体外扩增核酸技术进展及其应用

<正> 新近诞生的聚合酶链锁反应(Polymerase ChainReaction,PCR)及改进的Q-beta复制酶反应(Q-betaReplicase Reaction,QBRR)等系列相关技术,是一种高效能的分子生物学技术,对核酸序列进行体外酶扩增,这一指数扩增效能可达10~7一10~9甚至能检测到一个单独的核酸分子,堪称生命科学史上的一场新技术革命。 一、PCR技术进展 它是一种模拟天然DNA复制过程,以耐热DNA聚合酶(Tag酶)催化多轮次链延伸反应为基础的体外扩增特异性DNA片段的一种方     

分子方法在利什曼原虫虫株鉴定和系统发生研究中的应用

利什曼原虫虫种复杂,致多种形式的利什曼病,且其媒介也具多样性,正确鉴定利什曼原虫对及时治疗和制定有效的控制策略至关重要。该文介绍了同工酶酶谱分析、单克隆抗体、核型分析、核酸杂交、基因测序、限制性片段长度多态性(RFLP)、随机扩增多态性DNA(RAPD)、微卫星DNA等分子技术和方法在利什曼原虫虫株鉴定和系统发生研究中的应用及进展情况。     

日本血吸虫大陆株粘蛋白样蛋白部分基因的克隆

目的构建日本血吸虫中国大陆株粘蛋白样蛋白(SjMLP)核酸疫苗。方法分子克隆常规操作将扩增产物 SjMLP 编码区基因序列克隆至载体 pUCm-T 中,然后亚克隆到真核表达载体 pcDNA3.1( )中。结果经酶切、PCR 及测序鉴定表明所构建的质粒 pUCm-T/SjMLP 和 pcDNA3.1( )/SjMLP 中含有所扩增的基因序列。结论成功地构建了含目的基因的真核表达质粒 pcDNA3.1( )/SjMLP,从而,为进一步对其进行 DNA 免疫系列研究工作奠定了基础。     

多聚酶链反应在传染病诊断中的应用

多聚酶链反应(Polymerase chain reaction,PCR)是一种基因体外扩增技术,自1985年问世以来,受到医学研究各个领域的重视。由于它较沿用的病原体分离培养、免疫化学、血清学检测以及核酸杂交技术有更高的敏感性与特异性,在感染性疾病的病原诊断方面已得到广泛的应用。PCR 的原理和特点PCR 是一种在体外模拟自然 DNA 复制的核酸扩增技术,整个反应过程基本上由变性、结合(退火)、延伸三个步骤组成。首先,在90～95℃条件下使双链 DNA 分子变性解链为单链 DNA,接着在40     

恶性疟原虫FCC1/HN株嘌呤核酸磷酸化酶(PNP)基因的克隆和原核表达

目的 从恶性疟原虫基因组中扩增、克隆恶性疟原虫嘌呤核酸磷酸化酶(PNP)基因,并进行原核表达产物。方法根据恶性疟原虫FCB株嘌呤核酸磷酸化酶基因编码序列,设计一对引物,引入EcoR I和Xho I。采用PCR技术从恶性疟原虫FCC/HN株基因组DNA中特异扩增PNP基因。纯化后扩增产物用EcoR I和Xho I双酶切后,定向克隆入原核质粒pET30a( )和真核质粒pcDNA3,重组质粒pET30a( )-PNP转化大肠杆菌BL21(DE3),筛选阳性重组子后,用PCR、EcoRI Xho I双酶切和DNA序列测定鉴定。用IPTG诱导重组质粒pET30a( )-PNP表达融合蛋白。结果 从恶性疟原虫FCC1/HN株基因组中特异扩增出PNP基因,将扩增的目的基因亚向插入pET30a( )和pcDNA3表达质粒的EcoR I和XhoI位点;重组子pET30a( )-PNP在大肠杆菌BL21(DE3)诱导表达中表达,表达融合蛋白分子量为31.4kDa。结论 从恶性疟原虫基因组中获取PNP基因,并成功构建pET30a( )-PNP和pcDNA3-PNP重组质粒,获得PNP原核表达产物。     

