LINC00473调控miR-210/TET2分子轴对H2O2诱导的人晶状体上皮细胞生物学特性的影响

目的　探讨LINC00473调控miR-210/10-11易位酶2（TET2）分子轴对H₂O₂诱导的人晶状体上皮细胞生物学特性的影响。方法　人晶状体上皮细胞SRA01/04传代培养后,采用100 μmol·L^-1 H₂O₂处理24 h。将SRA01/04细胞分为Con组、H₂O₂组、H₂O₂+pcDNA3.1组、H₂O₂+pcDNA3.1-LINC00473组、H₂O₂+pcDNA3.1-LINC00473+miR-NC组、pcDNA3.1-LINC00473+miR-210组、H₂O₂+pcDNA3.1-LINC00473+si-NC组、H₂O₂+ pcDNA3.1-LINC00473+si-TET2组。细胞计数试剂盒（CCK-8）检测细胞活力,流式细胞术检测细胞凋亡,试剂盒检测细胞中丙二醛（MDA）含量和超氧化物歧化酶（SOD）、谷光甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性。双荧光素酶报告基因实验检测LINC00473与miR-210、miR-210与TET2的靶向结合关系。结果　Con组与H₂O₂组、H₂O₂+pcDNA3.1组与H₂O₂+pcDNA3.1-LINC00473组、H₂O₂+pcDNA3.1-LINC00473+miR-NC组与pcDNA3.1-LINC00473+miR-210组、H₂O₂+pcDNA3.1-LINC00473+si-NC组与H₂O₂+ pcDNA3.1-LINC00473+si-TET2组相比,细胞存活率、细胞凋亡率、克隆形成数、MDA含量、SOD和GSH-Px活性差异均有统计学意义（均为P<0.05）。双荧光素酶报告基因实验结果显示,miR-NC和WT-LINC00473共转染组SRA01/04细胞荧光素酶活性（0.36±0.03）较miR-210 mimics和WT-LINC00473共转染组（0.96±0.10）显著降低（P<0.05）;miR-NC和WT-TET2共转染组SRA01/04细胞的荧光素酶活性（0.33±0.03）较miR-210 mimics和WT-TET2共转染组（0.94±0.09）显著降低,差异有统计学意义（P<0.05）;LINC00473靶向作用miR-210并下调其表达水平,miR-210可负调控TET2的表达水平。结论　LINC00473通过下调miR-210/TET2分子轴减轻对H₂O₂对人晶状体上皮细胞增殖、凋亡和氧化损伤的影响。     

POLH对过氧化氢诱导的晶状体上皮细胞氧化应激和凋亡的影响

目的　探究DNA聚合酶η（POLH）对过氧化氢（H₂O₂）诱导的晶状体上皮细胞氧化应激和凋亡的防御机制。方法　以年龄相关性白内障患者的晶状体前囊膜组织和H₂O₂处理的晶状体上皮细胞系SRA01/04为研究对象,分别通过RT-PCR和免疫印迹实验验证POLH的表达并筛选H₂O₂最佳作用浓度用于后续实验,将培养的SRA01/04细胞分为H₂O₂组、H₂O₂+HA组和H₂O₂+OV-POLH组,采用RT-PCR和免疫印迹实验检测POLH mRNA和蛋白表达情况,免疫荧光法检测DNA氧化损伤标志物以及TUNEL实验检测细胞凋亡变化,免疫印迹实验检测细胞中BAX、BCL-2、Nrf2和Keap1蛋白表达。结果　RT-PCR结果显示,与透明晶状体前囊膜（1.00±0.22）相比,年龄相关性白内障患者晶状体前囊膜组织中POLH mRNA相对表达量明显下降（0.38±0.62）（P<0.000 1）。RT-PCR和免疫印迹实验均显示,200 μmol·L^-1 H₂O₂处理的SRA01/04细胞中POLH表达量最低;TUNEL实验检测结果显示, 200 μmol·L^-1 H₂O₂处理后细胞的凋亡明显增加。RT-PCR和免疫印迹实验结果显示,与H₂O₂组和H₂O₂+HA组相比,H₂O₂+OV-POLH组SRA01/04细胞中POLH表达量显著升高（P<0.000 1）。免疫荧光染色结果显示,与H₂O₂+HA组相比,H₂O₂+OV-POLH组细胞的γH2A染色明显下降。免疫印迹实验检测结果显示,与H₂O₂组和H₂O₂+HA组相比,H₂O₂+OV-POLH组细胞促凋亡蛋白BAX表达量明显下降,而抑凋亡蛋白BCL-2表达量明显升高（均为P<0.01）;与H₂O₂组和H₂O₂+HA组相比,H₂O₂+OV-POLH组细胞Keap1蛋白水平明显下降,而转录调控蛋白Nrf2表达明显升高（均为P<0.01）。结论　过表达POLH可通过增强DNA损伤修复功能抑制H₂O₂诱导的晶状体上皮细胞凋亡,其抑制氧化应激机制可能与Nrf2-Keap1-ARE通路有关。     

