1例国内罕见的输入性卵形疟的实验室检测

目的对1例输入性疑似疟疾患者的血样进行实验室检测。方法制备疑似疟疾患者血样的血涂片,吉姆萨染色后进行疟原虫的镜检观察。利用实验室自行研制的疟原虫属特异性（通用型）和4种疟原虫种特异性的巢式PCR和实时荧光PCR检测方法,对该血样进行疟疾检测及分型。将PCR扩增片段进行序列测定,并与已知的卵形疟序列进行blast比对分析。结合血样的分子生物学检测结果,重新对镜检结果进行复核。结果血样初次镜检为疟疾阴性。使用疟原虫巢式PCR通用引物对血样的DNA进行PCR检测,扩增出了预期大小约240bp的条带;巢式PCR分型检测表明,血样仅扩增出预期大小约450bp的卵形疟条带,无对应大小的恶性疟、间日疟和三日疟扩增条带产生。疟原虫通用型和卵形疟特异性的荧光PCR检测结果均为典型的S形阳性曲线,卵形疟扩增片段的熔解温度为72.5℃。序列分析表明,扩增片段长度为434bp,blast比对发现去除引物后的393个碱基与GenBank DQ845247等卵形疟的SSU rRNA对应部分的基因序列同源性为100%。重新对血涂片进行镜检复核,结果在薄血膜中发现了卵形疟的环状滋养体,被寄生的红细胞为椭圆形,边缘呈伞矢状。结论使用巢式PCR、实时荧光PCR、序列分析和镜检等方法,证实该例输入性的疑似疟疾患者为卵形疟原虫感染。     

巢式PCR技术在输入性卵形疟诊断中的应用研究

目的应用巢式PCR扩增小亚单位核糖体核糖核酸(18S r RNA)基因确诊卵形疟原虫感染。方法采集2012-2013年山东省疟疾患者全血和滤纸血样,吉氏染色镜检观察血膜疟原虫形态并鉴定虫种。提取血样中DNA,根据疟原虫18S r RNA基因以属和种特异性引物进行巢式PCR扩增,筛查卵形疟阳性标本并进行测序验证。结果2012和2013年山东省共筛查到7例输入性卵形疟原虫感染病例。巢式PCR扩增7份血样均在800 bp处出现卵形疟原虫特异性单一条带,Blast比对表明产物序列与Gen Bank卵形疟参考序列一致。结论经巢式PCR方法确诊了2012和2013年山东省7例输入性卵形疟病例。     

2015年重庆市3例输入性卵形疟原虫wallikeri亚种感染病例的实验室诊断

目的   分析重庆市2015年3例输入性卵形疟原虫wallikeri亚种感染病例病原、抗原及核酸检测过程,减少卵形疟原虫的漏诊和误诊。 方法  收集流行性病学资料及血样,按照WS259-2015疟疾的诊断标准对3例血样进行血涂片镜检、快速疟疾诊断试纸条检测（RDT）及巢式PCR检测。 结果  3例患者均为非洲务工归国人员,并都有疟疾发病史。血涂片镜检结果,3例血样均为疟原虫阳性。RDT检测结果3例均为除恶性疟以外其他疟原虫阳性。国家参比实验室推荐的巢式PCR检测DNA,3例均为阴性。用卵形疟原虫wallikeri亚种的种特异性引物的PCR检测,3例均为阳性。 结论  根据镜检、RDT和卵形疟原虫wallikeri亚种种特异性PCR检测确定,重庆市2015年首次发现了3例卵形疟原虫wallikeri亚种感染输入病例,为重庆地区首次发现。     

