肺炎链球菌不同菌株自溶酶基因的克隆、序列分析及重组表达

目的克隆肺炎链球菌自溶酶(LytA)的基因序列，并进行重组表达。方法分别提取不同临床分离株的基因组DNA，根据已知肺炎链球菌野生R6株LytA基因序列设计引物，进行PCR扩增，将获得的目的基因片段克隆人原核表达质粒，然后测序；利用生物信息学方法，对不同临床分离株LytA基因序列进行比较分析，同时进行LytA基因的重组表达。结果从不同临床分离株的基因组中均扩增出完整的LytA基因片段，成功构建了重组质粒pGEX-4T-1-LytA。比较不同临床分离株LytA基因的DNA序列及推测的氨基酸序列，发现各株LytA基因序列及氨基酸序列间存在差异。通过异丙基巯基半乳糖(IPTG)诱导，LytA基因在大肠埃希菌JM109中得到高效表达，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)结果显示pGEX-4T-1-LytA融合蛋白相对分子质量约62000，与理论预测一致。结论序列分析发现各分离株的LytA基因序列及氨基酸序列间存在差异，但同源性极高，推测LytA基因序列保守，可用于疫苗研发。     

一种新的弓形虫速殖子纯化方法

我们试用Ficoll-Urografin密度梯度离心法取得高纯度、高收获率的速殖子,现将此法报告如下。一、材料与方法 (一)弓形虫虫株 RH、ZS_1、ZS_2株为本实验室长期保种传代虫株;CN株为浙江省寄生虫病研究所引种;SH-1株采自上海第二医科大学寄生虫学教研室。5种虫株分别腹腔接种BALB/C小鼠,3d后抽取腹腔液15ml,磷酸缓冲加糖溶液洗涤3次,1000r×8min,制成速殖子悬液。 (二)Ficoll-Urografin密度梯度离心吸取5ml速殖子悬浮液加入10ml离心管内,用弯头吸管从悬浮液底部加入Ficoll-Urografin液5ml,经离心后管中形成     

弓形虫表面抗原SAG3基因片段克隆及序列测定

目的 克隆弓形虫ZS2及RH株SAG3表面抗原基因片段，并进行序列分析。方法 设计合成引物，从弓形虫ZS2、RH及ZS1株基因组DNA中分别特异扩增出编码SAG3抗原的基因片段。扩增的目的片段经纯化后用EcoRⅠ和BamH Ⅰ双酶切后，克隆到原核表达质检pGEX-47-2中，转化入大肠杆菌JMl09，用PCR初筛，将PCR扩增阳性的重组子用EooRⅠ和BamH Ⅰ双酶切鉴定，并进行序列的测定。结果 从弓形虫ZS2、RH和ZS1株DNA中扩增出1176bp的SAG3基因，构建重组质检pGEX-47-2-SAG3(pGEX—SAG3)，酶切产物的大小分别与预期相符。结论 成功地对弓形虫ZS2、RH和ZS1株SAG3基因进行体外扩增及构建原核表达重组质检pGEX-SAG3，并经酶切及序列分析所验证，为弓形虫SAG3表面抗原的表达、体外诊断研究做好准备。     

刚地弓形虫LDH-Like MDH cDNA的克隆和序列分析

目的获取弓形虫RH株速殖子苹果酸脱氢酶(MDH)的cDNA全长序列，并对推导翻译出的氨基酸(aa)序列进行分析。方法将NCBI GenBank中登录的弓形虫MDH EST序列进行比对、拼接和电子延伸，发现近5’末端的部分核酸序列缺失。基于分析，设计的上游、下游引物分别包含起始密码子ATG和终止密码子TGA(TGA→UGA)，使经RT-PCR扩增出的片段对应完整的CDS或者ORF。之后对MDHCDS推导翻译出的aa序列进行了保守功能域和同源性分析。结果本研究克隆的MDH的cDNA全长951bp，推导翻译出的蛋白质有316个aa组成，约35kDa，与预期大小接近。保守功能域分析表明，弓形虫MDH最接近类-乳酸脱氢酶型(lactate dehydrogenase-like)MDH，其准确定名缩写为LDH-like MDH，同时弓形虫MDH还具有其它脱氢酶类的特征。弓形虫MDH除与隐孢子虫和恶性疟原虫高度同源外，还与很多细菌等物种同源，但与人的同源性最低(22％)。弓形虫MDH cDNA序列在NGBI GenBank中登录号为AY650028，对应aa序列的登录号为AAT67462。结论本研究首次获得了弓形虫MDH基因的全长cDNA序列和对应的aa序列。MDH是三羧酸循环中的重要酶类，该酶活性的改变。将直接影响弓形虫的存活。弓形虫MDHaa序列与人MDH蛋白间的同源性很低，提示基于MDH蛋白作为药靶，经高通量技术筛选抗弓形虫药具有可行性。     

