AKAP1调控线粒体稳态及其在心血管疾病中的研究进展

线粒体是细胞的能量工厂，同时也是细胞内信号传导的枢纽，可调节细胞增殖、分化和存活。A型激酶锚定蛋白（A-kinase anchoring protein，AKAP）1是一种支架蛋白，因其可与蛋白激酶（protein kinase，PK） A结合而得名。近年研究发现AKAP1可将多种信号蛋白以及mRNA招募至线粒体外膜，调节线粒体功能及一系列相关生理病理过程。研究报道AKAP1可参与调控心肌肥厚、心肌细胞凋亡、血管舒张等活动，提示AKAP1与心血管疾病密切相关。本文将对AKAP1及其信号复合物调控线粒体功能的分子机制进行综述，并阐述AKAP1在心血管疾病中的研究进展。     

促发低氧性肺动脉高压的新机制--肺微动脉的血管胰岛素敏感性降低及其信号障碍

目的观察低氧诱导大鼠肺微血管内皮细胞（PMVEC）,是否同样存在肺血管的胰岛素敏感性变化？并探讨潜在的分子机制。方法：采用低压低氧法建立低氧性肺动脉高压（HPH）大鼠模型,14只雄性SD大鼠随机分为：正常对照组和HPH组（低氧4周）,每组7只大鼠（n=7）测定两组平均肺动脉压（mPAP）及胰岛素诱导的血管舒张效应。原代培养大鼠PMVEC,分为常氧（21％O2,37℃）和低氧（10％O2,37℃）处理,分别培养6 h、24 h、48 h和96 h收集细胞以Western blot检测Tribbles同源蛋白3（TRB3）、过氧化物酶体增殖物激活受体（PPAR^y）及胰岛素的磷脂肌醇3激酶／蛋白激酶B／内皮一氧化氮合酶（P13K／Akt／eNOS）信号通路蛋白水平,培养基上清检测一氧化氮（NO）生成量。结果：与正常对照组比较,低氧组mPAP明显升高,胰岛素诱导的肺动脉血管舒张作用明显减弱（P〈0．05,P〈0．01）。PMVEC在含胰岛素的内皮培养基培养不同时间,低氧组与常氧组相比,培养6 h NO量明显升高,培养24 h后有所下降,随低氧时间的延长下降幅度增大（P〈0．01）;随低氧时间延长,P13K-p85、p-Akt、p-eNOS表达逐渐下降,低氧时间越长下降幅度越明显,与NO生成相一致,p-ERKl／2随低氧时间延长表达明显升高;随低氧时间延长TRB3表达增加显著,而PPARY表达减少（P〈0．05,P〈0．01）。而不同培养时间常氧组间NO量及上述蛋白表达无显著性差异。结论：低氧可诱导大鼠PMVEC内TRB3的过表达从而负性调控PPARl,引起下游胰岛素信号通路受损,造成肺血管内皮功能异常,进而促进HPH发生。     

虚实结合在心脏机能学实验教学中的应用分析

目的 评价虚实结合实验在心脏机能学实验教学中的教学质量与效果。 方法 选取2021年秋季学期参与心脏机能学实验的学生,利用虚拟仿真实验和实践操作实验教学方法开展实验教学,实验结束后以问卷方式对教学质量和效果进行调查评估。 结果 问卷调查分析显示,虚实结合实验教学有利于教学质量、教学效果的提升,有利于学生自主学习,得到了学生的认可,提示了教师需要提高自身修养。 结论 虚实结合实验教学灵活方便,有利于提高教学质量,提升教学效果,促进学生自主学习,是一种赋能增效的教学方法。     