多重PCR种特异性检测恶性疟原虫和间日疟原虫方法的建立

目的建立恶性疟原虫和间日疟原虫种特异性检测的多蕈PCR方法,用于疟疾的检测和诊断.方法根据疟原虫18S核糖体小亚基ssRNA的基因序列设计合成8对11条引物,通过对恶性疟、间日疟患者及健康对照者血样的DNA进行扩增,选择出敏感性和特异性最佳的引物用于建立多重PCR方法,并用梯度变化的方法分别对引物浓度、复性温度、延伸温度和循环次数等反应参数进行比较分析,优化PCR反应条件.利用优化后的多重PCR埘采自云南和上海的139份疟疾患者血样和32份非疟疾患者血样进行检测,以镜检方法为金标准,分析多重PCR方法检测患者血样的敏感性和特异性.结果从8对11条引物中优选出2对共3条引物用于建立多重PCR.利用这3条引物进行多重PCR,一次反应即可完成对恶性疟原虫和间日疟原虫的种特异性鉴定.对疟疾和非疟疾患者血样检测结果显示,该方法检测患者血样的敏感性为97.8%,特异性为100%.结论多重PCR方法敏感、特异、可进行批量检测,适用于对人群的疟疾监测和疑似疟疾病例的诊断,并能鉴定恶性疟原虫和间日疟原虫虫种.     

山东省14例输入性卵形疟原虫wallikeri亚种的鉴定

目的 对山东省14例输入性卵形疟原虫wallikeri亚种进行鉴定分析。方法 收集14例输入性疟疾病例,进行快速疟疾诊断试纸条检测(RDT)、血涂片镜检、NP-1993常规巢式PCR鉴定和卵形疟原虫wallikeri(P. ovale wallikeri)亚种的特异性PCR检测。PCR扩增产物测序后,进行Blast比对分析。结果 14例患者RDT检测结果:泛疟原虫(非恶性疟)阳性12例,阴性2例;镜检结果,13例卵形疟原虫,1例间日疟原虫;NP-1993常规巢式PCR结果,14例样本4种疟原虫引物扩增结果均为阴性。P. ovale wallikeri亚种的特异性PCR检测结果:14例样本均能扩增到P. ovale wallikeri亚种特异性条带780 bp。Blast分析测序结果,检索结果为P. ovale wallikeri亚种。结论 14 例镜检阳性、NP-1993常规巢式PCR检测阴性的输入性疟疾病例均确诊为P. ovale wallikeri亚种感染。     

两种检测方法在间日疟和卵形疟诊断中的应用分析

目的分析疟原虫镜检和巢式PCR检测间日疟和卵形疟效果。方法收集2012～2016年输入性间日疟和卵形疟病例血样,巢式PCR检测疟原虫ssRNA基因,并与显微镜检结果进行比对。结果显微镜检和巢式PCR检测71份血样,间日疟、卵形疟、混合感染分别占74.6%、25.4%、0%和63.4%、29.6%、7%,符合率为81.7%;亚洲23份血样,镜检与巢式PCR均为间日疟,符合率为100%,巢式PCR检测非洲血样48份,间日疟、卵形疟和混合感染分别占45.8%、43.8%和10.4%,镜检与巢式PCR符合率为72.9%;巢式PCR检测26份卵形疟,经典curtisi、变种wallikeri和混合感染分别占80.8%、11.5%和7.7%,检出变种wallikeri总数占卵形疟19.2%。结论巢式PCR检测疟原虫虫种鉴别优于传统镜检法,可提高疟疾病例诊断水平。     

PCR-RFLP检测疟原虫方法的建立和应用效果

目的 建立 PCR-RFLP 方法检测疟原虫,并评价其应用效果。 方法 收集 2010-2018 年武汉市输入性疟疾患者血样。 根据 4 种人疟原虫线粒体细胞色素 b(Cytb)基因属、种特异位点,设计 1 组疟原虫属特异性公共引物。提取患者血样中的疟原虫 DNA,巢式 PCR 扩增得到产物后,用限制性内切酶 AluⅠ进行酶切,不同种疟原虫将产生特异性的酶切条带,建立 PCR-RFLP 检测方法。 分析该方法的灵敏度和特异度,并与巢式 PCR 相比较,评价其应用价值。 结果 PCR-RFLP 检测恶性疟、三日疟、间日疟和卵形疟血样(包括 curtisi 亚种和 wallikeri 亚种),最低检出阈值分别为 2. 5、2、3. 6、4、1. 5 个虫 / μL 血。 共检测 121 份疟疾血样和 45 份健康人血样,巢式 PCR 检出阳性 115 份,PCR-RFLP 方法检出阳性 118 份,灵敏度分别为 95. 0%和 97. 5%,结果一致性较好( Kappa值 = 0. 93),差异无统计学意义(χ² = 0. 8,P>0. 05)。 PCR-RFLP 分别检测日本血吸虫、利氏曼原虫、隐孢子虫样品无任何扩增条带产生,均为阴性。 结论 建立的 PCR-RFLP 方法实验流程相对简单,且检出阈值低,敏感度、特异度高,检测结果易于判断,是一种新的疟原虫核酸检测方法。     

