多种病毒集合检测芯片的研制及其在临床血清标本检测中的初步应用

目的 研制黄热病、西尼罗热、登革热、基孔肯雅热、埃博拉出血热、马尔堡出血热、拉沙热等多种病毒性传染病集合检测基因芯片,并建立一种适用于直接检测核酸含量较低临床血清标本的新型芯片靶基因扩增标记方法.方法 设计并筛选出上述病毒70mer寡核苷酸特异探针各20条,打印于同一基因芯片上；以phi29 DNA聚合酶结合带标签序列的随机引物进行临床标本中病毒全基因组扩增,再以Cy3荧光染料标记的标签序列引物进行PCR随机扩增标记,标记产物用多种病毒芯片进行杂交检测.结果 检测1～4型登革热、基孔肯雅热病例临床血清标本,结果显示该方法准确、特异、敏感；检测西尼罗热、黄热病、埃博拉出血热、马尔堡出血热、拉沙热等病毒核酸的模拟血清标本,同样得到特异的阳性杂交信号,与预期结果一致.结论 本研究建立的多种病毒集合检测基因芯片及其靶基因扩增标记方法,可直接应用于血清标本中上述病毒核酸的检测.     

埃博拉出血热及埃博拉病毒研究现状

目前西非地区正在流行的埃博拉出血热(EHF)由毒力最强的扎伊尔型(EBOV-Z)所致,为40年来最严重的暴发,殃及几内亚、利比里亚、塞拉利昂和尼日利亚西非四国。对于几内亚EBOV-Z毒株来源,目前存在有两种观点,即该病毒为几内亚地区长期潜伏或者由中非输入。非洲地区的水果蝙蝠为最可疑的远距离传播媒介。西非EHF疫情的诱发和扩散受生态环境因素和社会经济因素的影响。埃博拉病毒(EBOV)在近半个世纪频繁出现,可能由于进化过程中突破了基因遗传变异的瓶颈。本文介绍了目前西非EBOV流行情况、病毒来源、宿主和进化等方面的研究进展。     

2009－2012年广东口岸输入性流感疫情监测结果分析

目的对2009—2012年广东口岸输入性流感病例的流行病学特征进行分析,为出入境口岸流感的监测及其防控工作提供依据。方法采集广东25个口岸有发热症状的入境人员的鼻咽拭子,采用实时荧光RT-PCR法对样本进行流感病毒的检测及分型．通过Excel、SPSS18．0对不同型别的流感阳性病例的流行情况进行统计分析。结果2009—2012年广东口岸共发现5723名发热病例,其中985例为输入性流感病例,检出率为17．21％。共呈现5个流行高峰,分别为2009年6—8月,以季节性甲型流感为主;2009年10-12月,以甲型H1N1流感（2009）为主;2010年7-9月,以季节性甲型流感为主;2010年12月-2011年2月,以甲型H1N1流感（2009）为主;2011年12月-2012年2月,以季节性乙型流感为主。甲型H1N1流感（2009）在19岁以下人群检出率较高,季节性甲型流感以50岁以上人群检出率最高,季节性乙型流感则以19岁以下及50岁以上人群检出率较高。结论2009年5月至2012年2月期间,广东口岸入境流感病例中同时有甲型H1N1流感（2009）、季节性甲型流感以及季节性乙型流感的流行,并呈现相互交替的流行特征。不同流感类型在各年龄层分布不同．与性别无关。     

乙型脑炎病毒膜蛋白B区多肽抗原的表达、纯化及血清学评价

目的在原核表达系统中对乙型脑炎病毒包膜糖蛋白(E蛋白)的B区多肽抗原进行高效表达、纯化及血清学评价。方法利用PCR技术从乙脑减毒活疫苗中扩增编码B区的DNA片段,酶切消化后连接到表达载体pET22b上,用此连接产物转化大肠埃希菌BL21(DE3)并表达B区多肽抗原,表达产物经液相层析纯化;用乙脑病人血清对纯化后的B区多肽抗原进行评价。结果重组质粒pET22b-JEB经双酶切,其插入的外源基因片段为372 bp,与预期DNA片段大小一致。将纯化前与纯化后的蛋白作SDS-PAGE电泳,均可见一条约16kD的外源基因蛋白带,与计算的相对分子质量相符。经WB和ELISA血清学评价,表明重组B区多肽抗原具有较高的灵敏性及特异性。结论成功构建了表达载体pET22b-JEB,在原核系统中表达的B区多肽抗原具有良好的血清学检测价值。     

疟疾的实时荧光PCR快速检测方法

目的:建立疟疾的实时荧光PCR检测方法并用于疟疾的快速检测。方法:设计了疟原虫通用型实时荧光PCR检测的引物和探针,建立了疟疾的实时荧光PCR检测方法。对40份疟疾镜检阳性样本和20份镜检阴性样本进行实时荧光PCR检测,并和巢式PCR方法检测结果进行了比较。结果:疟疾实时荧光PCR检测速度快,20分钟即可完成。40份镜检阳性样本的荧光PCR检测均为阳性,2份样本的巢式PCR结果为阴性;20份镜检阴性样本中有3份样本为实时荧光PCR阳性,其余17份样本为实时荧光PCR阴性,与疟疾巢式PCR检测结果相同。结论:该实时荧光PCR方法检测速度快,特异性强,准确性高,阳性率高,不易漏检,适用于疟疾的快速检验,这对防止该病在国境口岸的传入提供了技术依据。     

