MsrB1对ONOO－诱导的人晶状体上皮细胞周期的影响

目的　探讨蛋氨酸亚砜还原酶Ｂ１（ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅｓｕｌｆｏｘｉｄｅｒｅｄｕｃｔａｓｅＢ１,ＭｓｒＢ１）基因沉默对过氧亚硝酸根（ＯＮＯＯ－）诱导的人晶状体上皮细胞（ｈｕｍａｎｌｅｎｓｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｓ,ＨＬＥＣ）细胞周期的影响和ＥＲＫ信号通路在其中的调节作用。方法　将培养的ＨＬＥＣ分为两组:正常组和ＭｓｒＢ１基因沉默组,分别用０μｍｏｌ·Ｌ－１、１００μｍｏｌ·Ｌ－１、２００μｍｏｌ·Ｌ－１和３００μｍｏｌ·Ｌ－１ＯＮＯＯ－处理２０ｍｉｎ后,继续培养１２ｈ。用ＲＴ-ＰＣＲ法检测ＭｓｒＢ１基因表达水平变化,流式细胞仪检测细胞周期水平变化,Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ法检测ＭｓｒＢ１基因沉默和ＯＮＯＯ－对ｐＥＲＫ表达水平的影响。结果　３００μｍｏｌ·Ｌ－１ＯＮＯＯ－处理ＨＬＥＣ会导致ＭｓｒＢ１表达水平显著下降（Ｐ＜０．０１）,当ＭｓｒＢ１基因沉默细胞经３００μｍｏｌ·Ｌ－１ＯＮＯＯ－处理后,ＭｓｒＢ１表达水平进一步显著下调（Ｐ＜０．０５）。经２００μｍｏｌ·Ｌ－１或３００μｍｏｌ·Ｌ－１ ＯＮＯＯ－处理,ＨＬＥＣ细胞周期分别阻滞在Ｇ２／Ｍ期和Ｓ期,当ＭｓｒＢ１基因沉默细胞经２００μｍｏｌ·Ｌ－１或３００μｍｏｌ·Ｌ－１ＯＮＯＯ－处理后,更多的细胞阻滞在Ｇ２／Ｍ期或Ｓ期（Ｐ＜０．０５）。ｐＥＲＫ检测结果表明,ＭｓｒＢ１基因沉默前后经ＯＮＯＯ－处理导致的细胞周期阻滞和ｐＥＲＫ表达水平显著下降有关（Ｐ＜０．０１）。结论　ＯＮＯＯ－可以下调ＨＬＥＣＭｓｒＢ１表达水平,ＭｓｒＢ１基因沉默细胞经ＯＮＯＯ－处理,ｐＥＲＫ表达水平显著下降,导致更多细胞阻滞在Ｇ２／Ｍ期和Ｓ期。     

转化生长因子-β2（TGF-β2）诱导人视网膜色素上皮层细胞上皮-间质转分化中miRNA-29b的表达及意义

目的　探究转化生长因子-β２（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ-β２,ＴＧＦ-β２）诱导人视网膜色素上皮（ｒｅｔｉｎａｌｐｉｇｍｅｎｔｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ,ＲＰＥ）层细胞上皮-间质转分化中ｍｉＲＮＡ-２９ｂ的表达变化及意义。方法　使用不同浓度ＴＧＦ-β２刺激ＲＰＥ细胞上皮-间质转分化后,倒置相差显微镜观察细胞形态变化,Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ、ＲＴ-ＰＣＲ检测成纤维化相关分子纤维连接蛋白（ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｏｎ,ＦＮ）、神经钙粘连蛋白（ｎｅｒｖｅｃａｌｃｉｕｍａｄｈｅｓｉｏｎｐｒｏ-ｔｅｉｎ,Ｎ-Ｃａｄｈｅｒｉｎ）的表达。采用ＲＴ-ＰＣＲ检测不同浓度ＴＧＦ-β２及不同时间ＴＧＦ-β２（５μｇ·Ｌ－１）刺激ＲＰＥ细胞后ｍｉＲＮＡ-２９ｂ的表达。结果　ＴＧＦ-β２刺激后的ＲＰＥ细胞形态呈纤维化改变。在一定浓度范围内（１μｇ·Ｌ－１、５μｇ·Ｌ－１、１０μｇ·Ｌ－１）,随着ＴＧＦ-β２浓度的增加ＦＮ、Ｎ-Ｃａｄｈｅｒｉｎ及相应ｍＲＮＡ随之增加,１μｇ·Ｌ－１、５μｇ·Ｌ－１、１０μｇ·Ｌ－１组与对照组（０μｇ·Ｌ－１）相比,差异均有统计学意义（均为Ｐ＜０．０１）。ＴＧＦ-β２在一定浓度范围内（０μｇ·Ｌ－１、１μｇ·Ｌ－１、５μｇ·Ｌ－１）以剂量依赖的方式诱导ＲＰＥ细胞ｍｉＲＮＡ-２９ｂ表达的降低,１μｇ·Ｌ－１、５μｇ·Ｌ－１、１０μｇ·Ｌ－１组与对照组（０μｇ·Ｌ－１）相比,差异均有统计学意义（均为Ｐ＜０．０１）,在ＴＧＦ-β２浓度为５μｇ·Ｌ－１时ｍｉＲＮＡ-２９ｂ表达量最低。ＴＧＦ-β２在一定时间范围内（０ｈ、３ｈ、６ｈ、１２ｈ）以时间依赖的方式诱导ＲＰＥ细胞ｍｉＲＮＡ-２９ｂ表达的降低,３ｈ、６ｈ、１２ｈ、２４ｈ、４８ｈ组与０ｈ相比差异均有统计学意义（均为Ｐ＜０．０５）。结论　一定范围内ＴＧＦ-β２以剂量和时间依赖的方式诱导ＲＰＥ细胞ｍｉＲＮＡ-２９ｂ的表达,为进一步研究ｍｉＲＮＡ-２９ｂ与ＴＧＦ-β２在ＲＰＥ细胞上皮-间质转分化过程中的相互作用提供理论基础。     