丹参酮IIA对过氧化氢诱导的人晶状体上皮细胞凋亡和氧化应激的影响

目的　探讨丹参酮IIA（Tan IIA）对过氧化氢（H₂O₂）诱导的人晶状体上皮细胞凋亡和氧化应激的调控作用及可能的机制。方法　以人晶状体上皮细胞SRA01/04为研究对象,分为空白组、H₂O₂组（H₂O₂处理细胞建立氧化损伤模型）、Tan IIA组（Tan IIA溶液预处理24 h后,H₂O₂作用24 h）、Tan IIA+siNC组（转染阴性对照,其他处理方式同Tan IIA组）和Tan IIA+siNrf2组［转染核因子E2相关因子2（Nrf2） siRNA(siNrf2),其他处理方式同Tan IIA组］。CCK-8法检测细胞活力,流式细胞术分别检测细胞凋亡率和活性氧簇（ROS）水平,酶联免疫吸附试验测定细胞中过氧化氢酶（CAT）活性、超氧化物歧化酶（SOD）含量、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）含量,Western blot检测细胞总蛋白中Nrf2、血红素氧合酶-1（HO-1）表达及核蛋白中Nrf2表达情况。结果　通过CCK-8法确定H₂O₂和Tan IIA最佳实验浓度为300 μmol·L^-1和20 μmol·L^-1。与空白组相比,H₂O₂组SRA01/04细胞活力及细胞中CAT活性、SOD含量、GSH-Px含量均降低,凋亡率和ROS水平均增加,同时总蛋白中Nrf2和HO-1蛋白相对表达量及核蛋白中Nrf2蛋白相对表达量均下调（均为P<0.05）。与H₂O₂组相比,Tan IIA组SRA01/04细胞活力及细胞中CAT活性、SOD含量、GSH-Px含量均增加,凋亡率和ROS水平均降低,总蛋白中Nrf2和HO-1蛋白相对表达量及核蛋白中Nrf2蛋白相对表达量均上调（均为P<0.05）。而沉默Nrf2基因后,Tan IIA对SRA01/04细胞的保护作用被逆转。结论　Tan IIA能够抑制H₂O₂诱导的人晶状体上皮细胞氧化应激性损伤和凋亡,其机制与Nrf2/HO-1通路的激活有关。     

S期激酶相关蛋白2（SKP2）泛素化修饰OGG1对中波紫外线诱导的晶状体上皮细胞氧化损伤作用

目的　探索E3泛素连接酶S期激酶相关蛋白2（SKP2）介导的碱基切除修复蛋白8-氧代鸟嘌呤-DNA糖基化酶（OGG1）在年龄相关性白内障（ARC）发生过程中的泛素化降解机制。方法　采用免疫沉淀实验检测OGG1的泛素化修饰及其与SKP2的结合能力。采用中波紫外线（UVB）照射人晶状体上皮细胞株SRA01/04构建细胞氧化损伤模型。蛋白免疫印迹实验检测细胞氧化损伤模型和过表达模型细胞中SKP2的蛋白表达。通过转染SKP2质粒,增加SKP2的表达并观察细胞中OGG1蛋白的表达变化。结果　OGG1蛋白存在泛素化修饰。UbiBrowser软件预测能与OGG1结合的潜在E3泛素连接酶,并通过免疫沉淀实验证明SKP2与OGG1之间存在相互作用。在氧化损伤环境下,SRA01/04细胞中SKP2蛋白表达出现先下降后逐渐升高的趋势,其中UVB照射10 min时SKP2表达下降最为显著。对照组、转染空载质粒组和转染SKP2过表达质粒组SRA01/04细胞中SKP2蛋白的相对表达量分别为1.040±0.007、0.920±0.008和1.330±0.020,与转染空载质粒组相比,转染SKP2过表达质粒组细胞中SKP2蛋白的表达显著上调（P＜0.05）。空白对照组、UVB组、UVB+转染空载质粒组和UVB+转染SKP2过表达质粒组细胞中OGG1蛋白的相对表达量分别为1.05±0.01、5.05±0.16、5.20±0.07和3.83±0.10;与UVB+转染空载质粒组相比,UVB+转染SKP2过表达质粒组SRA01/04细胞中OGG1蛋白相对表达水平明显降低,且差异有统计学意义（P＜0.05）。结论　E3泛素连接酶SKP2能够促进OGG1发生泛素化降解,导致晶状体上皮细胞内部损伤性DNA的累积,从而导致ARC的发生发展。     