弓形虫GRA8基因真核表达重组质粒的构建、鉴定及测序

目的 构建弓形虫RH株pcDNA3，1( )-GRA8真核表达重组质粒，为进一步DNA免疫做准备。方法 用聚合酶链反应(PCR)从弓形虫RH株的基因组DNA中扩增编码致密颗粒蛋白(GRA8)的基因片段，纯化后重组入pUC-19克隆载体，再经含IPTG，XGal氨苄培养基蓝白筛选，挑选白色克隆酶切，低溶点琼脂糖纯化，回收目的基因亚克隆入pcDNA3．1( )，经氨苄培养基过夜培养挑选6个克隆提纯酶切，PCR鉴定和测序。结果 从RH株基因组DNA中扩增出特异的GRA8基因片段，克隆成功pcDNA3．1( )-GRA8重组质粒。测序表明GRA8这部分基因与GENEBANK相应基因序列完全一致。结论 本结果为研究抗弓形虫核酸疫苗打下基础。     

幽门螺杆菌hpaA核酸疫苗的构建及免疫原性检测

目的 构建含幽门螺杆菌(Hp)hpaA基因的核酸疫苗。方法 抽提Hp标准菌株CCUG17874基因组DNA，应用聚合酶链式反应(PCR)技术从基因组DNA扩增hpaA基因，克隆入pUCmT载体，检测hpaA基因序列，经过一系列酶切、连接反应将其克隆入真核表达载体plRES，转入大肠杆菌，筛选阳性克隆，通过PCR和酶切反应鉴定。通过脂质体法将构建好的重组载体pIRES-hpaA转染COS-7细胞，SDS-PAGE及Western印迹法检测pIRES-hpaA表达HpaA蛋白的免疫原性。结果 成功扩增出长约750bp的hpaA基因．测序结果表明扩增出的hpaA基因与Hp hpaA序列一致，PCR和酶切鉴定结果证实hpaA基因克隆入真核表达载体pIRES，成功构建了含hpaA基因的Hp核酸疫苗pIRES-hpaA，并经Western印迹法检测到特异性蛋白条带。结论 构建了hpaA基因的Hp核酸疫苗，为进一步探索其免疫作用奠定了基础。     

乙型肝炎病毒全长基因的扩增及克隆

目的 建立血清标本经聚合酶链反应(PCR)扩增乙型肝炎病毒(HBV)全长基因的新方法,并初步进行克隆分析,从而为HBV分子生物学及致病机理研究奠定基础.方法 针对位于整个HBV基因序列中的两个缺口区设计含酶切位点的引物,扩增3.2 kb HBV全长DNA,经酶切及连接后克隆人PUC18载体.结果 用PCR方法成功获得了3.2 kb HBV DNA,经Sal Ⅰ酶切克隆入PUC18载体,获得重组质粒PUC18/HBV3.2,酶切鉴定和PCR扩增证实重组质粒中含有3.2 kb HBV全长DNA,成功构建了HBV全基因克隆.结论 成功建立了从患者血清中克隆HBV全基因组的方法,为从全基因水平深入研究乙型肝炎病毒变异与致病机理的关系奠定了基础.     

嗜肺军团菌主要外膜蛋白与鞭毛亚单位蛋白双基因融合表达载体的构建及其诱导表达

目的构建嗜肺军团菌主要外膜蛋白S基因(mompS)与鞭毛亚单位蛋白基因(flaA)的融合表达载体,并在原核系统表达。方法以嗜肺军团菌1型DNA为模板,PCR分别扩增获得嗜肺军团菌mompS基因和flaA基因,与带有硫氧还蛋白(Trx)基因的高效原核表达质粒pET32a(+)定向重组,构建mompS与flaA基因完全融合的重组质粒,经限制性核酸内切酶酶切鉴定、PCR和核酸序列分析后,以IPTG诱导表达Trx-MOMPS-FlaA融合蛋白,用SDS-PAGE及Western blot进行鉴定。结果限制性核酸内切酶酶切鉴定、PCR和核酸序列分析表明,扩增出了嗜肺军团菌904bp的mompS及1432bp的flaA基因,成功构建了重组质粒pET-LpSF,SDS-PAGE及Western blot分析显示重组质粒pET-LpSF在原核系统中得到了表达。结论成功构建了嗜肺军团菌mompS-flaA双基因的原核融合表达载体,并在大肠杆菌中得到了表达,为进一步研究嗜肺军团菌核酸双价疫苗提供研究基础。     