缺氧、氧化应激对视网膜色素上皮细胞增殖及葡萄糖调节蛋白78表达的影响

目的　观察缺氧、氧化应激对体外培养的视网膜色素上皮（ｒｅｔｉｎａｌｐｉｇｍｅｎｔｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ,ＲＰＥ）细胞增殖的影响及ＧＲＰ７８表达的变化。方法　体外培养人ＲＰＥ细胞,采用ＣｏＣｌ２诱发细胞缺氧模型、Ｈ２Ｏ２诱发氧化应激模型。实验分为量-效关系组:细胞分别经浓度为１００μｍｏｌ?Ｌ－１、２００μｍｏｌ?Ｌ－１、４００μｍｏｌ?Ｌ－１、８００μｍｏｌ?Ｌ－１的ＣｏＣｌ２、Ｈ２Ｏ２作用１２ｈ,用ＭＴＴ法检测细胞增殖情况;时-效关系组:在ＣｏＣｌ２浓度为２００μｍｏｌ?Ｌ－１、Ｈ２Ｏ２浓度为４００μｍｏｌ?Ｌ－１的基础上,分别选取药物作用８ｈ、１２ｈ、１６ｈ３个时间点收集细胞,采用免疫细胞化学染色检测ＧＲＰ７８蛋白的表达情况。结果　量-效关系组:不同浓度ＣｏＣｌ２组ＲＰＥ细胞活性与空白对照组相比均明显下降（均为Ｐ＜０．０５）;４００μｍｏｌ?Ｌ－１及８００μｍｏｌ?Ｌ－１Ｈ２Ｏ２组细胞存活率较空白对照组均明显下降（均为Ｐ＜０．０５）。时-效关系组:空白对照组ＧＲＰ７８表达阳性细胞率为（５．４±３０）％;ＣｏＣｌ２作用８ｈ、１２ｈ、１６ｈＧＲＰ７８阳性细胞率分别为（３４２±７１）％、（５４．４±９．１）％、（３４．７±６．８）％;Ｈ２Ｏ２作用８ｈ、１２ｈ、１６ｈＧＲＰ７８阳性细胞率分别为（３７．８±７１）％、（５７．４±５．１）％、（４２．５±３．９）％。经统计学分析,ＣｏＣｌ２、Ｈ２Ｏ２处理８ｈ后,ＲＰＥ细胞中ＧＲＰ７８表达均较空白对照组明显升高（均为Ｐ＜００１）,作用１２ｈ时ＧＲＰ７８的表达量最高,作用１６ｈ时ＧＲＰ７８的表达量又有下降。结论　ＧＲＰ７８可以作为ＲＰＥ细胞缺氧、氧化应激的生化标志物,ＧＲＰ７８的表达变化与细胞应激状态有一定依赖关系。     