Bax抑制因子1对紫外线B诱导下人晶状体上皮细胞凋亡的抑制作用

目的　探讨Bax抑制因子1（BI-1）对紫外线B（UVB）诱导下人晶状体上皮细胞凋亡的抑制作用。方法　取对数生长期的人晶状体上皮细胞（HLEC）系SRA01/04细胞,将BI-1过表达质粒及其空载质粒转染至SRA01/04细胞中,分别记为BI-1组、Vector组,另取不做任何处理的SRA01/04细胞作为blank组。转染48 h后,采用实时荧光定量PCR和Western blot检测转染后各组细胞中BI-1 mRNA和蛋白表达水平。而后再根据实验需要将细胞分为6组:（1）Control组,SRA01/04细胞不经任何处理;（2）UVB组,采用紫外线（2.0 W·cm^-2）处理SRA01/04细胞60 min;（3）Vector组,转染BI-1空载质粒的SRA01/04细胞;（4）BI-1组,转染BI-1过表达质粒的SRA01/04细胞;（5）Vector+UVB组,转染BI-1空载质粒的SRA01/04细胞,再经紫外线（2.0 W·cm^-2）照射60 min;（6）BI-1+UVB组,转染BI-1过表达质粒的SRA01/04细胞,再经紫外线（2.0 W·cm^-2）照射60 min。采用实时荧光定量PCR检测UVB照射后各组细胞中BI-1 mRNA表达水平,CCK-8法检测细胞增殖情况,流式细胞仪检测各组细胞中活性氧（ROS）含量,荧光探针法检测细胞内质网内Ca²⁺浓度,流式细胞仪检测细胞凋亡率,Western blot检测各组细胞中相关蛋白表达水平。结果　本研究中所培养的SRA01/04细胞在荧光显微镜下可观察到细胞内αA-晶状体蛋白呈红色荧光。随着UVB照射强度增加,SRA01/04细胞内BI-1 mRNA表达水平逐渐降低,本研究选择UVB照射强度为2.0 W·cm^-2进行后续的实验。与blank组或Vector组相比,BI-1组细胞中BI-1 mRNA和蛋白表达水平均显著上升,差异均有统计学意义（均为P＜0.05）。与Control组比较,UVB组细胞增殖活性显著降低,细胞内ROS含量显著增加,细胞内质网内Ca²⁺浓度显著升高,细胞凋亡率显著升高,细胞内Cleaved-caspase-3、Bax蛋白表达水平显著上调,Bcl-2蛋白表达水平显著下调,细胞内GRP78、p-IRE1、p-JNK和Cleaved-caspase-12蛋白表达水平显著上调（均为P＜0.05）。BI-1+UVB组细胞增殖活性较UVB组显著增高,细胞内ROS含量较UVB组显著降低,细胞内质网内Ca²⁺浓度较UVB组显著下降;与UVB组比较,BI-1+UVB组细胞凋亡率显著下降,细胞内Cleaved-caspase-3、Bax蛋白表达水平显著下调,Bcl-2蛋白表达水平显著上调;BI-1+UVB组细胞内GRP78、p-IRE1、p-JNK和Cleaved-caspase-12蛋白表达水平较UVB组显著下调（均为P＜0.05）。结论　BI-1在UVB诱导的HLEC系SRA01/04细胞中表达显著下调,BI-1过表达可通过降低内质网内Ca²⁺浓度抑制内质网应激介导的IRE1-JNK信号通路的激活,进而抑制UVB诱导的SRA01/04细胞凋亡。     

ALKBH5对紫外线诱导的晶状体上皮细胞氧化损伤模型中DNA损伤修复的影响

目的　探究N⁶-甲基腺苷（m⁶A）去甲基化酶ALKBH5对紫外线诱导的晶状体上皮细胞（LEC）氧化损伤模型中DNA损伤修复的影响。方法　运用qRT-PCR和免疫印迹实验检测年龄相关性白内障（ARC）患者和对照组晶状体前囊膜上皮细胞中ALKBH5的mRNA和蛋白的表达。通过紫外线B（UVB）构建晶状体上皮细胞株SRA01/04细胞氧化损伤模型和靶向ALKBH5设计小干扰RNA（siRNA）转染构建敲降模型,运用qRT-PCR和免疫印迹实验检测氧化损伤模型和敲降模型中ALKBH5的mRNA和蛋白表达。运用CCK-8法检测Control组、UVB组、UVB+siNC组和UVB+siALKBH5#3组中SRA01/04细胞活力变化。免疫荧光染色检测UVB+siNC组和UVB+siALKBH5#3组中15A3的荧光强度变化。运用qRT-PCR检测转染对照siNC组和转染siALKBH5#3组中11个DNA氧化损伤修复基因（ODRGs）的mRNA表达变化。结果　在ARC患者的晶状体前囊膜上皮细胞中,ALKBH5的mRNA和蛋白表达水平均显著升高。在UVB以时间梯度诱导SRA01/04的细胞氧化损伤模型中,ALKBH5的mRNA和蛋白表达水平均呈上升后下降趋势,其中UVB照射10 min后ALKBH5 mRNA和蛋白表达升高最为显著。ALKBH5敲降效率结果显示,与转染对照siNC组相比,转染靶向ALKBH5的siRNA后,ALKBH5的mRNA和蛋白表达均显著下降。CCK-8法检测结果显示,与UVB+siNC组相比,UVB+siALKBH5#3组SRA01/04细胞活力明显降低。免疫荧光染色检测结果显示,与UVB+siNC组相比,UVB+siALKBH5#3组SRA01/04细胞内DNA氧化损伤指标15A3染色显著增加。同时,与转染对照siNC组相比,转染ALKBH5#3组SRA01/04细胞的ODRGs中,TREX1、FANCD2、LIG1、MSH2、MSH3、RPA2、SMUG1、XRCC6 mRNA的表达均显著上升,DCLRE1A mRNA的表达显著下降,MGMT和MRE11A mRNA的表达则未见明显差异。结论　m⁶A去甲基化酶ALKBH5在UVB诱导的LEC氧化损伤模型中诱导性表达上升,敲降ALKBH5可促进LEC内大部分ODRGs表达升高,参与调控LEC内损伤DNA的修复,阻止ARC的发生。     