河南省输入性卵形疟的实验室检测分析北大核心CSCD

目的对河南省输入性卵形疟进行实验室检测,比较不同方法的检测效果。方法采用镜检法、2种巢式PCR和2种疟原虫抗原快速检测试剂盒,对河南省2011-2016年采集的输入性卵形疟患者血样进行检测,比较不同方法的检出率。结果 110例卵形疟中curtisi亚种感染43例,占39.1%;wallikeri亚种感染67例,占60.9%。5种检测方法对卵形疟的总检出率,M-nest检测体系的巢式PCR法为100%,镜检法为94.5%,RDT-Wondfo法为51.8%,NP-1993检测体系的巢式PCR法为40.9%,RDT-CareStart法为25.5%,差异有统计学意义(χ2=205.940,P<0.05);对于卵性疟curtisi亚种,M-nest检测体系的巢式PCR法的检出率为100%,NP-1993检测体系的巢式PCR法为97.7%,镜检法为90.7%,RDT-Wondfo法为46.5%,RDT-CareStart法为18.6%,差异有统计学意义(χ2=109.700,P<0.05);对于卵性疟wallikeri亚种,M-nest检测体系的巢式PCR法检出率为100%,镜检法为97.0%,RDT-Wondfo法为55.2%,RDT-CareStart法为29.9%,NP-1993检测体系的巢式PCR法为4.5%,差异有统计学意义(χ2=190.292,P<0.05)。结论巢式PCR方法检测卵形疟敏感性高,但NP-1993检测体系的巢式PCR方法仅对卵形疟curtisi亚种敏感;镜检法次之;抗原检测的RDT方法敏感性低,且不同试剂盒的检出率不同。     

套式/多重PCR诊断疟疾的敏感性、特异性和稳定性初探

目的 提高标签引物?鄄套式/多重PCR诊断疟疾的敏感性、特异性与稳定性。 方法 用滤纸法采集非疟疾发热病人血样30份及其他传染病（感冒， 流感， 伤寒， 肝炎等）患者血样20份；抽取恶性疟和间日疟各1例患者血4 m1，进行系列稀释制备不同疟原虫含量的感染血样；健康者血样作对照。用热裂解法制备DNA模板，用线粒体细胞色素氧化酶基因作为靶基因，应用相关软件和网络资源（Primer Premier 5.0, PUBMED, NCBI-BLAST和Mfold服务器）设计和优化标签引物?鄄套式/多重PCR，并用于检测所采集制备的各种血样。 结果 间日疟与恶性疟患者血系列稀释为含 1 000、100、10和1个虫/μl后经标签引物?鄄套式/多重PCR检测，恶性疟和间日疟患者各稀释含虫血样分别在611 bp和255 bp出现1条带，能检测到原虫密度均为1个虫/μl血；非疟疾发热病人血样30份及其他传染病患者血样均为阴性；健康者血样未出现扩增条带，每种血样反复测试3次以上均获得同样结果。 结论 经优化的标签引物-套式/多重PCR在疟疾诊断中具有较高的敏感性、特异性和稳定性。     