LY294002联合奥曲肽对bFGF诱导的兔晶状体上皮细胞增殖的影响

目的　探讨ＬＹ２９４００２联合奥曲肽对碱性成纤维细胞生长因子（ｂａｓｉｃｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ,ｂＦＧＦ）诱导的兔晶状体上皮细胞（ｌｅｎｓｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｓ,ＬＥＣｓ）增殖的影响。方法　兔眼ＬＥＣｓ经原代和传代培养后,共分为４组:空白对照组、增殖对照组、实验药物组、增殖药物组。空白对照组使用仅含无血清ＤＭＥＭ培养;增殖对照组使用加ｂＦＧＦ（１０ｍｇ·Ｌ－１）的无血清ＤＭＥＭ;实验药物组培养时在不加ｂＦＧＦ增殖的情况下分别单独应用１０－５ｍｏｌ·Ｌ－１ＬＹ２９４００２、单独应用１０－９ｍｏｌ·Ｌ－１奥曲肽和联合应用１０－５ｍｏｌ·Ｌ－１ＬＹ２９４００２与１０－９ｍｏｌ·Ｌ－１奥曲肽来培养;增殖药物组在加ｂＦＧＦ增殖的情况下分别单独应用１０－５ｍｏｌ·Ｌ－１ＬＹ２９４００２、单独应用１０－９ｍｏｌ·Ｌ－１奥曲肽和联合应用１０－５ｍｏｌ·Ｌ－１ＬＹ２９４００２和１０－９ｍｏｌ·Ｌ－１奥曲肽进行细胞培养,每组重复５次。各组分别培养４８ｈ。ＭＴＴ比色法测定吸光度（Ａ值）分析各组细胞的生长抑制率,流式细胞仪检测各周期细胞的百分率。结果　增殖对照组与空白对照组相比,吸光度Ａ值升高（Ｐ＜０．０５）;实验药物组中各组分别与空白对照组相比,吸光度Ａ值均有不同程度下降（均为Ｐ＜０．０５）;增殖药物组中各组分别与增殖对照组相比,吸光度Ａ值明显下降（均为Ｐ＜０．０５）;生长抑制率与吸光度Ａ值趋势相同。经流式细胞仪分析,实验药物组中联合用药组与两个单独用药组相比Ｇ０／Ｇ１期细胞比例增高,Ｓ期细胞比例降低（均为Ｐ＜０．０５）;增殖药物组中,联合用药组与两个单独用药组相比也出现Ｇ０／Ｇ１期细胞比例增高,Ｓ期细胞比例降低（均为Ｐ＜０．０５）。结论　ＬＹ２９４００２联合奥曲肽较单独用药对ＬＥＣｓ的增殖抑制作用更强。这为临床筛选药物防治后发性白内障提供依据。     

莱菔硫烷对链脲佐霉素诱导的大鼠糖尿病白内障的治疗作用

目的　探讨莱菔硫烷（Ｓｕｌｆｏｒａｐｈａｎｅ,ＳＦＮ）对链脲佐霉素诱导的大鼠糖尿病白内障的治疗作用。方法　将７２只雄性ＳＤ大鼠随机分为正常对照组、模型组、ＳＦＮ低剂量干预组、ＳＦＮ中剂量干预组、ＳＦＮ高剂量干预组和苄达赖氨酸（ｂｅｎｄａｚａｃｌｙ-ｓｉｎｅ,ＢＤＬ）组,每组１２只,后５组腹腔一次性注射链脲佐菌素（６５ｍｇ·ｋｇ－１）建立糖尿病白内障模型,从造模成功当日开始,ＳＦＮ低、中、高剂量干预组分别给予５０ｍｇ·ｋｇ－１、１００ｍｇ·ｋｇ－１、２００ｍｇ·ｋｇ－１ＳＦＮ灌胃,ＢＤＬ组以２００ｍｇ·ｋｇ－１ＢＤＬ灌胃,其余２组用同体积的生理盐水,每天１次,治疗１２周后,测定空腹血糖水平,裂隙灯观察大鼠晶状体变化并对其混浊度进行分级,分离晶状体并制备成匀浆液,测定丙二醛（ｍａｌｏｎｄｉａｌｄｅｈｙｄｅ,ＭＤＡ）含量及超氧化物歧化酶（ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅｄｉｓｍｕｔａｓｅ,ＳＯＤ）、谷胱甘肽过氧化物酶（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ-ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ,ＧＳＨ-Ｐｘ）、过氧化氢酶（ｃａｔａｌａｓｅ,ＣＡＴ）活性,ＥＬＩＳＡ检测糖基化终末产物（ａｄｖａｎｃｅｄｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎｅｎｄｐｒｏｄｕｃｔｓ,ＡＧＥｓ）含量,行Ｗｅｓｔｅｒｎ-ｂｌｏｔｔｉｎｇ检测醛糖还原酶（ａｌｄｏｓｅｒｅｄｕｃｔａｓｅ,ＡＲ）表达。结果　用药后１２周,ＳＦＮ中、高剂量干预组大鼠空腹血糖明显低于模型组（均为Ｐ＜０．０５）,而ＳＦＮ低剂量干预组、ＢＤＬ组仍处于高血糖水平,与模型组比较,差异均无统计学意义（均为Ｐ＞０．０５）。正常对照组大鼠晶状体透明,无混浊发生;而模型组大鼠晶状体出现雾状混浊、核混浊,分级为Ⅲ ～Ⅴ级,其混浊度显著高于正常对照组（Ｐ＜０．０１）。与模型组比较,ＳＦＮ中、高剂量干预组晶状体混浊度等级差异明显减轻（均为Ｐ＜０．０５）,而ＳＦＮ低剂量干预组、ＢＤＬ组晶状体混浊度等级与模型组相比,差异均无统计学意义（均为Ｐ＞０．０５）。与正常对照组比较,模型组大鼠晶状体组织中ＭＤＡ含量升高,而ＳＯＤ、ＧＳＨ-Ｐｘ、ＣＡＴ活性降低,差异均有统计学意义（均为Ｐ＜０．０１）。经中、高剂量ＳＦＮ或ＢＤＬ处理后,ＭＤＡ含量较模型组减少（均为Ｐ＜０．０５）,ＳＯＤ、ＧＳＨ-Ｐｘ、ＣＡＴ活性较模型组增加（均为Ｐ＜０．０５）。而ＳＦＮ低剂量干预组上述指标与模型组相比,差异均无统计学意义（均为Ｐ＞０．０５）。模型组大鼠晶状体组织中ＡＧＥｓ含量较正常对照组升高（Ｐ＜０．０１）;相对于模型组,经中、高剂量ＳＦＮ处理１２周后,ＡＧＥｓ含量明显减少（均为Ｐ＜０．０５）;而ＳＦＮ低剂量干预组、ＢＤＬ组ＡＧＥｓ含量与模型组比较,差异均无统计学意义（均为Ｐ＞０．０５）。运用Ｗｅｓｔｅｒｎ-ｂｌｏｔｔｉｎｇ检测各组大鼠晶状体组织ＡＲ蛋白表达,结果显示:正常对照组ＡＲ蛋白呈低水平表达,模型组ＡＲ蛋白表达明显上调,与正常对照组比较,差异有统计学意义（Ｐ＜０．０１）;相对于模型组,经中、高剂量ＳＦＮ或ＢＤＬ处理后,ＡＲ蛋白表达水平降低（均为Ｐ＜０．０５）,而ＳＦＮ低剂量干预组ＡＲ蛋白表达水平与模型组比较,差异无统计学意义（Ｐ＞０．０５）。结论　ＳＦＮ对链脲佐菌素诱导的大鼠糖尿病白内障有治疗作用,其机制可能与增强抗氧化能力、抑制ＡＧＥｓ产生及下调ＡＲ表达有关。     