弓形虫GRA1基因的体外扩增、克隆及鉴定

目的　体外扩增弓形虫RH株致密颗粒蛋白GRA1基因 ,并构建真核表达质粒。方法　从接种了弓形虫RH株的小鼠腹水中收集、纯化速殖子 ,提取基因组DNA ;据已知的GRA1基因列 ,设计合成一对引物 ,并引入EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位点。应用PCR技术 ,从弓形虫RH株基因组DNA中扩增GRA1基因片段。扩增目的基因片段经纯化、双酶切后 ,插入真核表达质粒pEGFP -N3中 ,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞 ,于卡那霉素阳性LB平板上筛选阳性克隆。重组子经EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切、PCR鉴定。结果　从弓形虫RH株基因组DNA中扩增出 785bp的GRA1基因片段 ,构建重组质粒pEGFPN3-GRA1,酶切和PCR鉴定产物大小均与预期值相符。 结论　成功地从弓形虫RH株基因组DNA中获取了GRA1基因 ,并构建了pEGFPN3-GRA1重组质粒。为重组质粒的进一步表达和核酸疫苗的研究创造了条件     

广州管圆线虫Ⅳ期幼虫cDNA文库的筛选及EST序列分析

目的 筛选和鉴定广州管圆线虫未知基因序列,丰富该虫的基因序列数据,为寻找诊断或药物靶点分子提供实验依据.方法 构建广州管圆线虫Ⅳ期幼虫cDNA噬菌体文库,随机挑选单个噬菌斑,提取噬菌体DNA进行PCR,扩增其插入的cDNA片段并对PCR产物进行序列测定;采用生物信息学方法对表达序列标签(expressed sequence tags,EST)序列进行分析.结果 获得了51条广州管圆线虫基因的EST序列,并提交至GenBank,这些基因包括半乳糖凝集素10,半乳糖凝集素140,表皮蛋白,CRE-RPS-24蛋白等.序列分析结果提示,表皮蛋白和CRE-RPS-24蛋白可能为具有诊断价值的抗原分子,值得进一步研究.结论 获得51条广州管圆线虫基因序列,为进一步研究广州管圆线虫致病机制及候选抗原分子提供了新的序列信息.     

含弓形虫ROP1基因真核表达重组质粒DNA免疫小鼠的研究Ⅴ.IFN-γ基因真核表达重组质粒的构建及其在DNA免疫中基因佐剂的作用

目的构建IFN-γ基因真核表达重组质粒作为基因佐剂,观察其与pcDNA3-ROP1(pc-ROP1) DNA共同免疫小鼠所诱导的免疫应答.方法将IF N-γ基因片段定向插入真核表达载体pcDNA3,双酶切鉴定,获得pcIFN重组子;碱裂解法大量制备,经肌肉注射免疫BALB/c小鼠,每只鼠注射pcIFN、pc-ROP1各100μg,两周后同量加强免疫一次,以pcDNA3空质粒及生理盐水组为对照.分别于免疫后第30天、50天、70 天共三次用MTT法测定小鼠脾脏T淋巴细胞增殖活性及NK细胞活性;双夹心ELISA测定血清细胞因子IFN-γ、IL-2及酶法测定NO含量;ELISA法测定IgG抗体滴度.结果构建成功的作用下,该两项指标均明显提高,且IFN-γ、IL-2及NO水平均较不加佐剂组显著提高(P＜0.01);而对IgG抗体滴度无显著影响(P＞0.05).结论 IFN-γ基因佐剂具有协同pc-ROP1DNA免疫的作用,可增强免疫鼠细胞免疫应答,IFN-γ、IL-2细胞因子及NO的产生.     

华支睾吸虫成虫RPEF基因产物及其抗RPEF多克隆抗体的制备

目的 体外制备华支睾吸虫成虫RNA聚合酶Ⅱ延长因子(RPEF)基因产物及抗RPEF多克隆抗体.方法 亲和纯化试剂盒纯化表达蛋白pGEX-4T-1-RPEF,凝血酶酶切表达蛋白制备重组蛋白RPEF,将重组蛋白RPEF免疫小鼠,制备多克隆抗血清,检测抗体滴度和抗血清特异性.结果 体外制备的RPEF蛋白经SDS电泳呈单一条带;酶联免疫吸附结果显示,免疫过程抗体滴度呈连续上升趋势;免疫印迹结果显示,小鼠抗血清具有抗RPEF特异性.结论 获得较专一的华支睾吸虫RPEF蛋白和RPEF抗血清.     

华支睾吸虫成虫RPEF基因产物及其抗RPEF多克隆抗体的制备

目的 体外制备华支睾吸虫成虫RNA聚合酶Ⅱ延长因子(RPEF)基因产物及抗RPEF多克隆抗体.方法 亲和纯化试剂盒纯化表达蛋白pGEX-4T-1-RPEF,凝血酶酶切表达蛋白制备重组蛋白RPEF,将重组蛋白RPEF免疫小鼠,制备多克隆抗血清,检测抗体滴度和抗血清特异性.结果 体外制备的RPEF蛋白经SDS电泳呈单一条带;酶联免疫吸附结果显示,免疫过程抗体滴度呈连续上升趋势;免疫印迹结果显示,小鼠抗血清具有抗RPEF特异性.结论 获得较专一的华支睾吸虫RPEF蛋白和RPEF抗血清.