慢病毒介导环状RNA mmu-circ-0001033过表达抑制低氧性小鼠肺动脉平滑肌细胞增殖的实验研究

目的探讨慢病毒介导环状RNA mmu-circ-0001033过表达对低氧性小鼠肺动脉平滑肌细胞增殖的影响,为环状RNA防治低氧性肺动脉高压(HPH)提供实验依据。方法体外原代培养小鼠肺动脉平滑肌细胞(PASMC),并随机分为4组:常氧组、低氧组、mmu-circ-0001033过表达慢病毒转染+低氧组、空白载体慢病毒转染+低氧组。体外构建环状RNA mmu-circ-0001033过表达慢病毒载体,转染PASMC。运用qRT-PCR技术检测各组PASMC中mmu-circ-0001033的表达水平,采用CCK-8法检测各组PASMC增殖,对各组的指标值进行统计学比较和分析。结果低氧处理导致PASMC中mmu-circ-0001033的表达明显下调,且呈时间依赖性;与对照组比较,慢病毒转染组中mmu-circ-0001033表达显著上调(P0.05),提示mmu-circ-0001033过表达慢病毒成功转染入PASMC,且并高效表达;与常氧组比较,低氧组和空白载体慢病毒转染+低氧组PASMC增殖明显增多(P0.05),而mmu-circ-0001033过表达抑制了低氧对PASMC的促增殖作用。结论过表达的mmu-circ-0001033显著抑制低氧所诱导的PASMC的增殖,为明确mmu-circ-0001033作为HPH防治靶标奠定了实验基础。     

Siah2负调控脯氨酰羟化酶3表达在大鼠低氧性肺动脉高压中的意义

目的探讨Siah2及低氧诱导因子(HIF)脯氨酰羟化酶(PHD)3的表达变化趋势在大鼠低氧性肺动脉高压(HPH)中的作用和意义。方法 40只成年雄性SD大鼠随机划分常氧正常组和低氧3 d、7 d、14 d和21 d组,每组8只,常压低氧制作HPH大鼠模型。RT-PCR检测Siah2和PHD3 mRNA表达变化,Western印迹检测上述两指标的蛋白质表达,并分析其表达变化与大鼠HPH的关系。结果常氧正常组Siah2 mRNA表达水平较低,低氧7 d后显著增高(P0.05),低氧14 d达高峰;常氧正常组及低氧3 d组Siah2蛋白表达亦较低,低氧7 d后显著增高(P0.05),低氧14 d达高峰。常氧正常组PHD3 mRNA和蛋白质表达均不明显,低氧3 d mRNA明显增高(P0.05),同时随低氧时间延长其mRNA表达逐渐升高并保持在高水平;PHD3蛋白质低氧3 d明显增高(P0.05),低氧7 d保持高水平,低氧14 d和21 d下降。相关分析表明,肺小动脉壁Siah2蛋白质表达水平与Siah2 mRNA呈正相关(r=0.87,P0.01),与PHD3蛋白表达水平呈负相关(r=-0.44,P0.05)。结论 Siah2与PHD3均在大鼠HPH的发病机制中发挥作用。Siah2可能从蛋白水平下调PHD3的表达水平,导致HPH的发生发展。     

硫化氢对低氧性肺动脉高压大鼠P47phox表达的影响

目的观察硫化氢H2S对低氧性肺动脉高压(HPH)大鼠P47phox表达的影响。方法 36只体重(180±20)g健康成年雄性SD大鼠,随机分为常氧组、低氧组、低氧+硫氢化钠(Na HS)组,每组12只。低氧16 d后分别检测其平均肺动脉压(m PAP)、右心室肥厚情况和肺血管形态学指标的变化。采用Western印迹检测肺动脉组织P47phox的表达水平。结果与常氧组比较,低氧组m PAP明显升高,右室/(左室+室间隔)比值显著增加(P<0.01);部分肌型动脉百分比明显升高,非肌型动脉百分比明显降低(P<0.05);肺动脉组织P47phox表达升高(P<0.05)。与低氧组比较,低氧+Na HS组m PAP、右室/(左室+室间隔)比值均明显降低(P<0.01);肺小血管中肌型动脉、部分肌型动脉百分比明显降低,非肌型动脉百分比明显升高(P<0.05);肺动脉组织P47phox表达明显降低(P<0.01)。结论 H2S可能通过抑制大鼠肺动脉组织P47phox表达而调节低氧性肺血管结构重建和HPH的形成。     