老年性白内障患者circKMT2E表达变化及其对晶状体上皮细胞凋亡的影响

目的　探讨circKMT2E在老年性白内障（ARC）患者中的表达变化及其对晶状体上皮细胞凋亡的影响。方法　取10例在我院接受白内障手术的ARC患者晶状体前囊膜,另选取4例健康捐献者透明晶状体前囊膜作为对照。使用Trizol试剂从人晶状体前囊膜组织中提取总RNA。依次使用cutadapt软件、DCC软件(v0.4.4)、STAR软件 (v2.51 b)、CircBase数据库和circ2Trait数据库对所测得的环状RNA（circRNA）进行注释,筛选circRNA差异表达。将体外培养的SRA01-04细胞随机分组,其中,空白对照组:用正常培养液培养,不作特殊处理;miR-control组:转染miR-control无序序列;miR-34a组:转染miR-34a-5p mimics序列;miR-34a+control组:共转染miR-34a-5p mimics序列和pcDNA3.1-control空载体;miR-34a+HMGB1组:共转染miR-34a-5p mimics序列和pcDNA3.1-HMGB1质粒。采用实时荧光定量PCR与双荧光素酶报告基因检测基因表达情况。 通过流式细胞仪检测细胞凋亡率,Western blot检测蛋白表达。结果　经生物信息学分析显示,circKMT2E在ARC患者晶状体前囊膜组织中表达上调最为显著。双荧光素酶报告基因检测结果显示,转染miR-34a-5p后circKMT2E-WT报告基因的荧光素酶活性由1.000±0.023降低至0.502±0.057（P<0.05）;而circKMT2E-MUT报告基因的荧光素酶活性由1.005±0.018降低至0.989±0.053（P>0.05）。miR-34a组SRA01-04细胞凋亡率（23.59%±3.47%）较miR-control组（3.82%±0.41%）增高（P<0.05）,而miR-34a-HMGB1组SRA01-04细胞凋亡率（8.97%±1.20%）较miR-34a-control组（24.59%±4.33 %）降低（P<0.05）。miR-34a组SRA01-04细胞Cyt-C蛋白、Bax蛋白相对表达量较miR-control组均升高,同时Bcl-2蛋白相对表达量则降低（均为P<0.05）;miR-34a-HMGB1组SRA01-04细胞Cyt-C蛋白和Bax蛋白相对表达量较miR-34a-control组均降低,同时Bcl-2蛋白相对表达量较miR-34a-control组增加（均为P<0.05）。结论　circKMT2E可通过海绵吸附miR-34a-5p减弱其对下游靶点HMGB1的抑制作用,进而有效地阻止SRA01-04细胞凋亡,在一定程度起到延缓ARC发展的作用。     

褪黑素对过氧化氢诱导的人晶状体上皮细胞凋亡及自噬的影响

目的 探讨褪黑素对H₂O₂诱导的人晶状体上皮细胞(LECs)氧化损伤的作用机制。方法 将培养好的人晶状体上皮细胞株(SRA01/04)随机分为对照组(不做任何处理)、H₂O₂组(400μmol·L^-1 H₂O₂处理)、DMSO+H₂O₂组(400μmol·L^-1 H₂O₂和0.2μmol·L^-1 DSMO处理)、褪黑素+H₂O₂组(400μmol·L^-1 H₂O₂和50μmol·L^-1褪黑素处理)。细胞分组处理后继续培养24 h,进行各项实验室检测比较。CCK8实验检测各组细胞活力；免疫印迹实验检测各组细胞凋亡相关蛋白(Bax和Bcl-2)以及自噬相关蛋白(P62、Becli...     

