天津地区汉坦病毒分离株TJJ16 M基因片段克隆和序列分析

目的分析天津地区汉坦病毒分离株TJJ16 M基因的分子特征。方法采用细胞培养法从鼠肺标本中分离汉坦病毒TJJ16,提取TJJ16感染Vero-E6细胞的总RN A,经逆转录扩增病毒cDNA,继而进行PCR分别扩增M1和M2基因片段,克隆于T载体并测序拼接,对其进行序列分析和生物信息学分析。结果汉坦病毒TJJ16株的M基因片段全序列长为3616nt,仅有1个开放读码框架(ORF),编码1 136个氨基酸,序列分析表明其为汉滩型(HTN型)汉坦病毒,与HTN型Q32株同属1个亚型。结论TJJ16病毒株M基因片段的克隆和序列分析证实其为HTN型,系天津地区的首次报道。     

汉坦病毒Z5株M和S片段全基因序列测定及分析

目的测定汉坦病毒Z5株M、S片段的全长序列,了解其分子结构特征,并分析Z5与其他汉坦病毒株的遗传学差异。方法设计引物,用RT-PCR技术扩增Z5株全长M与S片段。PCR产物纯化后克隆入T载体并测定序列及分析。结果Z5株M片段的全基因序列含有3 616个核苷酸,编码1 135个氨基酸。S全基因序列含有1 700个核苷酸,编码429个氨基酸。经核苷酸与氨基酸同源性分析,Z5株应属于汉坦病毒的汉滩型(HTN型)毒株,与Z10株同属一个亚型。结论Z5株病毒和其他汉滩病毒病毒在核苷酸序列上有差异,但在氨基酸水平上的同源性仍较高。     

青岛市汉坦病毒基因型测定及分析

目的探讨青岛市汉坦病毒主要流行株的基因型。方法在青岛5市采集鼠肺标本,应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增技术及核苷酸序列测定方法对免疫荧光抗原阳性的HV M部分片段扩增并测序,与山东省其他地区代表株及其他部分标准株进行系统发生树及同源性分析。结果分离的5株HV有3株为SEO型,2株为HTN型。从SEO型病毒间的异同来看,青岛市汉坦病毒分离株和临近地区汉坦病毒分离株相近。结论青岛市HV是SEO和HTN混合型疫区;SEO型基因有较高的稳定性。     

河南省部分区域肾综合征出血热患者汉坦病毒的分子特征

目的 分析河南省部分区域肾综合征出血热患者汉坦病毒的分子特征。方法 采集2017-2018年就诊于河南省郑州市第六人民医院临床诊断为肾综合征出血热患者血标本32例,采用半巢式PCR筛选汉坦病毒阳性样本,然后再对阳性样本中病毒S片段和M部分片段基因进行扩增和测序,并对得到的S片段基因序列进行组装。所得序列与已分离到的国内其他省份相对应的基因序列进行同源分析并构建系统发生树。结果 收集的32份血标本中,16份血标本扩增出目的片段,序列分析表明均为汉滩病毒(HTNV)。系统发生分析显示16株病毒株S片段和M部分片段聚类分支关系基本一致。其中HN2018/138病毒株与其余15株S片段和M部分片段核苷酸序列的同源性分别为91.4%~92.1%和83.2%~84.4%,差异较大,其余15株亲缘关系较近。结论 本研究所统计的河南省部分区域内肾综合征出血热患者以HTNV为主导基因型,且其表现出明显的地域聚集现象,并存在基因差异较大的变异株或省外输入病毒株的可能性。     

深圳市肾综合征出血热疫源地宿主动物汉坦病毒分离株的基因分型

目的 对深圳市肾综合征出血热(HFRS)疫源地进行宿主动物汉坦病毒分离,研究分离株的基因分型.方法 采用幼龄长爪沙鼠接种和Vero-E6细胞培养的方法进行汉坦病毒分离,用直接免疫荧光实验进行鉴定.应用型特异性引物进行反转录一套式PCR分别扩增M片段G1、G2区、S片段,并测定核苷酸序列,进行同源性比对和进化树分析.结果 从深圳市褐家鼠肺中成功分离到2株汉坦病毒,命名为SZ2082和SZ2083,经反转录一套式PCR扩增并进行序列测定显示为第2型汉城病毒型(SEOV).通过对3个基因片段序列比较分析发现,SZ2082和SZ2083部分M和S片段核苷酸序列完全一致.M片段G1、G2区核苷酸序列与SEOV国际代表株80-39的同源性分别为96.7%、95.0%,与第1型汉滩病毒型(HTNV)型国际代表株76-118的同源性仅为75.9%、70.3%.S片段与SEOV80-39和HTNV76-118比较,核苷酸同源性分别为95.7%和69.7%,与M片段的结果相似.通过M片段G2区的分析发现,SZ2082与BjFT01、Beijing-Rn、Guang199、HN71-L处于同一分支,同源性为99.0%～99.7%.结论 在深圳市分离到汉坦病毒,通过鉴定其属于汉城型病毒S2亚型.     