一氧化碳对大鼠血管平滑肌细胞低氧性增殖反应的作用

目的 :观察低氧时大鼠肺动脉平滑肌细胞 (PASMC)受血管舒张因子一氧化碳的作用。方法 :随机分为常氧组、低氧组 ( 1%O2 5 %CO2 94%N2 )、一氧化碳组 ( 3%CO 5 %CO2 92 %N2 ) ,采用流式细胞仪、增殖细胞核抗原 (PCNA)、[3H]-胸腺嘧啶 ( [3 H]-TdR)摄取量 ,检测PASMC增生的情况。结果 :( 1)流式细胞仪检测低氧组PASMCG2 M期细胞比例明显增多(P <0 .0 1) ,G0 /G1 期细胞比例明显减少 (P <0 .0 1) ,CO组与常氧组的PASMC各期细胞数差异不显著 (P >0 .0 5 )。 ( 2 )PCNA免疫组化染色 ,低氧组PASMC细胞核阳性反应颗粒明显增加 ,而CO组为弱阳性。 ( 3) [3 H]-TdR的摄取量 ,低氧组可明显促进PASMC摄取 [3H]-TdR (P <0 .0 5 ) ,CO组与常氧组比没有明显差异 (P >0 .0 5 )。结论 :低氧可以促进PASMC的增殖 ,而CO可以部分抑制低氧对PASMC的作用     

整合素连接激酶在低氧诱导肺动脉高压发病机制中的作用

目的:通过了解整合素连接激酶(ILK)及心肌素(myocardin)在低氧性肺动脉高压(PAH)大鼠肺组织及肺血管中的表达,探讨ILK在低氧性肺动脉高压发病机制中的作用。方法:48只SD大鼠按随机数字表法分为常氧对照组和低氧1周、2周、4周组,低氧干预大鼠置于低氧仓内,氧浓度控制在(10.5±0.5)%,每日间断低氧8h(8:00~16:00)。测定各组大鼠肺动脉平均压(mPAP)、计算右室肥厚指数[右室/(左室+室间隔),RV/(LV+S)]、管壁厚度占血管外径的百分比(WT%)和管壁面积占血管总面积的百分比(WA%);采用髓鞘碱性蛋白为底物通过液体闪烁仪测定ILK活性;实时定量PCR法测定肺动脉内ILK、糖原合成激酶3β(GSK-3β)及myocardin mRNA相对表达量;Western印迹法检测肺动脉及培养的肺动脉平滑肌细胞(PASMC)胞质内ILK、GSK-3β及myocardin蛋白相对表达量。结果:低氧2周组mPAP、右室肥厚指数、WT%、WA%均显著高于常氧对照组(均P0.05),低氧4周组差异更为显著。低氧1周组肺动脉内ILK活性即明显下降达36%(P0.05),低氧2周、4周组ILK活性均较常氧对照组明显降低(均P0.05)。低氧4周组ILK mRNA和蛋白相对表达量均显著低于常氧对照组(均P0.05),myocardin mRNA和蛋白表达变化与ILK相似(均P0.05),而GSK-3β的mRNA和蛋白表达量则呈相反趋势,显著高于常氧对照组(均P0.05)。低氧培养PASMC 24h后ILK及myocardin蛋白表达明显低于常氧对照组,而GSK-3β蛋白水平则呈相反趋势,低氧可促进其表达增加(均P0.05)。结论:慢性低氧引起ILK活性和表达下调,使其下游靶点GSK-3β表达上调,进而降低myocardin表达水平,可能是导致PAH形成的重要机制。     