应用长片段PCR扩增全长HIV-1 DNA的研究

目的 探讨长片段PCR(LD-PCR)扩增特点,并将它用于对全长HIV DNA的研究。方法 应用LTR(U5)/LTR(R),CL-NSC/CL-NEF和gagA1/gagA2等不同引物,~(32)P标记gag、pol、nef和tat等为片段探针,对克隆有HIV-1完整基因片段、部分基因片段的质粒和HIV感染者外周血单核细胞(PBMC)中的HIV-1 DNA进行扩增。结果 LD-PCR对0.4～9kb的一系列标本扩增都很满意,它的扩增效率与DNA分子片段的大小成反比,在混合竞争扩增中,短片段DNA浓度较低时主要扩增长片段标本,增加短片段浓度导致减少长片段DNA的扩增。同时发现在HIV感染者中存在大量大小不一、范围较广的缺失HIV-1基因片段。结论 LD-PCR能混合扩增不同大小片段标本,特别是对大片段标本的扩增具有独特的优越性,是普通PCR无法解决的。     

幽门螺旋菌检测的分子生物学基础

核酸DNA具有稳定性高、特异性强等特征,据此建立的HP核酸检测法开创了HP检测的新格局;聚合酶链反应(PCR)的发明更使该法如虎添翼。目前,根据HP尿素酶基因16SrRNA、克隆的特异性抗原基因设计的引物对样品进行PCR扩增,可使检测灵敏度达10～100个HP菌或0.01～0.1pg DNA。HP的限制片长多态性(RFLP)分析、HP质粒、HP核糖体指纹图等方法也为鉴别各HP分离株提供了强有力的手段,任意引物扩增多态性(RAPD)分析法几乎可体现100％各分离株(60例)的差异。在临床上基于PCR的HP菌检测法巳广泛应用于包括唾液、牙斑、胃液、粘膜组织、粪便等样本的HP检测,并为HP流行病学调查研究提供一种新的手段     

特异性抗人胰腺癌细胞株8988s突变型K-ras mRNA核酸代酶的设计

目的:设计特异切割人胰腺癌8988s细胞株中突变型K-ras基因mRNA的核酸代酶(ribozyme)。方法:PCR扩增人胰腺癌细胞株8988s的K-ras基因第一外显子,克隆并测序,明确有否突变、突变类型,以该基因mRNA为靶分子,进行计算机二级结构预测分析,选择核酸代酶切点,并进行基因组同源性分析,设计理论上最佳的核酸代酶。结果:人胰腺癌8988s中K-ras基因12密码子有突变,突变类型为GGT→GTT,设计筛选了三种针对人胰腺癌8988s突变型K-ras mRNA的核酸代酶分子,其中一种为特异性的。结论:人胰腺癌8988s中K-ras突变位点可成为特异性核酸代酶切割位点,切割此位点的核酸代酶对野生型K-ras mRNA功能无影响,K-ras编码序列中第199、205、217位点也为核酸代酶切割的理想位点。     

弓形虫GRA1基因的体外扩增、克隆及鉴定

目的　体外扩增弓形虫RH株致密颗粒蛋白GRA1基因 ,并构建真核表达质粒。方法　从接种了弓形虫RH株的小鼠腹水中收集、纯化速殖子 ,提取基因组DNA ;据已知的GRA1基因列 ,设计合成一对引物 ,并引入EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位点。应用PCR技术 ,从弓形虫RH株基因组DNA中扩增GRA1基因片段。扩增目的基因片段经纯化、双酶切后 ,插入真核表达质粒pEGFP -N3中 ,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞 ,于卡那霉素阳性LB平板上筛选阳性克隆。重组子经EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切、PCR鉴定。结果　从弓形虫RH株基因组DNA中扩增出 785bp的GRA1基因片段 ,构建重组质粒pEGFPN3-GRA1,酶切和PCR鉴定产物大小均与预期值相符。 结论　成功地从弓形虫RH株基因组DNA中获取了GRA1基因 ,并构建了pEGFPN3-GRA1重组质粒。为重组质粒的进一步表达和核酸疫苗的研究创造了条件     