miR-24对过氧化氢诱导的HLE-B3细胞凋亡的影响及其与线粒体Smac/Diablo-XIAP-caspase-9/3凋亡途径的关系

目的　探讨微小RNA-24(miR-24)对过氧化氢（H₂O₂）诱导的HLE-B3细胞凋亡的影响,分析其与线粒体中第二个线粒体衍生的胱天蛋白酶激活因子/低等电位点的凋亡抑制蛋白的直接结合蛋白（the second mitochondria-derived activator of caspase/direct IAP-binding protein with low PI,Smac/Diablo）-XIAP-caspase-9/3凋亡途径的关系。方法　将HLE-B3细胞分为对照组、H₂O₂组、H₂O₂+miR-24 NC组和H₂O₂+miR-24 抑制剂组。先按照miR-24抑制剂、miR-24 NC试剂盒说明书转染H₂O₂+miR-24抑制剂组和H₂O₂+miR-24 NC组细胞24 h,然后向H₂O₂组、H₂O₂+miR-24 NC组和H₂O₂+miR-24 抑制剂组HLE-B3细胞中加入200 μmol·L^-1 H₂O₂干预24 h,收集细胞用于后续实验;将正常培养的HLE-B3细胞设置为对照组。采用实时荧光定量PCR检测各组HLE-B3细胞miR-24表达情况,CCK-8法检测各组HLE-B3细胞生长情况,用流式细胞仪检测各组细胞凋亡情况,计算各组细胞存活率和细胞凋亡率。采用荧光探针JC-1法检测线粒体膜电位变化情况（利用红绿荧光强度比反映线粒体膜电位）;采用蛋白免疫印迹法检测各组HLE-B3细胞线粒体和细胞质分级中Smac/Diablo及细胞质分级中XIAP、caspase-9和caspase-3蛋白表达情况。对所得数据进行统计学分析。结果　当H₂O₂浓度大于200 μmol·L^-1时,细胞存活率均小于50%,本实验以200 μmol·L^-1 作为最适H₂O₂浓度。对照组、H₂O₂组、H₂O₂+miR-24 NC组和H₂O₂+miR-24抑制剂组细胞miR-24相对表达量分别为1.04±0.02、2.73±0.09、2.69±0.07 和1.15±0.06;与对照组相比,H₂O₂组细胞中miR-24表达升高（P<0.05）;与H₂O₂组和H₂O₂+miR-24 NC组相比,H₂O₂+miR-24抑制剂组中miR-24表达降低（均为P<0.05）,但H₂O₂组与H₂O₂+miR-24 NC组中miR-24表达差异无统计学意义（P>0.05）。与H₂O₂组和H₂O₂+miR-24 NC组相比,H₂O₂+miR-24抑制剂组细胞存活率显著升高、细胞凋亡率显著降低（均为P<0.05）,但H₂O₂组与H₂O₂+miR-24 NC组细胞存活率和细胞凋亡率差异均无统计学意义（均为P>0.05）。对照组、H₂O₂组、H₂O₂+miR-24 NC组和H₂O₂+miR-24抑制剂组红绿荧光强度比分别为0.24±0.02、0.12±0.02、0.15±0.03、0.31±0.06。与对照组相比,H₂O₂组红绿荧光强度比降低（P<0.05）;与H₂O₂组和H₂O₂+miR-24 NC组相比,H₂O₂+miR-24抑制剂组红绿荧光强度比均升高（均为P<0.05）,但H₂O₂组与H₂O₂+miR-24 NC组红绿荧光强度比比较,差异无统计学意义（P>0.05）。与H₂O₂组和H₂O₂+miR-24 NC组相比,H₂O₂+miR-24抑制剂组线粒体分级中Smac/Diablo蛋白及细胞质分级中XIAP蛋白表达升高（均为P<0.05）,细胞质分级中Smac/Diablo、caspase-9和caspase-3蛋白表达降低（均为P<0.05）,但H₂O₂组与H₂O₂+miR-24 NC组线粒体、细胞质分级中Smac/Diablo蛋白及细胞质分级中XIAP、caspase-9和caspase-3蛋白表达相比,差异均无统计学意义（均为P>0.05）。结论　miR-24可能通过抑制线粒体Smac/Diablo-XIAP-caspase-9/3凋亡途径,抑制H₂O₂诱导的HLE-B3细胞凋亡。     

褪黑素联合锌对H2O2诱导的人视网膜色素上皮细胞氧化损伤的保护作用

目的　探讨褪黑素（MT）联合锌（Zn）对H₂O₂诱导的人视网膜色素上皮（ARPE）细胞氧化损伤的保护作用。方法　常规培养ARPE细胞株（ARPE-19）,利用不同浓度H₂O₂处理ARPE-19细胞,将细胞存活率接近50%的H₂O₂浓度作为氧化损伤浓度。将ARPE-19细胞分为:不同浓度MT（10^-5 mol·L^-1、10^-6mol·L^-1、10^-7mol·L^-1）+ZnCl₂（15 μmol·L^-1）组,ZnCl₂组（采用15 μmol·L^-1 ZnCl₂培养细胞）,H₂O₂组（不添加MT和ZnCl₂培养细胞）,空白对照组（细胞不做任何处理）。采用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。采用试剂盒测量各组细胞内活性氧（ROS）和丙二醛（MDA）的含量。ELISA检测各组细胞内白细胞介素-6（IL-6）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的表达量。结果　当H₂O₂浓度为300 μmol·L^-1时,细胞存活率为(54.31±1.91)%,此时细胞存活率接近50%,后续实验中均选择该浓度作为氧化损伤浓度。ZnCl₂组、10^-5 mol·L^-1 MT+ZnCl₂组、10^-6 mol·L^-1 MT+ZnCl₂组、10^-7 mol·L^-1 MT+ZnCl₂组细胞凋亡率分别为3.05%、1.17%、1.50%、1.71%,与空白对照组（0）相比差异均无统计学意义（均为P>0.05）。H₂O₂组、ZnCl₂组、10^-7mol·L^-1 MT+ZnCl₂组细胞内ROS含量分别为空白对照组的1.76倍、1.59倍、1.41倍,差异均有统计学意义（均为P<0.05）;10^-5 mol·L^-1 MT+ZnCl₂组、10^-6 mol·L^-1 MT+ZnCl₂组细胞内ROS含量分别为空白对照组的1.13倍和1.25倍,差异均无统计学意义（均为P>0.05）。H₂O₂组细胞内MDA的含量较空白对照组显著提高 （P<0.05）;ZnCl₂组、10^-5 mol·L^-1 MT+ZnCl₂组、10^-6 mol·L^-1 MT+ZnCl₂组、10^-7 mol·L^-1 MT+ZnCl₂组细胞内MDA的含量均较空白对照组稍增加,差异均无统计学意义（均为P>0.05）。H₂O₂组、ZnCl₂组、10^-7 mol·L^-1 MT+ZnCl₂组细胞内IL-6和TNF-α的表达量均显著高于空白对照组,差异均有统计学意义（均为P<0.05）;10^-5 mol·L^-1MT+ZnCl₂组和10^-6 mol·L^-1 MT+ZnCl₂组细胞内IL-6和TNF-α的表达量均略高于空白对照组,差异均无统计学意义（均为P>0.05）。结论　MT联合Zn能有效降低H₂O₂损伤所致ARPE-19细胞内ROS的含量,随之减少细胞内MDA的含量,同时也能抑制IL-6和TNF-α的表达量,从而起到保护RPE细胞的作用。     