17β-雌二醇和2-甲氧基雌二醇对慢性低氧性肺动脉高压大鼠体内内皮素-1/一氧化氮体系的影响

目的:探讨17β-雌二醇(E2)及2-甲氧基雌二醇(2ME)对慢性低氧性肺动脉高压大鼠体内内皮素-1(ET-1)/一氧化氮(NO)体系的影响。方法:雌性SD大鼠48只,按随机数字表法平均分为6组(各组n=8):假手术组、去势组、低氧组、去势+低氧组、去势+低氧+E2组、去势+低氧+2ME组。去势组行卵巢切除术;非去势组打开腹腔找到卵巢后不做处理直接还纳缝合。术后去势+低氧+E2组皮下注射E2[20μg/(kg·d)],去势+低氧+2ME组皮下注射2ME[240μg/(kg·d)],其他组皮下注射生理盐水(0.1 ml/d)。低氧组大鼠置于低氧箱内饲养,非低氧组大鼠呼吸正常空气。连续饲养8周以建立低氧性肺动脉高压模型。分别测定血清ET-1、NO水平、内皮型一氧化氮合酶(eNOS)活性及肺组织内皮素A受体(ET_AR)、内皮素B受体(ET_BR)、eNOS表达变化。结果:低氧组、去势+低氧组大鼠肺小动脉管壁增厚,管腔变窄明显,平均肺动脉压(mPAP)显著高于假手术组(P均0.01);E2和2ME干预组大鼠上述形态学及mPAP改变相对较轻。与假手术组相比,去势组和低氧组血清ET-1和肺组织ET_AR mRNA及蛋白水平均明显升高,ET_BR mRNA及蛋白水平明显下降(P均0.01);去势+低氧组以上指标变化更显著;E2和2ME干预后血清ET-1和肺组织ET_AR表达明显下降,但仍高于假手术组,同时ET_BR表达明显上升,但仍低于假手术组(P均0.01);且去势+低氧+2ME组血清ET-1水平低于去势+低氧+E2组(P0.05)。与假手术组相比,去势组肺组织eNOS蛋白水平明显下降(P0.01);低氧组血清NO水平及肺组织eNOS蛋白水平明显下降(P0.05或P0.01);去势+低氧组血清NO水平、eNOS活性及肺组织eNOS mRNA和蛋白水平均明显下降(P均0.01);去势+低氧+E2组和去势+低氧+2ME组上述指标较去势+低氧组均明显上升(P0.05或P0.01),但仍低于假手术组(P均0.05)。结论:E2及2ME均能显著降低血清ET-1水平,减少肺组织ET_AR表达,增加ET_BR的表达,升高血清NO水平、eNOS活性及肺组织eNOS表达,通过改善ET-1/NO体系平衡部分逆转肺动脉高压。     

门冬氨酸钾镁对低氧性肺动脉高压大鼠的抗氧化作用

目的 探讨门冬氨酸钾镁对低氧性肺动脉高压( HPH)大鼠的抗氧化作用及肺动脉结构重建的影响.方法 采用动物试验,雄性Wistar大鼠,随机分为3组:正常对照组、低氧组、低氧+门冬氨酸钾镁治疗组.低氧30 d测定肺动脉平均压(mPAP)、颈动脉平均压(mCAP),右心室肥大指数(RVHI),测定肺组织中超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)含量,计数肺腺泡内肺小动脉肌型动脉(MA)、部分肌型动脉(PMA)、无肌型动脉的数目(NMA),计算各占肺小动脉总数的百分比及肺小肌型动脉相对中膜厚度(RMT)、相对中膜面积(RMA)百分比.结果 低氧组mPAP、RVHI、MDA含量较对照组高(P＜0.05或P＜0.01),而肺组织SOD活性低于对照组(P＜0.05);治疗组肺组织MDA含量较低氧组降低(P＜0.05),而SOD活性较低氧组高(P＜0.05).低氧组泡内肺小动脉肌化程度、RMT(％)、RMA(％)较对照组高(P＜0.01),治疗组较低氧组低(P＜0.01).结论 HPH大鼠体内出现过氧化损伤及抗氧化能力下降,门冬氨酸钾镁干预后可以改善体内的氧化-抗氧化失衡现象,可部分逆转肺血管结构重建,降低肺动脉高压.     

奇诺宁对低氧性肺动脉高压的治疗作用

目的 探讨奇诺宁注射液对低氧性肺动脉高压(HPH)大鼠肺血管结构重建及肺血管形态学的影响.方法 将36只健康雄性Wistar大鼠随机分为3组,每组12只.①对照组:室内空气正常饲养;②低氧组:在常压低氧舱内(氧浓度10.0％±0.5％),每日8h,连续30 d;③治疗组:低氧条件同低氧组,自低氧第1天起每天给大鼠腹腔内注射1 ml/kg奇诺宁注射液.对照组与低氧组每天腹腔内注射生理盐水量和治疗组相同.于低氧30 d后分别用右心导管法测定肺动脉平均压(mPAP)、颈动脉平均压(mCAP),计算右心室肥大指数(RVHI),光镜下观察肺小动脉肌化程度,肺中、小肌型动脉相对中膜厚度(RMT)、相对中膜面积(RMA)的变化及肺血管形态学改变.结果 ①低氧组mPAP、RVHI较对照组明显升高(P＜0.01),治疗组较低氧组明显下降(P＜0.01).②低氧组肺组织中NO含量较对照组降低(P＜0.01),治疗组较低氧组升高(P＜0.01).③低氧组肺中、小肌型动脉肌化程度、RMT、RMA较对照组明显增多(P＜0.05或P＜0.01),治疗组较低氧组肺中、小肌型动脉肌化程度、RMT、RMA减小,差异有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01).④mCAP三组之间比较差异无统计学意义.⑤Weigert弹力纤维染色切片显示,对照组大鼠肺小动脉内外弹力层完整,内外弹力层之间的厚度正常;低氧组大鼠肺小动脉内弹力纤维膜增厚,内外弹力层之间的距离明显增宽;治疗组大鼠肺小动脉内弹力纤维膜明显好转,内弹力层与外弹力层之间的距离增宽程度较低氧组减轻.结论 慢性低氧可引起大鼠肺小动脉内皮损伤、结构重建,导致肺动脉压上升,奇诺宁注射液可部分逆转肺血管结构重建,对HPH有良好治疗作用.     