淮南地区幽门螺杆菌对克拉霉素耐药性及其耐药分子机制的研究

目的探讨淮南地区幽门螺杆菌(Helimbacter pylori,Hp)对克拉霉素耐药情况及其耐药分子机制。方法用E-test和琼脂稀释法进行克拉霉素药敏试验,提取Hp基因组DNA,PCR扩增Hp 23S rRNA基因,并用PCR-限制性片段长度多态性(RFLP)分析克拉霉素耐药机制。结果淮南地区克拉霉素耐药率为9.15%(27/141),克拉霉素耐药与性别、年龄无关。PCR从Hp基因组DNA中扩增出425bp的Hp 23S rRNA基因,PCR-RFLP检测,27株耐药菌株均可被Bbsl酶切成332、93bp两个片段,未检测到被BsaⅠ酶切的耐药菌株。结论淮南地区克拉霉素耐药率较高,耐药菌株存在23S rRNA基因功能区V2143位点A-G突变。     

RNA基因诊断技术的研究进展

目前医学已进展到了基因水平、分子水平。基因诊断技术作为一门新兴的诊断技术,日益被人们重视及应用。在分子生物学研究中,核酸的研究始终占据着中心地位。生物界的核酸分为两类,即核糖核酸(ribonucleic acid,RNA)及脱氧核糖核酸(deoxyri-bonucleic acid,DNA)。本文重点介绍几种 RNA 基因诊断技术:(一)聚合酶链反应(Polymerase ChainReaction,PCR)。(二)一种新的核酸序刊扩增技术(Nucleic acid sequence-based amplification,NASBA)。(三)Northern 印迹杂交及原位杂交。(四)单链 RNA 探针(ssRNA)杂交。现分别叙述如下。一、聚合酶链反应(PCR)PCR 是一种摸拟 DNA 复制过程,在体外扩增特异性 DNA 片段的分子生物学新技术,由美国 Ce-     

分子生物学技术在心血管疾病机理研究中的应用

心血管疾病严重危害人类的生命健康,许多心血管疾病的发病机理还不完全清楚。随着研究的深入,尤其分子生物学的发展,人们逐渐认识到,包括心血管疾病在内的许多疾病的生理、病理机制的本质问题是相关基因的表达及其调控。很多心血管疾病的研究已深入到分子生物学水平。人们寻找疾病相关基因,研究其表达调控机制,希望在分子水平阐明疾病发生机制,以期更有效地进行疾病的诊断、治疗。相应地,很多分子生物学研究技术也应用到对心血管疾病的研究中来,成为不可或缺的基本手段,如分子杂交技术、PCR技术、反义核酸技术、DNA微阵列、转基因技术等…     

DNA实时荧光恒温扩增法在结核病临床检测中的应用价值

目的 分析DNA实时荧光恒温扩增法(简称“恒温扩增法”)在结核病临床检测中的应用价值。 方法 收集2019年1—6月西安市胸科医院收治的疑似肺结核患者2421例,其中共有356例患者留取的痰液标本同时进行了BACTEC MGIT 960液体培养、利福平耐药实时荧光定量核酸检测(GeneXpert MTB/RIF法)、传统DNA实时荧光定量核酸检测(FQ-PCR法)、结核分枝杆菌RNA实时荧光恒温扩增(SAT-RNA法)、恒温扩增法检测。以MGIT 960技术检测结果为金标准,计算其他4种检测技术的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值、符合率、Kappa值。对恒温扩增法阳性的121份核酸样本使用熔解曲线法检测利福平ropB基因,研究恒温扩增法提取核酸应用于耐药基因检测的价值。 结果 以MGIT 960技术检测结果为金标准,恒温扩增法的敏感度(78.83%,108/137)低于GeneXpert MTB/RIF法 (95.62%,131/137),高于FQ-PCR法(74.45%,102/137)和SAT-RNA法(59.12%,81/137),差异均有统计学意义(χ ²值分别为47.437、43.654、29.467,P值均<0.001)。GeneXpert MTB/RIF法的ROC曲线下面积最大(0.910),随后依次为恒温扩增法(0.860)、FQ-PCR法(0.854)、SAT-RNA法(0.789)。恒温扩增法阳性的核酸标本用熔解曲线法检测利福平ropB耐药基因,原核酸和稀释5倍后核酸荧光检测的dt值(探测时间,detection time,1dt=1min)在26~30时,ropB基因的检出率分别为93.55%(29/31)和90.32%(28/31);dt值在15~25时,ropB基因的检出率分别为94.44%(34/36)和100.00%(36/36)。结论 通过与各种检测技术比较,恒温扩增法具有临床应用价值,并适用于基层医院的结核病诊断。     