两种缺氧模型对小鼠骨髓间充质干细胞中基质金属蛋白酶表达及其对促血管形成能力的影响

目的　观察物理和化学缺氧模型中小鼠骨髓间充质干细胞（ｂｏｎｅｍａｒｒｏｗ-ｄｅｒｉｖｅｄｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓ,ＢＭＳＣｓ）中基质金属蛋白酶１３（ｍａｔｒｉｘｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ-１３,ＭＭＰ-１３）的表达及其对猴脉络膜-视网膜内皮细胞ＲＦ／６Ａ管腔形成能力的影响。方法　取Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ小鼠骨髓,培养鉴定ＢＭＳＣｓ。采用三气培养箱模拟物理缺氧及氯化钴（ＣｏＣｌ２）诱导化学缺氧。物理缺氧６ｈ、１２ｈ、２４ｈ和４８ｈ后检测ＭＭＰ-１３表达。选表达最高的处理时间,检测不同浓度ＣｏＣｌ２（０μｍｏｌ·Ｌ－１、１００μｍｏｌ·Ｌ－１、２００μｍｏｌ·Ｌ－１、３００μｍｏｌ·Ｌ－１及４００μｍｏｌ·Ｌ－１）处理后ＭＭＰ-１３表达。检测缺氧后ＢＭＳＣｓ中缺氧诱导因子-１α（ｈｙｐｏｘｉａ-ｉｎｄｕｃｉｂｌｅｆａｃｔｏｒ-１α,ＨＩＦ-１α）表达及ＢＭＳＣｓ增殖能力,观察其条件培养基诱导的ＲＦ／６Ａ管腔形成情况。结果　细胞经鉴定符合ＢＭＳＣｓ特征。物理缺氧２４ｈ后,ＭＭＰ-１３蛋白表达量达高峰（３．１６±０．２４）,较常氧组（１．００±０．１２）增加３倍（Ｐ＜０．０１）。１００μｍｏｌ·Ｌ－１和２００μｍｏｌ·Ｌ－１ＣｏＣｌ２组（１．６０±０．０９、１．６４±０．２４）中ＭＭＰ-１３表达较常氧组（１．００±０．２０）均增加（均为Ｐ＜０．０５）,而３００μｍｏｌ·Ｌ－１和４００μｍｏｌ·Ｌ－１ＣｏＣｌ２组中ＭＭＰ-１３表达与常氧组相同或稍低。三气培养箱构建的和ＣｏＣｌ２诱导的缺氧环境下培养２４ｈ后,ＢＭＳＣｓ中ＨＩＦ-１α蛋白表达较常氧组（１．００±０．２３）明显增加,相对表达量分别为３．４０±０．２６和３．１２±０．１３（均为Ｐ＜０．０１）,而两种缺氧模型间无明显差异。在培养２４ｈ时,物理缺氧组（１．５３±０．０４）和化学缺氧组（１．３１±０．１４）均较常氧组（１．０４±０．１０）细胞增殖能力增强（均为Ｐ＜０．０５）,且物理缺氧促增殖效果更明显。三气培养箱模拟的物理缺氧组、ＣｏＣｌ２诱导的化学缺氧组和常氧组ＲＦ／６Ａ管腔形成总长度分别为（５５０６±３８０）μｍ、（５１０９±５５８）μｍ和（３１２０±３００）μｍ,三气培养箱模拟的物理缺氧组和ＣｏＣｌ２诱导的化学缺氧组较常氧组均明显增加（均为Ｐ＜０．０１）,而两种缺氧模型之间差异则无统计学意义（Ｐ＞０．０５）。结论　ＣｏＣｌ２和三气培养箱均可建立缺氧模型,促进ＢＭＳＣｓ表达ＭＭＰ-１３,提高其促血管形成能力,提示缺氧可能调控ＢＭＳＣｓ表达ＭＭＰｓ进而影响新生血管发生发展。     