低氧条件下共培养体系中肺动脉内皮细胞经Notch1/Jagged1信号通路调控肺动脉平滑肌细胞的增殖

目的探讨低氧条件下细胞共培养体系中肺动脉内皮细胞经由Notch1/Jagged1信号通路调控肺动脉平滑肌细胞的增殖。方法建立Transwell共培养体系,将肺动脉内皮细胞(PAEC)和平滑肌细胞(PASMC)分别接种于下室和上室,PAEC经DAPT(Notch信号阻断剂)或(和)S iR-NA-Jagged1预处理后,与PASMC共同置入自动常压缺氧孵箱进行低氧处理。根据PAEC是否行DAPT、Jagged1小RNA干扰预处理进行实验分组:常氧时PAEC与PASMC共培养对照组(N)、低氧时PAEC与PASMC共培养组(H1)、低氧时DAPT(终浓度10μmol/L)预处理PAEC与PASMC共培养组(H2)、低氧时S iRNA-Jagged1预处理PAEC与PASMC共培养组(H3)、低氧时DAPT加S iRNA-Jagged1预处理PAEC与PASMC共培养组(H4)。用3H-TdR掺入法检测PAEC和PASMC增殖情况,RT-PCR检测PAEC中Notch1、Jagged1 mRNA表达水平。结果低氧时各组PAEC和PASMC的3H-TdR掺入量明显高于常氧共培养对照组(均P<0.01);与H1组比较,...     

低氧大鼠肺内硝基酪氨酸的变化研究

目的 观察在低氧大鼠肺组织中氧化产物硝基酪氨酸(nitrotryrosine,NT)表达的变化,探讨氧化应激机制在低氧性肺动脉高压形成中的作用.方法 将14只雄性Wistar大鼠随机分为对照组、低氧组.以常压低氧3周制备肺动脉高压模型,测量各组大鼠平均肺动脉压(mean pulmonary arterial pressure,mPAP)和右心肥厚指数(right ventricle hypertrophy index,RVHI);图像技术测定管壁厚度占血管外径的百分比(wall thickness %,WT %)和管壁面积占总面积的百分比(wall area%,WA%);采用免疫组织化学法观察两组大鼠肺小动脉管壁NT的表达.结果 ①低氧组大鼠mPAP(22.84±1.79)mm Hg和RVHI(29.78±1.07)%与对照组mPAP(16.67±0.97)mm Hg和RVHI(24.22±0.48)%相比,差异有统计学意义(P均＜0.01).②低氧组WT%(24.96±3.70)%和WA%(73.31 ±6.51)%与对照组WT%(14.19±2.61)%和WA%(46.67±7.42)%相比,差异有统计学意义(P均＜0.01).③低氧组大鼠近端肺小动脉管壁的NT染色强度(1.52±0.07)与对照组(1.00±0.00)相比,差异有统计学意义(P＜0.01).两组大鼠远端肺小动脉管壁NT染色强度无明显变化(P＞0.05).低氧组大鼠近端肺小动脉管壁NT表达强度与mPAP值呈正相关(r=0.867,P＜0.05).结论 低氧可诱导大鼠mPAP增高及肺组织内NT产生增加,其作用机制可能与低氧诱导氧化应激有关.     

黄芪对低氧性肺动脉高压大鼠肺血管结构重建干预作用及机制的研究

目的 探讨黄芪注射液对低氧性肺动脉高压(HPH)大鼠肺腺泡内肺动脉结构重建及肺组织内皮素-1(ET-1)、一氧化氮(NO)的影响。方法雄性Wistar大鼠21只,每组7只,随机分为3组,正常对照组、低氧组、低氧+黄芪治疗组。低氧30d,分别用右心导管法测定肺动脉平均压(mPAP)、颈动脉平均压(mCAP),右心室肥大指数(RVHI),分光光度法测定肺组织中NO含量和放射免疫法测定肺组织中ET-1含量,计算MA、PMA、NMA比例及肺中、小肌型动脉相对中膜厚度(RMT)与相对中膜面积(RMA)。结果①低氧组mPAP、RVHI、ET-1含量较对照组明显升高(P<0.01或P0.05)。结论慢性低氧可引起大鼠肺血管结构重建,导致mPAP上升、肺组织ET-1升高、NO下降,黄芪注射液可调节肺组织ET-1、NO含量,可部分逆转肺血管结构重建,降低肺动脉高压,对HPH有一定防治作用。     