河南省输入性卵形疟的实验室检测分析

目的对河南省输入性卵形疟进行实验室检测,比较不同方法的检测效果。方法采用镜检法、2种巢式PCR和2种疟原虫抗原快速检测试剂盒,对河南省2011-2016年采集的输入性卵形疟患者血样进行检测,比较不同方法的检出率。结果 110例卵形疟中curtisi亚种感染43例,占39.1%;wallikeri亚种感染67例,占60.9%。5种检测方法对卵形疟的总检出率,M-nest检测体系的巢式PCR法为100%,镜检法为94.5%,RDT-Wondfo法为51.8%,NP-1993检测体系的巢式PCR法为40.9%,RDT-CareStart法为25.5%,差异有统计学意义(χ2=205.940,P0.05);对于卵性疟curtisi亚种,M-nest检测体系的巢式PCR法的检出率为100%,NP-1993检测体系的巢式PCR法为97.7%,镜检法为90.7%,RDT-Wondfo法为46.5%,RDT-CareStart法为18.6%,差异有统计学意义(χ2=109.700,P0.05);对于卵性疟wallikeri亚种,M-nest检测体系的巢式PCR法检出率为100%,镜检法为97.0%,RDT-Wondfo法为55.2%,RDT-CareStart法为29.9%,NP-1993检测体系的巢式PCR法为4.5%,差异有统计学意义(χ2=190.292,P0.05)。结论巢式PCR方法检测卵形疟敏感性高,但NP-1993检测体系的巢式PCR方法仅对卵形疟curtisi亚种敏感;镜检法次之;抗原检测的RDT方法敏感性低,且不同试剂盒的检出率不同。     

巢式PCR法在疟疾检测及虫种鉴别中的应用

根据疟原虫小亚单位核糖体核糖核酸(SSU rRNA)基因序列设计疟原虫通用型和种特异性的引物,对60份血样进行巢式PCR检测及虫种鉴定,并与血样的吉氏染色镜检结果进行比较。巢式PCR检出40份疟原虫阳性血样,其中22份为恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)阳性、13份为间日疟原虫(P.vivax)阳性、3份为恶性疟原虫和间日疟原虫混合感染、1份为卵形疟原虫阳性(P.ovale)、1份未能分型。与镜检结果一致的血样为46份,占76.7%(46/60),其中恶性疟原虫阳性18份、间日疟原虫阳性11份和阴性17份。将两种检测结果不一致的血样进行扩增片段序列测定和实时荧光PCR分析,检测结果均与巢式PCR结果一致。卵形疟原虫阳性血样扩增片段的序列分析结果显示,该序列与卵形疟原虫SSU rRNA基因序列(GenBank登录号DQ845247)的对应部分同源性为100%,证实该病例为输入性卵形疟原虫感染病例。     

Application of real-time polymerase chain reaction (PCR) analysis for detection and discrimination of malaria parasite species in Thai patients

A TaqMan real-time PCR system was used to detect and discriminate the 4 species of human malaria parasites in clinical blood samples. A 150-base pair (bp) region of the small subunit ribosomal RNA (SSU rRNA) gene of each malaria parasite, including species-specific sequences to be detected by TaqMan probe, was used as a target for PCR analysis. The PCR method used universal primers and species-specific TaqMan probes for Plasmodium falciparum, P. vivax, P. ovale, and P. malariae. The detection threshold for the method, as determined with serial dilution of cultured P. falciparum-infected erythrocytes, was 5 parasite-infected erythrocytes per reaction. Fifty blood samples of falciparum malaria and a second set of 50 samples of vivax malaria, diagnosed by microscopic examination at the Hospital for Tropical Diseases, Mahidol University, Thailand, were analyzed by real-time PCR. In the 50 samples of microscopically-diagnosed falciparum malaria, 40 were regarded as P. falciparum single infection, 7 were P. falciparum and P. vivax mixed infections, and 3 were P. vivax single infection by real-time PCR. In the second set of 50 samples of microscopically diagnosed vivax malaria, all were considered P. vivax single infection by PCR. Neither P. ovale nor P. malariae infection was identified in the 100 blood samples. Real-time PCR analysis was shown to be more sensitive and accurate than routine diagnostic methods. Application and extension of the PCR method reported here will provide a powerful tool for further studies of malaria.     