同型半胱氨酸和视黄醇结合蛋白4与糖尿病视网膜病变的相关性研究

目的　检测并分析同型半胱氨酸（ｈｏｍｏｃｙｓｔｅｉｎｅ,Ｈｃｙ）及视黄醇结合蛋白４（ｒｅｔｉ-ｎｏｌｂｉｎｄｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ４,ＲＢＰ４）与糖尿病视网膜病变（ｄｉａｂｅｔｉｃｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ,ＤＲ）的关系,以探讨对特定人群ＤＲ的诊断方法。方法　选取２０１４年６月到２０１５年６月桂林医学院附属医院内分泌科就诊的２型糖尿病患者２００例,所有患者进行眼底检查必要时行眼底荧光血管造影（ｆｕｎｄｕｓｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎａｎｇｉｏｇｒａｐｈｙ,ＦＦＡ）,根据眼底情况分为增殖期糖尿病视网膜病变（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅｄｉａｂｅｔｉｃｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ,ＰＤＲ）组、非增殖期糖尿病视网膜病变（ｎｏｎ-ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅｄｉ-ａｂｅｔｉｃｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ,ＮＰＤＲ）组,以及非糖尿病视网膜病变（ｎｏｎ-ｄｉａｂｅｔｉｃｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ,ＮＤＲ）组;检测各组空腹血糖（ｆａｓｔｉｎｇｐｏｓｔｐｒａｎｄｉａｌｇｌｕｃｏｓｅ,ＦＰＧ）、餐后２ｈ血糖（２-ｈｏｕｒｐｏｓｔｐｒａｎｄｉａｌｇｌｕｃｏｓｅ,２ｈＰＧ）、糖化血红蛋白（ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ,ＨｂＡ１ｃ）、血脂、Ｈｃｙ、ＲＢＰ４水平。结果　ＰＤＲ组的Ｈｃｙ（１７．６０±４．４７）μｍｏｌ·Ｌ－１、ＲＢＰ４（１６．３２±３．５７）μｇ·ｍＬ－１及ＮＰＤＲ组的Ｈｃｙ（１３．０１±２．８０）μｍｏｌ·Ｌ－１、ＲＢＰ４（１２．２５±２．４５）μｇ·ｍＬ－１水平明显高于ＮＤＲ组的Ｈｃｙ（６．９９±２．３３）μｍｏｌ·Ｌ－１、ＲＢＰ４（８．８９±１．９０）μｇ·ｍＬ－１,且随着ＤＲ病情的进展逐渐升高,差异均有统计学意义（均为Ｐ＜０．０５）;ＰＤＲ组病程、２ｈＰＧ、ＨｂＡ１ｃ、ＴＧ、ＬＤＬ-Ｃ、Ｈｃｙ、ＲＢＰ４水平明显高于ＮＰＤＲ组、ＮＤＲ组（均为Ｐ＜０．０５）。相关分析显示,２型糖尿病患者的ＲＢＰ４与病程、年龄、ＨｂＡ１ｃ、ＦＰＧ、２ｈＰＧ、ＴＣ、ＴＧ、ＬＤＬ-Ｃ、Ｈｃｙ呈显著正相关,与ＨＤＬ-Ｃ呈负相关。对ＤＲ的危险因素进行多元回归分析结果显示,病程、ＨｂＡ１ｃ、ＲＢＰ４、Ｈｃｙ是影响ＤＲ的主要危险因素。结论　测定Ｈｃｙ及ＲＢＰ４可及早发现ＤＲ,为早期筛查及治疗提供一定的方向。     

