、siRNA3及一对阴性对照序列siRNAn,脂质体法转染小鼠肝细胞,Real time PCR法筛选出最佳干扰序列。依据该最佳干扰序列合成DNA oligo,连接GV115载体,获得重组干扰质粒,PCR鉴定阳性克隆并测序鉴定构建的正确性。将该重组干扰质粒与辅助质粒pHelper1.0和pHelper2.0共转染293T细胞,进行慢病毒包装,收集细胞上清并浓缩,梯度稀释法测定病毒滴度。多组间比较采用方差分析,进一步两两比较采用SNK-q检验。结果 3条siRNA对肝细胞SMAC mRNA均有不同程度的抑制作用,其中siRNA1的抑制效应最强,抑制效率达到70.3%。依siRNA1片段合成DNA oligo,并与慢病毒载体连接,测序显示其构建正确,梯度稀释法测定慢病毒滴度为6×108TU/ml。结论成功构建了小鼠SMAC基因特异干扰性的慢病毒,为研究SMAC基因在肝衰竭中的作用奠定基础。     

CLEC4M慢病毒载体的构建及其在K-562细胞中的表达

目的本研究拟构建CLEC4M慢病毒表达载体,建立稳定过表达的K-562细胞株。方法应用逆转录PCR克隆出正常人CLEC4M基因序列,将序列插入GV166载体,构建GV166-CLEC4M慢病毒表达载体,之后转染293T细胞进行慢病毒包装。用获得的慢病毒液感染人白血病细胞系K-562,通过实时荧光定量PCR和Western Blot检测K-562细胞中CLEC4M的过表达情况。结果测序结果显示成功构建重组慢病毒表达质粒GV166-CLEC4M;依据实时荧光定量PCR可测定慢病毒能够有效感染K-562细胞;CLEC4M在K-562细胞中的mRNA和蛋白水平都成功的过表达。结论 CLEC4M慢病毒表达载体的构建,为进一步研究CLEC4M基因在HCV入胞的分子机制奠定了基础。     

人QKI6基因重组腺病毒载体的构建及其在心肌细胞中的表达鉴定

目的:构建人RNA结合蛋白（QKI6）基因的重组腺病毒载体,并在心肌细胞中表达。方法:利用PCR技术,从原始质粒中扩增出QKI6目的基因片段,酶切后连接到pShuttle-GFP-CMV重组穿梭质粒上。再将pShuttle-GFP-QKI6 转移到pAdxsi载体上,得到带有QKI6目的基因及GFP荧光指针的重组腺病毒载体pAdxsi-GFP-QKI6。酶切、PCR鉴定重组腺病毒载体pAdxsi-GFP-QKI6,并完成扩增与纯化。经Pacl线性化后,转染HEK 293细胞进行腺病毒包装,并测定病毒的滴度及目的基因的表达。以包装好的重组腺病毒感染大鼠新生心肌细胞,通过GFP表达观察病毒感染效率。用PCR检测目的基因QKI6在感染的心肌细胞中的表达。结果:含QKI6基因及GFP荧光指针的重组腺病毒载体pAdxsi-GFP-QKI6构建成功,酶切、PCR鉴定及DNA测序证实了其正确性。重组腺病毒可重复感染HEK 293细胞,荧光显微镜下可见GFP表达,且QKI6基因的表达明显升高。包装的重组腺病毒可有效感染新生心肌细胞,并表达目的基因QKI6。结论:成功地构建QKI6基因重组腺病毒载体,以其感染293细胞及新生心肌细胞后,可有效地表达QKI6基因,为进一步研究QKI6基因在糖尿病心肌细胞凋亡的机制以及在糖尿病性心肌病治疗中的应用奠定实验基础。     