H_2S对低氧性肺动脉高压大鼠肺组织BaxmRNA、Bcl-2mRNA表达的影响

目的研究H2S对大鼠低氧性肺动脉高压及凋亡相关基因BaxmRNA、Bcl-2mRNA表达的影响,探讨其在低氧性肺动脉高压发病中的作用。方法将30只雄性Wistar大鼠随机分为三组:常氧对照组、低氧组及低氧+Na HS组(腹腔注射Na HS并进行低氧处理)。常压间歇低氧法建立大鼠低氧性肺动脉高压模型,右心导管法检测平均肺动脉压(m PAP);分别称量大鼠右心室(RV)和左心室加室间隔(LV+S)的质量,计算出右心室肥厚指数RV/(LV+S);HE及弹力纤维+VG染色光镜下观察肺血管形态及肺小动脉平滑肌结构,弹力纤维、肌纤维及胶原纤维增生情况;RT-PCR方法检测BaxmRNA、Bcl-2mRNA在肺组织中的表达。结果 1低氧各组较对照组体重明显减轻(P0.05),但低氧+Na HS组明显高于低氧组(P0.05),造模前各组大鼠体重无差别(P0.05)。2低氧各组较对照组m PAP明显升高(P0.05)、RV/(LV+S)明显增加(P0.05)。低氧+Na HS组较低氧组m PAP明显降低(P0.05),RV/(LV+S)明显减少(P0.05)。3光镜下观察,对照组肺动脉管壁较薄,薄厚均匀,管腔较大。内弹力膜呈平缓波浪状,管壁层次结构清晰;低氧组肺小动脉平滑肌增生,胶原纤维增多,管壁增厚,管腔狭窄。内弹力膜增厚,外膜胶原纤维增生、沉积,外弹力膜也增厚,内外弹力板间距离均增宽;中膜平滑肌细胞也增生明显,管壁增厚,管腔明显变小,管周水肿。低氧+Na HS组较低氧组上述表现有所缓减。4低氧各组较对照组肺组织BaxmRNA表达均显著降低,Bcl-2 mRNA表达均显著增加(P0.05)。低氧+Na HS组较低氧组肺组织BaxmRNA表达显著升高,Bcl-2mRNA表达明显降低(P0.05),低氧+Na HS组较对照组大鼠肺组织BaxmRNA、Bcl-2 mRNA表达无统计学差异(P0.05).结论 H2S可以调节低氧性肺动脉高压细胞大鼠肺组织凋亡相关基因BaxmRNA、Bcl-2mRNA的表达,缓解低氧性肺血管重建,对低氧性肺动脉高压的发病起到保护作用。     

KLF4在低氧诱导肺动脉平滑肌细胞增殖及表型转化中的作用初步研究

目的：本实验通过观察低氧诱导大鼠原代肺动脉平滑肌细胞(pulmonary artery smooth muscle cell,PASMC)增殖与分化标志改变过程中,krǖppel 样因子4(krǖppel-like factor 4, KLF4)表达的变化,并检测 KLF4过表达对该过程的影响,探讨 KLF4是否在其中担当一定作用。方法采用贴片法培养原代 PASMC,低氧(5%O 2)培养24 h、48 h、72 h 后,以正常氧浓度培养细胞为对照,采用实时荧光聚合酶链反应(real-time PCR)、Western blot 及免疫共沉淀方法,观察低氧24 h、48 h、72 h,PASMC 中 KLF4乙酰化水平及表达水平的变化。cck-8检测细胞增殖情况,碘化丙啶(PI)染色检测细胞周期,提取细胞总 RNA 和蛋白,采用 real-time PCR、Western blot 方法检测细胞中增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)的表达水平,综合分析低氧对细胞增殖的影响,同时采用 real-time PCR、 Western blot 方法检测 PASMC 分化标志物平滑肌肌动蛋白α(smooth muscleα-action,SMα-actin)的表达水平。通过转染 KLF4表达质粒,提高 PASMC 中 KLF4的表达水平,检测细胞周期、增殖活力及 PCNA、SM α-actin 的变化,观察低氧下 KLF4过表达对PASMC 增殖、分化的影响。结果低氧24 h,PASMC 中 KLF4表达水平均较常氧培养细胞明显增高,期间 SMα-actin 表达较常氧培养细胞明显减少,PASMC 增殖不明显。随后 KLF4表达水平逐渐降低,至72 h 降低至正常水平,而 SMα-actin 逐渐增高,同时 PASMC 增殖活力明显增强,S 期细胞逐渐增多。KLF4过表达后,低氧刺激 PASMC 增殖活力明显降低,SMα-actin 表达水平也降低,细胞阻滞于 G1期。结论低氧诱导 PASMC 发生去分化与增殖不同步;KLF4参与调节低氧诱导的PASMC 表型转化与增殖过程,该作用涉及 KLF4乙酰化水平改变。     