Cyclophilin D在氧化应激下人视网膜色素上皮细胞中的表达

目的　检测氧化应激下人视网膜色素上皮（ｒｅｔｉｎａｌｐｉｇｍｅｎｔｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ,ＲＰＥ）细胞内ＣｙｃｌｏｐｈｉｌｉｎＤ的表达,初步探索ＲＰＥ细胞氧化损伤保护新靶点。方法　培养细胞系ＡＲＰＥ１９及人原代ＲＰＥ细胞,相差显微镜下观察细胞形态,应用激光共聚焦显微镜免疫荧光法鉴定细胞。不同浓度Ｈ２Ｏ２（０μｍｏｌ·Ｌ－１、１００μｍｏｌ·Ｌ－１、５００μｍｏｌ·Ｌ－１、１ｍｍｏｌ·Ｌ－１）处理细胞２４ｈ后,应用ＲＴ-ＰＣＲ检测ＣｙｃｌｏｐｈｉｌｉｎＤ在细胞内的表达。随后预先在部分细胞中加入３μｍｏｌ·Ｌ－１环孢素Ａ（ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎＡ,ＣｓＡ）处理３０ｍｉｎ后再加入不同浓度Ｈ２Ｏ２（８０μｍｏｌ·Ｌ－１、１６０μｍｏｌ·Ｌ－１、３２０μｍｏ·Ｌ－１）２ｈ,即ＣｓＡ＋Ｈ２Ｏ２组,应用乳酸脱氢酶（ｌａｃｔｉｃｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ,ＬＤＨ）法检测细胞致死率,并与Ｈ２Ｏ２组的ＬＤＨ释放量相比较。结果　培养的ＡＲＰＥ１９和人原代ＲＰＥ细胞均表达ＲＰＥ细胞特异性抗体ＲＰＥ６５。１００μｍｏｌ·Ｌ－１Ｈ２Ｏ２处理细胞２４ｈ后ＣｙｃｌｏｐｈｉｌｉｎＤ表达量明显升高,当Ｈ２Ｏ２浓度增加到５００μｍｏｌ·Ｌ－１时,ＣｙｃｌｏｐｈｉｌｉｎＤ表达量降低,１ｍｍｏｌ·Ｌ－１Ｈ２Ｏ２处理时,ＣｙｃｌｏｐｈｉｌｉｎＤ表达水平未见增加。在各Ｈ２Ｏ２ 组组间,ＬＤＨ的释放量随着Ｈ２Ｏ２ 浓度的升高而增加;与Ｈ２Ｏ２ 组相比,ＣｓＡ＋Ｈ２Ｏ２组ＬＤＨ的释放水平明显降低（Ｐ＜０．０５）。结论　氧化应激下ＲＰＥ细胞内ＣｙｃｌｏｐｈｉｌｉｎＤ的表达升高,该蛋白表达的增加可能进一步导致氧化应激下细胞的死亡,ＣｓＡ可能成为ＲＰＥ细胞保护的新策略。     

组织激肽释放酶在糖尿病视网膜病变患者血清中的变化及其调节血管新生机制

目的　检测组织激肽释放酶（ｔｉｓｓｕｅｋａｌｌｉｋｒｅｉｎ,ＴＫＬＫ）、血管内皮细胞生长因子（ｖａｓｃｕｌａｒｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ,ＶＥＧＦ）和可溶性细胞间黏附分子-１（ｓｏｌｕｂｌｅｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒａｄｈｅｎｓｉｏｎｍｏｌｅｃｕｌ-１,ｓＩＣＡＭ-１）在糖尿病视网膜病变（ｄｉａｂｅｔｉｃｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ,ＤＲ）患者血清中的变化,观察ＴＫＬＫ在低氧条件下对人视网膜微血管内皮细胞（ｈｕｍａｎｒｅｔｉｎａｌｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｓ,ＨＲＭＥＣｓ）中ＶＥＧＦ和ＩＣＡＭ-１表达的影响。方法　收集２型糖尿病患者６０例,按照ＤＲ分期标准将患者分为糖尿病无ＤＲ组（ＤＭ组）、非增生性ＤＲ组（ＮＰＤＲ组）和增生性ＤＲ组（ＰＤＲ组）,收集同期在本院体检的志愿者作为对照组,每组２０例。ＥＬＩＳＡ法检测血清中ＴＫＬＫ、ＶＥＧＦ和ｓＩＣＡＭ-１的水平。体外ＨＲＭＥＣｓ分别进行常氧和低氧培养,不同浓度重组ＴＫＬＫ处理后,检测细胞增殖、凋亡以及ＶＥＧＦ和ＩＣＡＭ-１的表达。结果　ＤＭ、ＮＰＤＲ和ＰＤＲ组患者血清中ＴＫＬＫ、ＶＥＧＦ和ｓＩＣＡＭ-１水平明显高于对照组,４组总体差异有统计学意义（Ｆ＝２８．８０５,Ｐ＝０．００２;Ｆ＝３２．０４１,Ｐ＝０．００２;Ｆ＝２６．１６９,Ｐ＝０．００１）;ＰＤＲ患者血清中ＴＫＬＫ、ＶＥＧＦ和ｓＩＣＡＭ-１水平显著高于ＤＭ和ＮＰＤＲ组（均为Ｐ＜０．００１）。ＴＫＬＫ与ＶＥＧＦ（ｒ＝０．６２３,Ｐ＜０．０１）和ｓＩＣＡＭ-１水平（ｒ＝０．５９８,Ｐ＜０．０１）均呈正相关。１０μｇ?ｍＬ－１ｒｈＴＫＬＫ可显著抑制低氧诱导的ＨＲＭＥＣｓ增殖以及ＶＥＧＦ和ＩＣＡＭ-１的表达,并可促进细胞凋亡（Ｐ＜０．０５）。结论　ＴＫＬＫ通过与ＶＥＧＦ和ＩＣＡＭ-１相互作用而影响ＤＲ的进展。     