携带泛素-HBcAg融合基因的慢病毒表达载体构建及其体外诱导小鼠髓源性树突状细胞成熟

目的构建携带泛素-HBcAg融合基因的慢病毒表达载体,包装成重组慢病毒并观察其体外诱导小鼠髓源性树突状细胞（DC）成熟。方法 PCR扩增Ub-HBcAg融合基因,插入到慢病毒骨架质粒pWPXLd中,构建重组质粒pW-Ub-HBcAg。将构建的重组慢病毒质粒pW-Ub-HBcAg和包装质粒psPAX2、包膜质粒PMD2.G用脂质体共同转染293T细胞,获得携带Ub-HBcAg基因的重组慢病毒LV-Ub-HBcAg,并检测其在293T细胞中的表达。体外分离培养小鼠髓源性DC,加入重组慢病毒,流式细胞仪测定DC表面分子表达,ELISA测定DC培养上清中IL-12分泌水平。结果强制泛素化HBcAg融合基因的慢病毒表达载体经测序证实目的基因序列及插入方向均正确,W estern b lot能检测到目的蛋白在293T细胞中的表达。LV-Ub-HBcAg能上调DC表面分子的表达（CD86、CD80、MHC-Ⅱ类分子）,并且能促进DC分泌IL-12（139.2±10.75）pg/mL,明显高于LV-HBcAg组分泌的量（P〈0.01）。结论成功构建了携带强制泛素化HBcAg融合基因的慢病毒,转染293T细胞后能够稳定表达目的基因,并且能诱导DC分化、成熟,上调表面共刺激分子的表达,促进IL-12因子的分泌。     

Pim-3慢病毒质粒构建及其表达鉴定

目的 构建Pim-3慢病毒质粒,鉴定其在卵巢癌SKOV3细胞中基因及蛋白水平的表达.方法 RT-PCR法提取Pim-3 cDNA,经T-A克隆及双酶切将其与慢病毒表达载体pCDH-EF1-MCS-T2A-copGFP重组;酶切鉴定及基因测序后,将阳性重组质粒导入病毒包装细胞293T中;收集病毒上清液转染SKOV3细胞,荧光显微镜下观察转染情况,应用RT-PCR及Western blot法分别检测Pim-3 mRNA及其蛋白.结果 RT-PCR法获得Pim-3基因,重组质粒酶切后片段大小及基因测序结果显示pCDH/Pim-3重组质粒构建成功.将感染重组质粒及空载体的293T细胞生产的病毒上清分别感染SKOV3细胞,感染重组质粒的SKOV3细胞中Pim-3 mRNA及蛋白表达水平均高于空载体细胞.结论 成功构建了pCDH/Pim-3重组慢病毒质粒,建立了Pim-3高表达SKOV3瞬转细胞模型,为探讨Pim-3在卵巢癌发生、发展中的作用及机制奠定实验基础.     

NRF-1基因真核慢病毒表达载体的构建及表达

目的构建核呼吸因子-1（NRF-1）基因慢病毒表达载体并包装成重组慢病毒颗粒,感染大鼠心肌细胞H9c2（2-1）后,筛选出稳定上调表达NRF-1的大鼠心肌细胞H9c2（2-1）。方法：利用lipofectAMINE 2000试剂将pLenti6．3-NRF-1．IRES2-EGFP质粒与两种包装质粒在293T细胞中包装成重组慢病毒,收集病毒并测定滴度。用重组慢病毒感染大鼠心肌细胞H9c2（2-1）,然后用杀稻瘟素（blasticidin）筛选转染阳性细胞。用PCR法鉴定靶细胞基因组中NRF-1基因序列,用QPCR测定转染阳性靶细胞中NRF-1基因表达量。结果：收集的重组慢病毒滴度为5．5×10^7TU／ml。转染阳性靶细胞在荧光显微镜下可见绿色荧光。PCR结果显示,慢病毒携带NRF-1基因序列已插入靶细胞基因组。QPCR结果显示,转染阳性靶细胞中NRF-1基因的表达量是对照组的2．25倍。结论：本研究成功地构建NRF-1基因重组慢病毒表达载体,并在大鼠心肌细胞H9c2（2-1）中表达,为进一步上调NRF-1基因表达后心肌细胞能量代谢的研究提供了实验支持,并为心力衰竭能量代谢的基因治疗奠定了基础。