miR-29a抑制H2O2诱导的人晶状体上皮细胞氧化损伤

目的　探究miR-29a在H₂O₂诱导的人晶状体上皮细胞氧化损伤中的作用和机制。方法　使用不同浓度（0 μmol·L^-1、100 μmol·L^-1、200 μmol·L^-1、300 μmol·L^-1、400 μmol·L^-1）的H₂O₂处理人晶状体上皮细胞HLE-B3,以确定后续实验中H₂O₂使用的浓度。将HLE-B3细胞随机分成4组:对照组、H₂O₂组、H₂O₂+模拟物对照组和H₂O₂+miR-29a模拟物组,CCK-8法检测细胞活力,流式细胞术检测细胞凋亡,试剂盒检测活性氧（reactive oxygen species,ROS）水平和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）含量,Real-time PCR检测miR-29a和Bcl2修饰因子（Bcl2 modifying factor,BMF）、Bcl2拮抗/杀伤因子1（Bcl2-antagonist/killer 1,BAK1） mRNA表达,Western blotting检测BMF和BAK1蛋白表达。结果　HLE-B3细胞活力随着H₂O₂浓度的增加而降低,呈现剂量依赖性,后续实验H₂O₂浓度选择200 μmol·L^-1。与对照组相比,H₂O₂组中miR-29a的表达（0.56±0.12）下调,细胞活力［（59.67±10.09）%］和SOD含量［（52.97±6.64）U·mL^-1］降低,细胞凋亡率［（40.30±4.76）%］和ROS水平［（299.52±43.95)%］增加,BMF和BAK1 mRNA和蛋白表达均上调,差异均有统计学意义（均为P<0.05）。与H₂O₂组相比,H₂O₂+miR-29a模拟物组中miR-29a的表达（4.49±0.55）上调,细胞活力［（92.83±8.09）%］和SOD含量［（84.03±6.31）U·mL^-1］增加,细胞凋亡率［（18.74±2.48）%］和ROS水平［（143.13±21.32）%］降低,BMF和BAK1 mRNA和蛋白表达均下调,差异均有统计学意义（均为P<0.05）;与H₂O₂组相比,H₂O₂+模拟物对照组上述指标变化均不大,差异均无统计学意义（均为P>0.05）。结论　上调miR-29a可促进H₂O₂诱导的人晶状体上皮细胞的细胞增殖、抑制细胞凋亡、减少氧化损伤,这些作用可能与BMF和BAK1的表达下调相关。     

线粒体靶向肽SS31及RIP抑制剂Necrostatin-1 (Nec-1)对H2O2诱导的氧化应激损伤ARPE-19细胞的保护作用

目的　探讨线粒体靶向肽SS31及RIP抑制剂Necrostatin-1 (Nec-1)对H₂O₂诱导的氧化应激损伤ARPE-19细胞的保护作用。方法　选择400 μmol·L^-1 H₂O₂构建氧化应激损伤模型;根据MTT结果筛选出1 μmol·L^-1 SS31、40 μmol·L^-1 Nec-1作为实验最佳浓度。将培养的细胞分为对照组、SS31+Nec-1组、H₂O₂组、SS31+H₂O₂ 组、SS31+Nec-1+H₂O₂组、Nec-1+H₂O₂组。利用MTT测定细胞存活率,双氯荧光素染色测定细胞活性氧自由基（ROS）水平,JC-1染色测定线粒体膜电位,AnnexinV/PI双染检测细胞PI阳性率,Western blot 法检测RIP3蛋白表达水平。结果　与对照组相比,H₂O₂ 组细胞存活率明显降低（P<0.05）。SS31 + H₂O₂组、Nec-1+ H₂O₂组细胞存活率高于H₂O₂ 组,差异均有统计学意义（均为P<0.05）。荧光显微镜下双氯荧光素染色结果显示,与H₂O₂组相比,SS31+H₂O₂ 组、Nec-1+H₂O₂组绿色荧光明显减弱,细胞内ROS含量明显减少。流式细胞仪结果显示:与对照组相比,H₂O₂ 组线粒体膜电位降低的细胞比例升高,差异有统计学意义（P<0.05）;与H₂O₂ 组相比,SS31+H₂O₂组、Nec-1+H₂O₂ 组线粒体膜电位降低的细胞比例降低,差异均有统计学意义（均为P<0.05）。AnnexinV/PI双染色结果显示:与对照组相比,H₂O₂ 组PI阳性率增加;与H₂O₂ 组相比,SS31+ H₂O₂组、Nec-1+H₂O₂组PI阳性率均明显降低,差异均有统计学意义（均为P<0.05）。Western blot检测结果显示,与对照组相比,H₂O₂组RIP3 蛋白表达水平明显升高,差异有统计学意义（P<0.05）;与H₂O₂ 组相比,SS31+ H₂O₂ 组、Nec-1+H₂O₂ 组RIP3 蛋白表达上调作用显著减弱,差异均有统计学意义（均为P<0.05）。结论　SS31及Nec-1对H₂O₂诱导的ARPE-19细胞氧化应激损伤具有明显的保护作用。     