低氧性肺动脉高压小鼠肺的环状RNA表达谱研究

目的采用环状RNA(circRNA)芯片筛选低氧性肺动脉高压(HPH)小鼠肺组织中差异表达的circRNA,分析circRNA表达谱特征,为HPH发生机制提供研究方法。方法 20只健康雄性C57BL/6小鼠(体质量17~20 g)按数字表法随机分为HPH模型组与常氧组,每组10只。HPH模型组小鼠置于自制常压低氧舱内,舱内氧浓度(10±0.5)%O2。每天连续低氧处理8 h,连续21 d。常氧组小鼠置于常氧环境饲养。通过测定右心室收缩压和右心肥大指数验证HPH小鼠模型复制成功后,处死小鼠,取肺组织,用circRNA芯片检测各组肺组织circRNA表达谱,并进行组间比较与分析,以明确差异表达的circRNAs。结果与常氧组比较,HPH模型组肺组织中表达显著上调的circRNAs共有23个(P<0.01,P<0.05);表达显著下调的circRNAs共有41个(P<0.01,P<0.05)。结论 circRNA芯片可用于筛选HPH差异表达的circRNA,circRNA可能参与HPH调控机制。     

低氧致大鼠肺动脉平滑肌细胞中PTEN/Akt1表达的变化与细胞增殖的关系

目的 通过观察低氧致大鼠肺动脉平滑肌细胞(PASMC)与细胞张力蛋白同源在10号染色体有缺失的磷酸酶(PTEN)和丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1(Akt1)mRNA及其蛋白表达水平的变化与低氧PASMC增殖的关系,探讨PTEN/Akt1信号途径在低氧肺血管重建中的可能调控作用.方法 用组织块法培养PASMC.采用半定量逆转录-PCR技术检测常氧组、低氧2、8、12、24 h组PTEN、Akt1基因mRNA的表达水平,采用Western blot技术检测相应的蛋白表达水平.采用噻唑蓝比色法和氚-胸腺嘧啶脱氧核苷(3H-TdR)掺入法检测PASMC的增殖改变.数据用x±s表示,采用Excel 2003软件进行t检验,P<0.05为差异有统计学意义.结果低氧刺激PASMC不断增殖,3H-TdR法检测的吸光度值低氧12 h组(0.70±0.10)比常氧组(0.37±0.06)明显增高(t=14.29,P<0.01);噻唑蓝法检测的吸光度值低氧24 h组(11 208±679)比常氧组(8374±545)明显增高(t=19.56,P<0.01).各组均检测出PTEN、Akt1基因mRNA及蛋白表达的变化.常氧组Akt1的mRNA、总蛋白、磷酸化蛋白的吸光度值分别为0.76±0.09、25±6和48±8,随着低氧培养时间延长,吸光度值逐渐升高,低氧8 h组达到高峰,分别为1.05±0.09、41±7和79±14,与常氧组比较,差异均有统计学意义(t值为8.31～168.00,P<0.05和P<0.01),随后开始下降,低氧24 h组恢复至常氧组水平.常氧组PTEN的mRNA、磷酸化蛋白的吸光度值分别为0.25±0.06和98±8,并随着低氧培养时间延长而逐渐升高,低氧24 h组达到高峰,分别为0.38±0.05和232±12,与常氧组比较,差异均有统计学意义(t值分别为22.04和50.46,均P<0.01).结论 PTEN/Akt1的转录和激活与低氧肺血管重建的PASMC增殖密切相关.     

慢性低氧所致肺动脉高压对大鼠肺动脉内蛋白激酶Cα的膜转位和蛋白表达量的影响

目的 通过观察慢性低氧所致肺动脉高压对大鼠肺动脉内蛋白激酶Cα(PKCα)的膜转位和蛋白表达量的影响,初步探讨PKCα在慢性低氧诱导大鼠肺动脉高压的发生和发展过程中所起的作用.方法 采用慢性常压低氧[氧浓度(10±0.1)％]大鼠肺动脉高压模型,将雄性SD大鼠随机分为正常对照组、低氧1d、3d、7d、14 d和21d组,检测大鼠右心室收缩压(RVSP)和右心室肥厚指数(RVHI),肺组织苏木精-伊红(HE)染色,应用蛋白免疫印迹和免疫组织化学的方法检测PKCα膜转位和蛋白表达水平的变化.结果 ①低氧1d、3d、7d、14 d和21d组与正常对照组相比,RVSP和RV/(LV+S)比值均明显增加(P＜0.05),低氧暴露3d、7d、14 d和21 d后大鼠肺动脉壁明显增厚;②PKCα的蛋白表达量在慢性低氧1d、3d、7d和14 d后比正常对照组明显下降(P＜0.05).结论 PKCα蛋白表达量的下调可能参与了慢性低氧诱导的大鼠肺动脉高压的发生和发展过程.     