汉坦病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立

目的通过建立汉坦病毒实时荧光定量PCR检测方法,快速准确地检测汉坦病毒。方法根据汉滩型和汉城型汉坦病S片段基因的序列分别设计特异性探针引物,使用含有目的基因片段的重组质粒标准品绘制标准曲线,建立检测两型汉坦病毒的实时荧光定量PCR方法。结果建立的检测方法特异性良好,与其他常见病原不发生交叉反应;最低检测限为101copies/μl,灵敏度高;不同梯度定量模板的拷贝数的对数值与Ct值之间线性关系表达式分别为y=-3.4607x＋40.988（HTN）,y=-3.5307x＋39.356（SEO）,扩增效率分别为92.2%（HTN）和92.6%（SEO）,相关系数R2分别为0.9968（HTN）和0.9997（SEO）,呈良好的线性关系,且重复性好。结论建立的实时荧光定量PCR灵敏度高,重复性好,可用于汉坦病毒的快速检测,并可初步辨别汉滩型和汉城型汉坦病毒,对肾综合征出血热的病原早期诊断和流行病学调查有较好的应用价值。     

汉坦病毒S基因毕赤酵母表达系统的构建

目的构建汉坦病毒HTN型和SEO型S基因毕赤酵母表达系统。方法应用RT-PCR法扩增汉坦病毒Z10株和L99株编码核蛋白的S基因,将扩增产物分别与pGEM-T-Easy载体连接,经序列分析后双酶切,分别定向克隆入载体pPICZαΑ和pPICZαC,继而将重组质粒以SacⅠ线性化并电转化入毕赤酵母X33感受态细胞,用Zeocin筛选高拷贝转化子进行鉴定。结果PCR扩增产物约为1290bp,与T载体相连测序结果与Genbank相应序列比较,核苷酸序列同源性分别为99.84%和99.92%,其编码蛋白质二级结构均无改变。定向克隆获得pPICZα-ΑZ10S和pPICZ-αL99S,分别电转化得到巴氏毕赤酵母重组菌株PpX33-Z10S和PpX33-L99S,提取其基因组DNA经PCR鉴定与预期相符。结论成功构建汉坦病毒HIN型和SEO型S基因毕赤酵母表达系统,为进一步研究奠定基础。     

2007年浙江丽水地区汉坦病毒的分离与型别鉴定

目的对2007年从浙江省丽水地区肾综合征出血热(hemorrhagic fever with renal syndrome,HFRS)疫区鼠肺分离的汉坦病毒进行型别鉴定和分子生物学特性研究。方法将汉坦病毒抗原阳性的鼠肺标本接种Vero-E6细胞,分离汉坦病毒。提取病毒总RNA,应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增病毒S基因全片段,克隆入质粒载体,进行核苷酸序列测定及分析,应用DNA STAR软件分析比较,确定病毒型别。结果从疫区7份阳性鼠肺中分离到2株汉坦病毒,经汉坦病毒单克隆直接荧光血清检查和基因序列测定,结果为汉滩型(HTN)病毒,2株病毒与国际标准株76-118(HTN型)和80-39(SEO型)S片段核苷酸的同源性分别为84.7%、84.6%和64.2%、64.0%。结论浙江省丽水地区可能存在以HTN型病毒为主的肾综合征出血热自然疫源地。     