丹酚酸A（Sal A）对H2O2诱导的氧化应激损伤人晶状体上皮细胞增殖、凋亡、超微结构及炎症反应的作用

目的　探讨丹酚酸A（salvianolic acid A,Sal A）对H₂O₂诱导的氧化应激损伤人晶状体上皮细胞（human lens epithelial cells,HLEC）增殖、凋亡、超微结构及炎症反应的作用。方法　将HLEC SRA01/04细胞传代培养后,用不同浓度（50 μmol·L^-1、100 μmol·L^-1、200 μmol·L^-1、400 μmol·L^-1、800 μmol·L^-1）H₂O₂处理培养24 h,通过MTT法检测细胞存活率,筛选H₂O₂最佳作用浓度,作为细胞模型组使用浓度。对照组细胞用正常完全培养液培养。Sal A干预组将细胞先在含50 μmol·L^-1 Sal A培养液中预孵育24 h,后加入最佳作用浓度H₂O₂继续培养24 h。而后采用MTT法检测各组细胞增殖情况,流式细胞术检测细胞凋亡率,电镜观察细胞超微结构,Western blot检测各组细胞炎症相关蛋白IL-1β、IL-18、TNF-α的表达情况。结果　MTT法检测结果显示不同浓度H₂O₂（50 μmol·L^-1、100 μmol·L^-1、200 μmol·L^-1、400 μmol·L^-1、800 μmol·L^-1）处理组细胞存活率分别为61.26%±3.35%、47.81%±2.63%、29.53%±2.54%、21.47%±2.26%、14.97%±1.82%,各浓度处理组细胞存活率和对照组相比,差异均有统计学意义（均为P<0.05）。其中,100 μmol·L^-1 H₂O₂处理组细胞存活率最接近半数致死量,故选择100 μmol·L^-1 H₂O₂作为氧化应激损伤模型浓度用于后续实验。Sal A干预组细胞存活率为82.54%±3.07%,比100 μmol·L^-1 H₂O₂模型组明显升高,差异有统计学意义（P<0.05）。流式细胞术检测结果显示,对照组细胞凋亡率为4.06%±0.41%,H₂O₂模型组细胞凋亡率为20.52%±3.29%,Sal A干预组细胞凋亡率为12.35%±1.48%,H₂O₂模型组和Sal A干预组细胞凋亡率差异有统计学意义（P<0.05）。电镜观察结果显示H₂O₂诱导产生了明显的细胞超微结构损伤,线粒体、内质网数目减少,分泌颗粒减少,胞核体积缩小,可见少数细胞核内异染色质增多甚至聚集成块状。Sal A预处理后,细胞损伤的超微结构出现一定程度改善,如细胞形态较规则,细胞器线粒体、内质网数目增多,空泡数量减少,染色质分布基本均匀。Western blot检测结果显示,H₂O₂引起的氧化损伤会显著提高IL-1β、IL-18、TNF-α表达,Sal A可以在一定程度上降低IL-1β、IL-18、TNF-α的表达。结论　Sal A可以有效增加H₂O₂诱导的氧化应激损伤HLEC的增殖,抑制细胞凋亡,减小细胞超微结构损伤性改变,降低IL-1β、IL-18、TNF-α表达。     

miR-155-5p靶向SEP15基因在H2O2诱导的人晶状体上皮细胞损伤中的作用

目的探讨miR-155-5p靶向SEP15基因对H2O2诱导的人晶状体上皮细胞损伤的影响及潜在机制。方法用含100μmol·L^-1 H2O2的培养液培养人晶状体上皮细胞系HLE-B3建立H2O2损伤模型,根据处理和转染情况分为对照组、H2O2组、H2O2+anti-miR-NC组、H2O2+anti-miR-155-5p组、H2O2+pcDNA组、H2O2+pcDNA-SEP15组、miR-NC组、miR-155-5p组、H2O2+anti-miR-155-5p+si-NC组、H2O2+anti-miR-155-5p+si-SEP15组,Real-time PCR检测HLE-B3细胞中miR-155-5p和SEP15 mRNA的表达,Western blot测定SEP15、Bcl-2、Bax和Cleaved-caspase-3蛋白的表达,ELISA测定H2O2诱导后HLE-B3中丙二醛(malondialdehyde,MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)水平,流式细胞术测定细胞凋亡率,Targetscan预测miR-155-5p与SEP15的结合关系,双荧光素酶检测验证miR-155-5p与SEP15的调控关系。结果H2O2组HLE-B3细胞中miR-155-5p、SEP15 mRNA、SEP15蛋白、MDA、SOD、GSH-Px含量及凋亡率与对照组相比差异均有统计学意义(均为P<0.05)。H2O2+anti-miR-155-5p组和H2O2+anti-pcDNA-SEP15组的细胞凋亡率分别为(12.69±1.28)%和(14.67±1.52)%,分别与H2O2+anti-miR-NC组的(25.68±2.34)%和H2O2+pcDNA组的(23.65±2.17)%相比,差异均有统计学意义(均为P<0.05)。Targetscan预测miR-155-5p与SEP15存在结合位点,双荧光素酶检测结果显示,miR-155-5p组野生型WT-SEP-15的萤火虫荧光素酶相对活性为0.39±0.03,较miR-NC组的1.02±0.09显著降低(P=0.000)。与H2O2+anti-miR-155-5p-si-NC组相比,H2O2+anti-miR-155-5p+si-SEP15组的SEP-15蛋白、Bcl-2蛋白、SOD活性和GSP-Px含量均显著降低,Bax蛋白、MDA含量及细胞凋亡率均显著升高(均为P<0.05)。结论miR-155-5p通过靶向SEP15基因以减轻H2O2对人晶状体上皮细胞HLE-B3的损伤并抑制细胞凋亡。     