促发低氧性肺动脉高压的新机制——肺微动脉的血管胰岛素敏感性降低及其信号障碍

目的:观察低氧诱导大鼠肺微血管内皮细胞（PMVEC）,是否同样存在肺血管的胰岛素敏感性变化？并探讨潜在的分子机制。方法:采用低压低氧法建立低氧性肺动脉高压（HPH）大鼠模型,14只雄性SD大鼠随机分为:正常对照组和HPH组（低氧4周）,每组7只大鼠（n=7）测定两组平均肺动脉压（mPAP）及胰岛素诱导的血管舒张效应。原代培养大鼠PMVEC,分为常氧（21%O2,37℃）和低氧（10%O2,37℃）处理,分别培养6 h、24 h、48 h和96 h收集细胞以Western blot检测Tribbles同源蛋白3（TRB3）、过氧化物酶体增殖物激活受体（PPARγ）及胰岛素的磷脂肌醇3激酶/蛋白激酶B/内皮一氧化氮合酶（PI3K/Akt/eNOS）信号通路蛋白水平,培养基上清检测一氧化氮（NO）生成量。结果:与正常对照组比较,低氧组mPAP明显升高,胰岛素诱导的肺动脉血管舒张作用明显减弱（P<0.05,P<0.01）。PMVEC在含胰岛素的内皮培养基培养不同时间,低氧组与常氧组相比,培养6 h NO量明显升高,培养24 h后有所下降,随低氧时间的延长下降幅度增大（P<0.01）;随低氧时间延长,PI3K-p85、p-Akt、p-eNOS表达逐渐下降,低氧时间越长下降幅度越明显,与NO生成相一致,p-ERK1/2随低氧时间延长表达明显升高;随低氧时间延长TRB3表达增加显著,而PPARγ表达减少（P<0.05,P<0.01）。而不同培养时间常氧组间NO量及上述蛋白表达无显著性差异。结论:低氧可诱导大鼠PMVEC内TRB3的过表达从而负性调控PPARγ,引起下游胰岛素信号通路受损,造成肺血管内皮功能异常,进而促进HPH发生。     

肺动脉胰岛素敏感性减弱在低氧性肺动脉高压发生中的作用

目的:观察低氧性肺动脉高压(HPH)时,肺动脉胰岛素敏感性的变化以及应用吡格列酮(PIO)不同时期处理对HPH的影响。探讨肺血管脉胰岛素抵抗(IR)在HPH发病中的作用及其机制。方法:将28只雄性SD大鼠随机分为正常对照组、HPH组、HPH 1周+PIO组及HPH 3周+PIO组,每组7只。后3组大鼠以低压低氧法建立HPH模型,每天低氧8 h,共4周。HPH 1周+PIO组和HPH 3周+PIO组的大鼠分别于低氧1周后及低氧3周后,开始每日低氧前给予PIO(10 mg/kg)灌胃,共1周。低氧结束后,用血糖仪检测空腹血糖(FBG)、ELISA方法检测空腹血清胰岛素(FSI),计算胰岛素抵抗指数(IRI),右心导管法测定平均肺动脉压(mPAP)、平均右心室压(mRVP),右心指数(RVI)。经HE染色后观察肺小动脉显微结构的改变。各组动物再取左、右肺外肺动脉干,采用离体血管灌流实验,观察胰岛素对苯肾上腺素(PE)预收缩后各组大鼠肺动脉舒张功能的影响。结果:与对照组相比,HPH组大鼠的FBG、FSI、IRI、mPAP、mRVP及RVI均显著增高(P<0.05);肺动脉平滑肌及弹力纤维层增生,管壁增厚,管腔狭窄;胰岛素诱导的肺动脉舒张功能显著减弱(P<0.05)。与HPH组相比,HPH 1周+PIO组大鼠的FBG、FSI、IRI、mPAP、mRVP及RVI均显著降低(P<0.05),管壁增厚、管腔狭窄的程度明显改善,肺动脉对胰岛素诱导的舒张功能显著提高(P<0.05);而HPH 3周+PIO组上述指标及特征均无显著性差异。结论:HPH早期即伴有肺动脉胰岛素敏感性减弱,如早期给予PIO治疗,可有效地改善肺血管的舒张功能和肺血管重建、显著降低肺动脉压力,而后期治疗则对肺血管功能及肺动脉压无影响,提示肺动脉胰岛素抵抗在HPH发生中的重要作用及早期干预的必要性。     