广东省1990～2000年登革热流行病学分析

目的 明确广东省登革热流行因素。探讨预防控制对策。方法 调查分析1990-2000年登革热病例的分布特征和流行因素，测定登革Ⅰ型病毒地方分离株E/NS1基因片段核苷酸序列。结果 1990-2000年间，广东省共报告登革热病例9747例，死亡3例。年发病率在0/10万-9.75/10万之间，平均为1.27/10万。流行多呈爆发，疫情涉及13个市（占全省21个市的61.9%)。主要集中在广州，潮州，肇庆和佛山市，呈现高度集中而相对分散特点，敏月均有登革热病例报告，其中1-6月份为散发输入病例，7-12月份为流行期，男性：女性为1.04:1，所有年龄组均易感，四个型别的登革病毒均发生过流行，同一地区不同年份可流行不同型别病毒，同一年份不同地区也可流行不同型别病毒，广东省12株登革Ⅰ型病毒地方分离株E/NS1基因片段核苷酸序列，显示广东省登革Ⅰ型代表毒株可分为两个基因亚型。临床表现以典型登革热为主，广东省存在有利于登革热流行的自然因素和社会因素。结论 广东省登革热疫情同国外登革热流行程度相关联。流行呈输入性流行的特征，至今仍无证据表明已成为地方性疾病。     

广东省SARS流行株M基因序列分析

目的：测定广东省不同流行时期13份SARS病毒(SARS CoV)标本的M基因序列，通过分析该基因序列的变异情况，初步了解广东省SARS病毒在流行过程中是否发生了变异。方法：提取病毒RNA，用M基因特异引物进行RT-PCR，将产物纯化后直接测定核苷酸序列。结果：13份标本M基因核苷酸序列同源性很高，为99．7％～100％，M基因核苷酸序列只在2个位点(80和203位)发生变异，1株80位点的变化引起编码的氨基酸从苯丙氨酸(F)变为半胱氨酸(C)，3株203位变化为无义突变。结论：M基因核苷酸序列变异不大，初期和后期M基因核苷酸序列与流行高峰期的毒株相差1个碱基，但氨基酸序列相同；从香港感染病人分离的1株病毒M基因与广东本地感染分离株存在1个氨基酸的差异。     

广东省首例人高致病性禽流感病例病原体的分离与初步鉴定

人禽流感病是由甲型禽流感病毒（AIV）某些亚型的毒株感染人引起的急性呼吸道传染病。人高致病性禽流感病的潜伏期一般为1～3d，起病急，早期表现类似普通流感。主要症状为发热，伴有流涕、鼻塞、咳嗽、咽痛、头痛和全身不适。2006年2月22号，广州市一家医院发现1名患者出现“流感样”症状．表现为发热、咳嗽和白细胞数降低等发热肺炎症状，3月3日因治疗无效死亡。     

广东省信宜市蚊媒种类密度初步调查

目的 调查广东省信宜市怀乡镇和水口镇蚊媒数量及种类分布。方法 怀乡镇检查猪场、猪栏和牛房中蚊媒的分布；水口镇以牛诱和猪栏检查的方法调查蚊媒的分布。于19：00～21：30点观察蚊媒出现的情况，并以捕蚊管捕捉蚊媒。对所捕按蚊进行计数、分类。结果 共捕获蚊媒602只，其中包含5个种：骚扰阿蚊、三带喙库蚊、中华按蚊、多斑按蚊和嵌斑按蚊。三带喙库蚊为当地的优势蚊种，其占除阿蚊外总蚊量的90．8％。结论 三带喙库蚊为信宜市的优势蚊种。     

广东省传染性非典型肺炎病例的SARS冠状病毒分离株的分子生物学鉴定

目的 对广东省部分传染性非典型肺炎(SARS)病例的SARS冠状病毒分离株进行鉴定，并初步建立SARS冠状病毒PCR检测方法。方法 采集临床诊断为SARS病例的咽漱液标本，进行多种细胞分离培养，对出现病变的细胞分离物采用冠状病毒特异引物通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)及巢式聚合酶链反应(Nested—PCR)进行扩增，并对部分扩增片段进行序列测定，应用DNASTAR软件分析比较oN时采用间接免疫荧光(IFA)和ELISA法检测上述患血清中SARS冠状病毒Igc抗体。结果 对21例SARS患的细胞分离物进行PCR扩增，结果均阳性，其中12份患咽漱液标本PCR扩增结果也阳性，序列测定及基因分析表明，广东省SARS病例的病毒分离株为冠状病毒，其基因序列与WHO公布的SARS基因序列一致，氨基酸序列与目前已知的冠状病毒同源性为58％～76％。时对21例患进行血清学检测，其中IFA检测有9例阳性，ELISA检测有12例阳性。结论 从广东省部分SARS病例标本中分离的病毒株是一种新的冠状病毒，PCR检测具有早期、快速的优点。