沙门氏菌的invA基因序列分析与分子检测

目的采用聚合酶链反应和DNA序列分析,了解沙门氏菌侵袭蛋白A(invasionproteinA,invA)基因核苷酸序列有何差异,建立沙门氏菌的分子快速检测方法。方法根据沙门氏菌的invA基因核苷酸序列设计一对引物,应用聚合酶链反应技术,分别对3种沙门氏菌标准菌株的invA基因及6种非沙门氏菌株进行PCR扩增,并将扩增的片段进行克隆及序列分析。结果3种沙门氏菌标准菌株PCR均扩增出283bp的特异条带,非沙门氏菌皆无特异带扩增;DNA序列分析证实,沙门氏菌的invA基因核苷酸序列比较保守。结论本研究建立的检测沙门氏菌方法具有较高的特异性与灵敏性,invA基因的序列分析为进一步研究沙门氏菌不同分离株的流行病学、遗传学与分子致病机理奠定了基础。     

日本血吸虫Calpain序列分析及DNA疫苗体系的构建

目的　探讨日本血吸虫疫苗候选分子 -钙离子激活的中性蛋白激酶 (Calpain)在抗日本血吸虫感染的保护性作用及其保护性免疫机制。方法　从日本血吸虫成虫中提取RNA ,用RT -PCR扩增Calpain含多个B ,T细胞表位的片段 ,引物中包含BamHI和EcoRI的酶切位点 ,PCR扩增产物经纯化后TA克隆 ,转化的阳性TA克隆经PCR筛选后 ,液体培养大肠杆菌并回收质粒DNA ,质粒DNA经BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切 ,目的基因亚克隆到真核表达质粒pVAC载体 ,构建 pVAC -Cal pain真核表达体系 ,转化的阳性亚克隆经PCR筛选 ,液体培养大肠杆菌并回收pVAC -Calpain质粒DNA ,质粒DNA经BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切和DNA序列分析鉴定被亚克隆的Calpain基因。 结果　RT -PCR从日本血吸虫RNA中扩增了 4 5 3bp的Calpain基因 ,经BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切和DNA序列分析鉴定Calpain基因被克隆到真核表达质粒 pVAC载体。 结论　日本血吸虫疫苗候选分子Calpain的DNA疫苗体系的建立将有助于解析这个疫苗候选分子抗日本血吸虫感染的保护性免疫作用及保护性免疫机制。     

恶性疟原虫海南分离株裂殖子表面蛋白2真核表达重组质粒的构建

目的　构建恶性疟原虫海南分离株 ( FCC1/ HN)裂殖子表面蛋白 2 ( MSP2 )融合 HBs Ag基因片断真核表达质粒 p VX-ORF1- Pf MSP2 - HBS及重组真核表达质粒 p VXORF1- Pf MSP2 ,为疟疾核酸疫苗及蛋白疫苗的研制奠定基础。　方法　 ( 1)采用 PCR技术对恶性疟原虫 FCC1/ HN株 MSP2 原核表达质粒 PET2 8α- MSP2 的 MSP2 基因进行扩增 ,扩增产物经纯化后用 Bam H 酶切 ;质粒 p VXORF1- Pv MSP1 .1 9- HBS用相同的酶酶切 ,经纯化后用 T4DNA连接酶将其与酶切后纯化的 MSP2 基因连接 ;( 2 )分别用Bam H +Xho 双酶切 PET2 8α- MSP2 质粒 DNA和 p VXORF1质粒 DNA,纯化后将目的基因片断用 T4DNA连接酶连接 ;将 ( 1)、( 2 )连接产物分别转化大肠杆菌 DH5α。于氨苄青霉素阳性 L B培养平板上筛选阳性克隆 ,酶切电泳鉴定。　结果　筛选出的重组子为编码 FCC1/ HN MSP2 基因片断的重组质粒 p VXORF1- Pf MSP2 - HBS及 p VXORF1- Pf MSP2 。　结论　编码 FCC1/ HN MSP2 基因片断真核表达质粒 p VXORF1- Pf MSP2 - HBS和 p VXORF1- Pf MSP2 的构建为疟疾核酸疫苗及蛋白疫苗的研制奠定了基础。