促发低氧性肺动脉高压的新机制--肺微动脉的血管胰岛素敏感性降低及其信号障碍

目的观察低氧诱导大鼠肺微血管内皮细胞（PMVEC）,是否同样存在肺血管的胰岛素敏感性变化？并探讨潜在的分子机制。方法：采用低压低氧法建立低氧性肺动脉高压（HPH）大鼠模型,14只雄性SD大鼠随机分为：正常对照组和HPH组（低氧4周）,每组7只大鼠（n=7）测定两组平均肺动脉压（mPAP）及胰岛素诱导的血管舒张效应。原代培养大鼠PMVEC,分为常氧（21％O2,37℃）和低氧（10％O2,37℃）处理,分别培养6 h、24 h、48 h和96 h收集细胞以Western blot检测Tribbles同源蛋白3（TRB3）、过氧化物酶体增殖物激活受体（PPAR^y）及胰岛素的磷脂肌醇3激酶／蛋白激酶B／内皮一氧化氮合酶（P13K／Akt／eNOS）信号通路蛋白水平,培养基上清检测一氧化氮（NO）生成量。结果：与正常对照组比较,低氧组mPAP明显升高,胰岛素诱导的肺动脉血管舒张作用明显减弱（P〈0．05,P〈0．01）。PMVEC在含胰岛素的内皮培养基培养不同时间,低氧组与常氧组相比,培养6 h NO量明显升高,培养24 h后有所下降,随低氧时间的延长下降幅度增大（P〈0．01）;随低氧时间延长,P13K-p85、p-Akt、p-eNOS表达逐渐下降,低氧时间越长下降幅度越明显,与NO生成相一致,p-ERKl／2随低氧时间延长表达明显升高;随低氧时间延长TRB3表达增加显著,而PPARY表达减少（P〈0．05,P〈0．01）。而不同培养时间常氧组间NO量及上述蛋白表达无显著性差异。结论：低氧可诱导大鼠PMVEC内TRB3的过表达从而负性调控PPARl,引起下游胰岛素信号通路受损,造成肺血管内皮功能异常,进而促进HPH发生。     

野生型蛋白激酶GIα腺病毒抑制低氧肺动脉平滑肌细胞表型转换及细胞增殖

目的 观察携带野生型蛋白激酶GIα腺病毒(Ad-PKGIα)抑制低氧诱导人肺动脉平滑肌细胞(PASMC)表型转换及其增殖的影响,探讨其在低氧肺血管重建(HPVR)中的作用.方法 组织块法建立人PASMC细胞系.Ad-PKGIα转染PASMC;采用荧光显微镜观察转染效率;RT-PCR、Western blot检测PASMC中PKGIα mRNA表达、Ad-PKGIα转染对低氧PASMC表型转换中平滑肌α肌动蛋白(SM-α-actin)表达的影响.流式细胞仪检测Ad-PKGIα转染后低氧对PASMC细胞周期的影响;~3H-TdR掺入法检测PASMC增殖.结果 (1)Ad-PKGIα转染后PASMC中PKGIα mRNA水平、磷酸化PKGIα蛋白水平显著增高.(2)常氧时PASMC中SM-α-actin蛋白表达为44.25±5.34;3% O_2处理12 h PASMC中SM-α-actin蛋白表达水平降至32.18±4.19,处理24 h SM-α-actin蛋白表达水平降至21.90±2.44.(3)低氧条件下,PASMC开始增殖,随着低氧时间延长,PASMC增殖逐渐增加,至24 h PASMC增殖最多[(14 924±1491)次/min].与未转染对照组、腺病毒空载体组比较,Ad-PKGIα转染组PASMC增殖明显受到抑制.(4)低氧使未转染对照组和腺病毒空载体组的PASMC进入有丝分裂期,随着低氧时间延长,G_0/G_1期细胞比例逐渐减少,S+G_2/M期细胞比例逐渐增加.Ad-PKGIα转染后常氧状态下PASMC G_0/G_1期细胞比例下降、S+G_2/M期细胞比例上升趋势均明显减缓.结论 PKGIα基因在低氧肺血管重建信号转导途径中有重要的调节作用,可作为基因治疗的靶点之一.