浙江新分离汉坦病毒ZT71株S基因片段的克隆及序列分析

目的为了获得浙江省汉坦病毒基因组更为详尽的资料,研究汉坦病毒的进化状况及变异程度,为疫苗病毒株的选择使用提供科学依据。方法本实验室利用RT-PCR方法扩增ZT71株S基因片段并克隆入质粒载体,进行核苷酸序列测定及分析。结果ZT71株S基因由1754个核苷酸组成,只有一个开放读码框架,共编码429个氨基酸。与HTN型病毒(76-118)的核苷酸和氨基酸同源性分别为72.0%和82.6%,与SEO型病毒(SR-11、R22、Guo3、8610)核苷酸和氨基酸同源性分别为88.4%—96.5%和98.1%—99.0%,与其它型汉坦病毒的同源都很低。结论表明此分离的病毒为SEO型汉坦病毒,为进一步研究其进化和变异提供了有利条件。     

基于线粒体基因分析的中华血吸虫分子种系发生研究

目的　测定中华血吸虫线粒体细胞色素 C氧化酶亚基 1(CO1)和 NADH脱氢酶亚基 1(ND1)基因序列 ,并根据这些序列构建分子系统发生树 ,探讨中华血吸虫在裂体属内的系统发生位置。　方法　以 GNT- K法抽提虫体基因组 DNA,用特异引物 PCR扩增目的基因。PCR扩增产物经纯化后克隆于质粒载体 ,以纯化后的阳性质粒 DNA作为模板 ,M13(F/ R)为引物于 L icor测序仪测序。检索 Gen Bank,查找曼氏血吸虫等相关血吸虫两线粒体基因序列 ,作基因排序及比较分析后 ,用 PHYL IP和 MEGA以邻接法和最大简约法绘制系统发生树。　结果　克隆了中华血吸虫的 CO1和 ND1基因片段 ,并测定了两基因片段的核苷酸序列 ,根据这些序列构建了系统发生树。　结论　中华血吸虫 CO1和ND1基因的系统发生树结果一致。提示中华血吸虫归属于亚洲血吸虫组     

江西省汉坦病毒分离及其S和M基因特征分析

目的 对2011年江西省采集的鼠肺标本进行汉坦病毒的分离鉴定,了解分离病毒株的基因特征。方法 采用Vero-E6细胞对阳性鼠肺标本进行病毒分离,采用直接免疫荧光法和RT-PCR方法对毒株进行鉴定。扩增分离株的S、M片段基因进行克隆测序。运用DNAstar软件包和MEGA3.1软件对序列进行分析。结果 从15份标本分离到2株来自褐家鼠的汉城型汉坦病毒。对其中1株病毒的S、M片段进行了克隆和序列测定,其中S片段含1 772个核苷酸,编码429个氨基酸;M片段含3 651个核苷酸,编码1 133个氨基酸。经核苷酸和氨基酸同源性分析,新分离株与国内外汉城型病毒核苷酸同源性94.8 %~98.0%,氨基酸同源性98.2%~99.6%。与汉城型标准株80-39株相比,S片段仅1个氨基酸位点发生变异;M片段有9个氨基酸位点发生变异,糖基化位点的数目和位置没有发生变化。结论 从江西省褐家鼠分离到两株汉城型病毒,病毒基因变异较小,型别相对稳定。     

Is Mycobacterium tuberculosis a closer relative to Gram-positive or Gram-negative bacterial pathogens?

The phylogenetic position of Mycobacterium tuberculosis relative to other bacteria is controversial. Its cell wall has characteristics of both Gram-positive and Gram-negative bacteria. In the standard reference of bacterial phylogeny based on 16S ribosomal RNA sequence comparison, M. tuberculosis belongs to the high G+C Gram-positive bacteria that form a monophyletic group with the low G+C Gram-positive bacteria such as Bacillus subtilis. Some analyses indicate no particular relationship between these two groups. The availability of the complete genome sequence of M. tuberculosis allows us to reexamine this issue from genomic perspectives, as genome-based phylogenies may be more representative of the evolutionary history of whole organisms than molecular trees. In the genome tree constructed based on conserved gene content, M. tuberculosis is more related to Gram-negative than to Gram-positive bacteria as reflected by the evolutionary distance between nearest ancestral units. This conclusion may be supported by another analysis showing that M. tuberculosis shares relatively more orthologous genes for energy production and conversion with Gram-negative bacteria, in particular, Escherichia coli and Pseudomonas aeruginosa, than with Gram-positive bacteria.     