A single-step,PCR-based method for the detection and differentiation of Plasmodium vivax and P. falciparum

The ability to detect and differentiate between Plasmodium falciparum and P. vivax is of great importance for the routine laboratory diagnosis of malaria, donor-blood screening and epidemiological studies. Most PCR-based methods for the discrimination of these two species require nested protocols or an additional hybridization reaction, leading to high labour costs and long turn-around times. A simple, time-effective and yet sensitive and specific technique, based on a multiplex PCR, has now been developed for the simultaneous detection and differentiation of P. falciparum and P. vivax in blood samples. Compared with the 'gold standard' of microscopy, this method had a sensitivity and specificity of 100%, with a detection limit of just one P. falciparum or three P. vivax parasites/microl blood.     

四川省输入性卵形疟原虫wallikeri亚种实验室检测分析

目的 鉴定四川省疑似输入性卵形疟原虫感染病例wallikeri亚种感染情况,并对2014-2017年全省1 079份复核血样卵形疟原虫wallikeri亚种感染情况进行分析。方法 对2018年1-4月四川省10例疑似输入性卵形疟原虫感染病例进行血涂片镜检、快速诊断试纸条（RDT）检测和巢式PCR检测并进行测序分析,同时回顾性检测2014-2017年全省 1 079份复核血样卵形疟原虫wallikeri亚种感染情况。结果 2018年1-4月四川省10例疑似输入性卵形疟原虫感染病例镜检结果均为卵形疟原虫阳性,其中2例存在恶性疟原虫混合感染;RDT检测结果均为疟原虫阳性;常规巢式PCR检测除2例结果为恶性疟原虫阳性外,其余均为阴性;采用卵形疟原虫wallikeri亚种特异性引物进行PCR检测,10例均为阳性,序列分析结果显示为卵形疟原虫wallikeri亚种。对2014-2017年全省1 079份复核血样进行回顾性检测,发现2例卵形疟原虫wallikeri亚种与恶性疟原虫混合感染病例,均为2017年报告,此前检测结果为单纯恶性疟原虫感染。结论 四川省首次鉴定发现输入性卵形疟原虫wallikeri亚种感染病例。     

2012年河南省疟疾标本的实验室检测分析

目的比较疟疾实验室检测方法,分析疟疾标本的检测结果。方法分别用吉氏染色镜检、巢氏PCR和序列分析方法对2012年河南省收集的165份疟疾标本进行检测,并对检测方法及结果进行分析比较。结果综合分析镜检、巢氏PCR和序列分析等3种方法的检测结果,165份疟疾标本的阳性率为93.94%,其中镜检和巢氏PCR阳性率分别为87.88%和90.30%;两种方法对疟原虫虫种的误判率为10.32%,其中对间日疟原虫、卵形疟原虫和三日疟原虫的误判率分别为42.86%、40.00%和28.57%,而对恶性疟原虫的误判率为0.85%。结论姬氏染色镜检和巢氏PCR两种方法在疟疾检测中各有优缺点,建议2种方法结合使用以提高疟疾诊断的准确率。     

Wide distribution of Plasmodium ovale in Myanmar

The presence of Plasmodium ovale has never been previously reported in Myanmar. Using blood samples obtained in many villages across the country between 1996 and 2000, molecular diagnosis of Plasmodium species was made with semi- or full-nested polymerase chain reaction (PCR) with species-specific primers, followed by agarose gel electrophoresis to detect amplification products. The presence of P. ovale was also confirmed with the another PCR-based diagnosis, the microtiterplate hybridization (MPH) method using species-specific probes. Both methods target the A type of the small subunit ribosomal RNA gene of the four human malaria parasites. Plasmodium ovale DNA was amplified in samples from 65 (4.9%) of 1323 PCR-positive patients, with perfect agreement between results obtained by nested PCR and MPH. Only four P. ovale-infected patients had single-species infection; all others were coinfected with P. falciparum, P. vivax and/or P. malariae. Quadruple infections were observed in six subjects. Parasites with typical P. ovale morphology were found in only 19 patients by conventional microscopy of Giemsa-stained thin smears or fluorescence microscopy of acridine orange-stained thin smears. Plasmodium ovale infections were found in villages situated in the southern, central and western regions of Myanmar, suggesting that P. ovale may be widely distributed in this country.