南珠水解液对H2O2诱导的人晶状体上皮细胞氧化损伤的保护作用

目的　探讨南珠水解液对过氧化氢（H₂O₂）诱导的人晶状体上皮细胞（HLEC）氧化应激损伤的保护作用。方法　培养HLEC细胞株HLEB3,在培养液中加入不同浓度南珠水解液,培养24 h和48 h分别检测细胞增殖水平,并据此选择后续实验中南珠水解液浓度。培养HLE-B3细胞,分成3组:正常对照组;氧化损伤组,加入H₂O₂至终浓度为300 μmol·L^-1;南珠水解液处理组,加入H₂O₂至终浓度为300 μmol·L^-1,加入南珠水解液至终浓度为200 mg·L^-1。3组细胞使用流式细胞术检测细胞凋亡率,利用电镜观察细胞形态差异;利用生化检测试剂盒检测3组细胞中谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）和超氧化物岐化酶（SOD）活性以及丙二醛（MDA）含量。结果　3组细胞增殖法检测结果显示,南珠水解液处理HLE-B3细胞24 h后,对其活性无抑制作用;50 mg·L^-1、100 mg·L^-1、200 mg·L^-1南珠水解液处理后细胞存活率分别为（128.68±12.35）%、（158.43±11.71）%和（164.16±24.46）%,48 h后能显著提高其增殖水平,与正常对照组［（100.00±9.78）%］比较,差异有统计学意义（P<0.05）。流式细胞仪检测结果显示,正常对照组细胞凋亡率为（4.527±0.321）%;氧化损伤组为（11.460±0.633）%;南珠水解液处理组细胞凋亡率降至（8.877±0.193）%,与氧化损伤组相比差异具有统计学意义（P<0.05）。电镜下观察结果显示,H₂O₂氧化损伤可以诱导HLE-B3细胞形态改变,损伤程度最高;南珠水解液处理后,细胞形态轻微改变。氧化损伤组细胞内GSH-Px、SOD含量均降低,MDA含量升高,与正常对照组相比差异均具有统计学意义（均为P<0.05);南珠水解液处理组GSH-Px、SOD含量均升高,MDA含量下降,与氧化损伤组相比差异均具有统计学意义（均为P<0.05)。结论　南珠水解液能够促进HLEC生长,抑制细胞凋亡,能够提升HLEC中GSH-Px、SOD活性,降低MDA含量,对H₂O₂诱导的HLEC氧化损伤具有保护作用。     

急性氧化应激初期人晶状体上皮细胞株SRA01/04中衰老标记蛋白30抗氧化作用的研究

目的　初步探讨衰老标记蛋白30（senescence marker protein 30，SMP30）的增加对处于急性氧化应激初期的人晶状体上皮细胞株SRA01/04的保护作用。方法　将处于对数生长期的SRA01/04接种于96孔板，分别使用含150 μmol·L^-1、200 μmol·L^-1、250 μmol·L^-1、300 μmol·L^-1、350 μmol·L^-1、400 μmol·L^-1、450 μmol·L^-1 H₂O₂的培养基作用2 h，CCK-8法选取最佳H₂O₂浓度；使用慢病毒对SRA01/04进行转染建立SMP30高表达模型，实验分3组:SMP30过表达（over expression，OE）组、SMP30过表达相应空载（negative control over expression，NCOE）组及对照（control，CON）组。通过超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）定量检测试剂盒、氧化型谷胱甘肽（oxidized glutathione,GSSG）/总谷胱甘肽（total glutathione,T-GSH）测定试剂盒测量细胞内SOD活力及GSSG/T-GSH比值的变化。结果　经分析，建立模型的最佳H₂O₂浓度为300 μmol·L^-1。在此浓度下，与CON组（5.783±0.192）U·mg^-1及NCOE组（5.837±0.182）U·mg^-1相比，OE组细胞内SOD活力升高，为（10.251±0.110）U·mg^-1；与CON组（29.943±0.241）及NCOE组（30.037±0.433）相比，OE组细胞内GSSG/T-GSH比值（20.990±0.342）降低；差异均有统计学意义（均为P<0.05）。结论　当SRA01/04处于H₂O₂诱导的急性氧化应激初期时，SMP30表达的增加可通过增加SOD活力和降低GSSG/T-GSH比值，加强SRA01/04的抗氧化能力。