JNK细胞通路在高压氧和过氧化氢诱导人晶状体上皮细胞凋亡中的作用

目的　研究ＪＮＫ细胞信号通路在高压氧（ｈｙｐｅｒｂａｒｉｃｏｘｙｇｅｎ,ＨＢＯ）和过氧化氢（ｈｙｄｒｏｇｅｎｐｅｒｏｘｉｄｅ,Ｈ２Ｏ２）影响晶状体上皮细胞活力和凋亡中的作用。方法　培养人晶状体上皮细胞系ＳＲＡ０１／０４,实验分为对照组、ＳＰ６００１２５组（２０μｍｏｌ?Ｌ－１）、ＨＢＯ组（体积分数９５％ Ｏ２＋体积分数５％ＣＯ２,６００Ｐａ）、ＨＢＯ＋ＳＰ６００１２５组、Ｈ２Ｏ２组（２００μｍｏｌ?Ｌ－１）和Ｈ２Ｏ２＋ＳＰ６００１２５组,处理６ｈ后收集细胞,应用ＭＴＴ法检测各组细胞活力,ＡｎｎｅｘｉｎＶ-ＦＩＴＣ凋亡试剂盒处理细胞后用流式细胞仪检测各组细胞的凋亡率,通过Ｗｅｓｔｅｒｎ-ｂｌｏｔ法检测各组细胞ＪＮＫ、ｐ-ＪＮＫ、ｃ-Ｊｕｎ、ｐ-ｃ-Ｊｕｎ、ｃａｓｐａｓｅ３、ｃａｓｐａｓｅ９的表达情况。结果　作用６ｈ后,ＨＢＯ和Ｈ２Ｏ２处理的晶状体上皮细胞Ａ５７０分别为０．４２３±０．０４７和０．４０６±０．０６９,较对照组的０．８２４±０．０６５明显下降（Ｐ＜０．０５）,细胞凋亡率为（１９．７７３±１．１４７）％和（２９．２０６±１．６７８）％,较对照组的（２．１８４±１．０１５）％明显上升（Ｐ＜０．０５）,ＳＰ６００１２５可部分抑制ＨＢＯ和Ｈ２Ｏ２对晶状体上皮细胞活力和凋亡的影响,ＨＢＯ和Ｈ２Ｏ２处理的晶状体上皮细胞ｐ-ＪＮＫ、ｐ-ｃ-Ｊｕｎ蛋白表达量及ｃａｓｐａｓｅ３、ｃａｓｐａｓｅ９蛋白表达量升高,Ｓｐ６００１２５可部分抑制高压氧和Ｈ２Ｏ２ 诱导的晶状体上皮细胞ｐ-ＪＮＫ、ｐ-ｃ-Ｊｕｎ、ｃａｓｐａｓｅ３、ｃａｓｐａｓｅ９蛋白高表达。结论　ＨＢＯ和Ｈ２Ｏ２可激活晶状体上皮细胞中ＪＮＫ细胞信号通路,促使细胞凋亡,提示ＪＮＫ细胞信号通路在ＨＢＯ和Ｈ２Ｏ２诱导晶状体上皮细胞凋亡的发生发展中起重要作用。     