PINK1低表达诱导线粒体自噬障碍致糖尿病缺血心肌易损及机制

【立论依据】 糖尿病患者发生缺血性心脏病(IHD)后心肌损伤程度明显高于非糖尿病患者,但其具体机制尚待阐明。线粒体自噬是细胞通过自噬机制选择性清除线粒体的过程,对于维持线粒体功能和细胞生存至关重要。新近研究表明,线粒体激酶PINK1可通过线粒体融合蛋白Mfn2募集并结合E3泛素连接酶Parkin,介导线粒体自噬。然而,PINK1在糖尿病心肌中的表达变化及其介导的Mfn2-Parkin通路在心肌缺血损伤中的作用尚不清楚。 【设计思路】 本课题拟在整体和细胞水平研究PINK1在糖尿病心肌中是否低表达、并引发线粒体自噬障碍,进而增加糖尿病缺血心肌易损性。 【实验内容】 (1)高脂饲料(45%脂肪含量)喂养C57BL/6小鼠16周,建立2型糖尿病(T2DM)小鼠模型。(2)在对照和T2DM小鼠构建心肌缺血(MI)模型,观察缺血心肌损伤、心肌PINK1-Mfn2-Parkin信号变化、线粒体自噬及线粒体功能。(3)分离乳鼠心肌细胞,高糖/高脂培养,利用腺病毒转染过表达PINK1或RNAi技术剔除PINK1表达,研究PINK1介导的线粒体自噬与心肌细胞缺氧损伤的关系。 【材料】 C57BL/6小鼠,SD乳鼠,线粒体膜电位测试盒,TUNEL凋亡检测试剂盒,蛋白质印迹、RNA干扰、腺病毒转染所需试剂等。 【可行性】 我们成功制备了T2DM小鼠模型;预实验结果提示,与对照组相比,T2DM小鼠心肌PINK1表达减少,且MI后心肌线粒体自噬水平显著降低,心肌缺血损伤加重(P<0.05)。过表达PINK1可有效增加高糖/高脂培养心肌细胞的线粒体自噬,减少缺氧心肌细胞凋亡(P<0.05)。以上结果强烈提示,PINK1的低表达通过影响线粒体自噬加重糖尿病心肌易损性的假设是可行的。本课题涉及的实验方法在前期研究中已熟练运用,为顺利完成奠定了基础;且实验室具备所需实验条件,所有实验试剂均可在国内购得。 【创新性】 PINK1-Mfn2-Parkin介导的线粒体自噬对于糖尿病心肌易损性的作用未见报道。预实验结果证实,PINK1低表达诱导线粒体自噬障碍致糖尿病缺血心肌易损性增加,增加心肌PINK1表达可显著改善糖尿病心肌抗缺血损伤的能力。如能彻底阐明该问题,可为减轻糖尿病IHD患者的心肌损伤提供全新的干预靶点和实验依据。     

MAPK信号通路而非Akt信号通路参与压力负荷导致的心肌肥厚反应

2010年5月3日出版的《临床研究杂志》（J Clin Invest）刊载了一篇关于心力衰竭的研究论文,题为＂心肌胰岛素信号通路的过度激活加重了压力负荷导致的心脏功能障碍＂。因该义与我们目前从事的研究密切相关,我们课题组对该论文进行了深入讨论,对作者关于胰岛素及其信号通路与心肌肥厚的关系提出了质疑,所撰写的两篇Letter干2010年年5月4日和5月5日相继在《J Clin Invest》官方网站上刊登。随后该文作者之一美国犹他大学Abel教授专程来访我校,就相关问题与我们进行了面对面的探讨,并促成了双方合作。     

AKAP1过表达腺病毒载体构建及其在心肌细胞中的功能初步研究

目的 利用AdEasy腺病毒载体系统构建A激酶锚定蛋白（AKAP）1重组腺病毒载体，初步探索AKAP1在心肌细胞中的功能。 方法 以正常小鼠心肌细胞cDNA为模板，利用PCR获取AKAP1基因，构建腺病毒重组质粒pAdEasy-AKAP1。用293A细胞，包装重组腺病毒Ad-AKAP1颗粒，并用荧光蛋白标记法测定其滴度。用Western blot检测重组腺病毒感染原代小鼠心肌细胞和糖尿病心肌病细胞模型后AKAP1、Caspase-3的表达情况，用流式细胞仪检测原代小鼠心肌细胞内ROS生成水平及AKAP1对高糖状态下心肌细胞凋亡的影响。 结果 构建了携带AKAP1基因的过表达腺病毒载体，并获得5×1010 pfu/ml的高滴度重组腺病毒。重组腺病毒可感染原代心肌细胞和糖尿病心肌病模型H9c2细胞并介导AKAP1过表达（P<0.05）。与阴性对照组相比，过表达AKAP1可抑制高糖高脂状态下心肌细胞内ROS的生成（P<0.05），可抑制高糖状态下心肌细胞的凋亡和Caspase-3活化（P<0.01）。 结论 过表达AKAP1对高糖高脂状态下的心肌细胞具有潜在保护作用，对心肌功能发挥具有重要作用。其机制可能与AKAP1抑制心肌细胞内ROS生成、抑制Caspase-3活化、抑制细胞凋亡有关。     