大林姬鼠中汉坦病毒的分离及M片断全基因序列分析

目的研究吉林省疫区大林姬鼠中携带的汉坦病毒的分子生物学特征，并探讨其分子进化规律。方法应用直接免疫荧光、RT-PCR法进行分型检测；阳性鼠肺标本用Vero-E6细胞分离病毒；测定汉坦病毒CJilin 93株的M片断序列，并进行同源性比对和进化树分析。结果从58份大林姬鼠肺组织标本中共检测到4个阳性标本，从中分离出2株病毒：CJilin 89和CJilin 93；测序结果显示CJilin 93株M基因全长3577bp，编码一个含有1135氨基酸的G蛋白前体(GPC)。序列分析表明CJilin 93株与分离自黑线姬鼠的Bao14株核苷酸序列同源性为97．2％，氨基酸同源性为99．4％；而与同样分离自俄罗斯远东地区大林姬鼠的AMR系病毒的同源性较远。系统发生树表明CJilin 93株和Bao14株最为接近，共处于同一分支。结论在俄罗斯远东地区和我国东北地区的大林姬鼠中携带不同种系的汉坦病毒。     

The Bulgarian vaccine Crimean-Congo haemorrhagic fever virus strain

The Crimean-Congo haemorrhagic fever virus (CCHFV) is a 3-segmented RNA virus, which causes disease with a high fatality rate in humans. An inactivated suckling mouse brain-derived vaccine is used in Bulgaria for protection against CCHF. Strain V42/81 is currently used for the vaccine preparation. As the M-RNA segment plays a major role in the immune response, the full-length M segment sequence of the V42/81 strain was characterized. A great genetic diversity was observed among CCHFV strains. In order to gain an insight into the topology of the strain in the CCHFV phylogenetic trees, the full-length S and partial L segments were additionally sequenced and analyzed.     

中国广西登革3型病毒分离株基因组序列特征分析

目的对我国广西登革3型病毒分离株桂登-1株(GD-1株)和桂登-11株(GD-11株)进行全基因组序列测定和分析,为了解其地理来源提供依据。方法根据GenBank提交的登革3型病毒基因序列设计9对引物,RT-PCR方法分段扩增GD-1和GD-11株基因序列,测序后进行拼接,得到其全基因组序列。结果两株病毒全长均为10 707nt,与国际参考株H87株核苷酸同源性为96.0%,氨基酸同源性为98.8%。GD-1株和GD-11株间仅有4个氨基酸差异,二者与H87株分别存在39和41个氨基酸差异。对3’UTR二级结构进行预测,二者与H87株存在较大差异。根据E蛋白基因序列对两株病毒进行进化分析,GD-1和GD-11均属于亚型Ⅱ,与分离自泰国的两毒株进化关系较近。结论 GD-1和GD-11均属于登革3型病毒亚型Ⅱ,二者可能是源自泰国的病原。     

贵州省安顺地区蛇源裂头蚴分离株的分子鉴定及种系发育关系分析

目的 对贵州省安顺地区蛇源裂头蚴分离株进行分子鉴定及种系发育关系的分析。方法 采集贵州安顺地区4种常见野生蛇(王锦蛇、乌梢蛇、黑眉锦蛇、灰鼠蛇)来源的裂头蚴,分别提取各裂头蚴基因组DNA,PCR扩增ITS1和cox1基因,所得PCR扩增产物经纯化并T-A克隆后测序。运用ClustalX1.81生物分析软件,将所得序列与GenBank所录迭宫属绦虫和其它属绦虫基因序列进行多重序列比对分析,并应用软件MEGA 6.0构建系统发育树(邻位连接法)。结果 成功扩增出8株裂头蚴的ITS1和cox1基因序列,ITS1大小为822~863 bp,cox1大小为404~415 bp,与预期的基因片段大小一致。基于ITS1和cox1基因序列构建的种系发育树与所有的猬迭宫绦虫均构成同一亚群,总分支的自展值高于50%,二者在不同的分离株之间呈现基因多态性。对8株裂头蚴ITS1和cox1序列的同源性进行比较,ITS1的同源性为70.27%~82.84%,而cox1的同源性为95.63%~99.50%,显示cox1的同源性高于ITS1。已向GenBank提交ITS1和cox1新序列各一条,登录号分别为KF990161和KJ418421。结论 贵州安顺地区不同蛇源裂头蚴分离株之间存在基因多态性。从总分支的自展值来看,cox1比ITS1更适合用于种内遗传多态性研究,ITS1适合做定种的分子标记。