BLOC⁃3介导Rab32线粒体定位改变对肝癌细胞生长的作用研究

目的 观察溶酶体相关细胞器生物发生复合体⁃3 （biogenesis of lysosome⁃related organelles complex⁃3,BLOC⁃3）亚基Hps1和Hps4对肝癌细胞中Rab32线粒体定位的影响及在肝癌细胞生长中的作用。 方法 通过公共数据库GenDoma,String和InBio Discover分析Hps1和Hps4与Rab32的相互作用情况。体外培养人肝癌细胞系SNU⁃739和Hep⁃3B,利用脂质体转染方法分别转染Hps1和Hps4相关的siRNAs和质粒,采用免疫荧光和Western blot观察Hps1和Hps4对Rab32线粒体定位的影响,细胞划痕、克隆形成、EdU、MTS及Transwell侵袭实验检测Hps1和Hps4调控Rab32线粒体定位后肝癌细胞迁移、增殖和侵袭的变化情况。通过公共数据库UALCAN中的数据集CPTAC分析Rab32蛋白在肝癌和正常肝脏组织中的表达差异。 结果 数据库分析结果显示,Hps1和Hps4均可以与Rab32相互作用;与正常肝脏组织相比,Rab32蛋白在肝癌组织中的表达显著降低（P<0.001）。在肝癌细胞系SNU⁃739中干涉Hps1或Hps4或同时干涉Hps1和Hps4后,Rab32线粒体定位均减少（均P<0.01）,细胞线粒体Rab32蛋白表达均降低（均P<0.001）,细胞增殖、迁移和侵袭能力增强（均P<0.05）;在肝癌细胞系Hep⁃3B中过表达Hps1和Hps4后,Rab32线粒体定位增多（P<0.01）,细胞线粒体Rab32蛋白表达增加（P<0.001）,细胞增殖、迁移和侵袭能力均受抑制（均P<0.01）,而单独过表达Hps1或Hps4时无显著抑制作用（均P>0.05）。结论 BLOC⁃3亚基Hps1和Hps4均可与Rab32相互作用并增加Rab32线粒体定位,进而抑制肝癌细胞生长。     

生理学启发式实验教学初探

实验教学是医学院校教学的重要组成部分,生理学更是一门机能实验性学科。在生理学实验教学中应用启发式教学方法,能激发学生学习兴趣,发挥其主观能动性,学生的自学能力、分析归纳能力及创造性思维能力都得以提高,取得了良好的实验教学效果。     

做好实验报告,提高生理学实验教学质量

实验教学是医学院校教学的重要组成部分,加强实验教学环节是充分体现学科的特点、提高教学质量的关键.而实验报告是实验教学过程中一个重要的环节,是衡量实验教学效果的重要依据.试讨论如何从实验报告入手加强实验教学,提高生理学实验教学质量.     

促发低氧性肺动脉高压的新机制——肺微动脉的血管胰岛素敏感性降低及其信号障碍

目的:观察低氧诱导大鼠肺微血管内皮细胞（PMVEC）,是否同样存在肺血管的胰岛素敏感性变化？并探讨潜在的分子机制。方法:采用低压低氧法建立低氧性肺动脉高压（HPH）大鼠模型,14只雄性SD大鼠随机分为:正常对照组和HPH组（低氧4周）,每组7只大鼠（n=7）测定两组平均肺动脉压（mPAP）及胰岛素诱导的血管舒张效应。原代培养大鼠PMVEC,分为常氧（21%O2,37℃）和低氧（10%O2,37℃）处理,分别培养6 h、24 h、48 h和96 h收集细胞以Western blot检测Tribbles同源蛋白3（TRB3）、过氧化物酶体增殖物激活受体（PPARγ）及胰岛素的磷脂肌醇3激酶/蛋白激酶B/内皮一氧化氮合酶（PI3K/Akt/eNOS）信号通路蛋白水平,培养基上清检测一氧化氮（NO）生成量。结果:与正常对照组比较,低氧组mPAP明显升高,胰岛素诱导的肺动脉血管舒张作用明显减弱（P<0.05,P<0.01）。PMVEC在含胰岛素的内皮培养基培养不同时间,低氧组与常氧组相比,培养6 h NO量明显升高,培养24 h后有所下降,随低氧时间的延长下降幅度增大（P<0.01）;随低氧时间延长,PI3K-p85、p-Akt、p-eNOS表达逐渐下降,低氧时间越长下降幅度越明显,与NO生成相一致,p-ERK1/2随低氧时间延长表达明显升高;随低氧时间延长TRB3表达增加显著,而PPARγ表达减少（P<0.05,P<0.01）。而不同培养时间常氧组间NO量及上述蛋白表达无显著性差异。结论:低氧可诱导大鼠PMVEC内TRB3的过表达从而负性调控PPARγ,引起下游胰岛素信号通路受损,造成肺血管内皮功能异常,进而促进HPH发生。