中药提取物姜黄素对人视网膜神经胶质瘤细胞的放射增敏作用

目的　研究中药提取物姜黄素对人视网膜神经胶质瘤ＷＥＲＩ-Ｒｂ-１细胞的放射增敏作用。方法　采用Ｘ射线辐照仪辐照人视网膜神经胶质瘤ＷＥＲＩ-Ｒｂ-１细胞。ＣＣＫ-８细胞活性检测试剂盒检测０μｍｏｌ·Ｌ－１、１μｍｏｌ·Ｌ－１、５μｍｏｌ·Ｌ－１、１０μｍｏｌ·Ｌ－１、２０μｍｏｌ·Ｌ－１、３０μｍｏｌ·Ｌ－１姜黄素,０Ｇｙ、１Ｇｙ、２Ｇｙ、４Ｇｙ、８Ｇｙ射线以及姜黄素联合射线作用细胞不同时间对细胞活性的影响;流式细胞仪检测单独姜黄素、射线、姜黄素联合射线引起的细胞周期阻滞以及线粒体膜电位的变化情况;Ｈｏｃｈｅｓｔ３３２５８细胞核染色观察单独姜黄素、射线、姜黄素联合射线对细胞凋亡的影响。结果　０μｍｏｌ·Ｌ－１、１μｍｏｌ·Ｌ－１、５μｍｏｌ·Ｌ－１、１０μｍｏｌ·Ｌ－１、２０μｍｏｌ·Ｌ－１、３０μｍｏｌ·Ｌ－１姜黄素和单独的０Ｇｙ、１Ｇｙ、２Ｇｙ、４Ｇｙ、８Ｇｙ射线随剂量和时间增加均能引起细胞活性的下降;２Ｇｙ射线联合不同浓度的姜黄素（０μｍｏｌ·Ｌ－１、１μｍｏｌ·Ｌ－１、５μｍｏｌ·Ｌ－１、１０μｍｏｌ·Ｌ－１、２０μｍｏｌ·Ｌ－１、３０μｍｏｌ·Ｌ－１）相比单独的姜黄素可以引起细胞活性显著下降;１０μｍｏｌ·Ｌ－１姜黄素联合２Ｇｙ射线能够将细胞周期明显阻滞在Ｇ２／Ｍ期,阻滞率为（７９．６±２．１）％,并诱导细胞凋亡和线粒体膜电位下降为（４８．３±４．３）％。结论　姜黄素联合射线对人视网膜神经胶质瘤ＷＥＲＩ-Ｒｂ-１细胞具有显著的放射增敏作用,并诱导细胞凋亡和线粒体膜电位下降,为姜黄素的临床应用提供一定理论依据。     

d-δ-三烯生育酚对人晶状体上皮SRA细胞增殖和凋亡的影响

目的　研究ｄ－δ－三烯生育酚对人晶状体上皮ＳＲＡ细胞增殖和凋亡的影响,探讨后发性白内障治疗的新方法。方法　将人晶状体上皮ＳＲＡ细胞分为对照组和实验组,对照组不加药物干预,实验组设３个药物浓度,分别为３０μｍｏｌ?Ｌ－１、４０μｍｏｌ?Ｌ－１、５０μｍｏｌ?Ｌ－１的ｄ－δ－三烯生育酚,药物干预人晶状体上皮ＳＲＡ细胞２４ｈ和４８ｈ后,采用ＭＴＴ法、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８荧光染色和流式细胞仪分析人晶状体上皮ＳＲＡ细胞的增殖和凋亡情况。结果　ｄ－δ－三烯生育酚呈浓度－时间依赖性抑制人晶状体上皮ＳＲＡ细胞的增殖,诱导其凋亡。３０μｍｏｌ?Ｌ－１、４０μｍｏｌ?Ｌ－１、５０μｍｏｌ?Ｌ－１的ｄ－δ－三烯生育酚干预４８ｈ对ＳＲＡ细胞的增殖抑制率分别为（３２．２３±５．２５）％、（５４．１７±１．６３）％和（８６．８０±０．８５）％,与对照组比较差异均有统计学意义（均为Ｐ＜０．０５）;干预２４ｈ增殖抑制率分别为（１２．７０±１．２０）％、（１９．５３±０．９５）％和（５１．８３±６．１１）％,与对照组相比差异均有统计学意义（均为Ｐ＜０．０５）。干预２４ｈ后,各实验组细胞晚期凋亡率Ｑ２分别为（５．８７±０．１５）％、（１１．３７±０．８５）％、（２２．７７±２．４１）％,与对照组的（１．１０ ±０．１７）％相比,差异均有统计学意义（均为Ｐ＜０．０５）;各实验组细胞早期凋亡率Ｑ４分别为（３．５７±０．３２）％、（４．２０±０．４０）％、（８．００±０．５０）％,与对照组的（２．５３±０．１５）％相比,差异均有统计学意义（均为Ｐ＜０．０５）。结论　ｄ－δ－三烯生育酚抑制人晶状体上皮ＳＲＡ细胞增殖,诱导其凋亡,具有抗晶状体上皮细胞增殖的生物学作用,为治疗后发性白内障提供一种新思路。     

槲皮素磷脂复合物激活Nrf2信号通道增强对氧化损伤ARPE-19细胞的保护作用

目的　研究槲皮素磷脂复合物对叔丁基氢过氧化物（ｔｅｒｔ-ｂｕｔｙｌｈｙｄｒｏｐｅｒｏｘｉｄｅ,ｔ-ＢＨＰ）诱导ＡＲＰＥ-１９细胞氧化损伤的保护作用及相关机制。方法　采用溶剂法制备槲皮素磷脂复合物,并测定磷脂复合物在水和氯仿中的溶解度。实验细胞分组:溶媒对照组、模型对照组、槲皮素及其磷脂复合物组（含４００μｍｏｌ·Ｌ－１、２００μｍｏｌ·Ｌ－１和１００μｍｏｌ·Ｌ－１三个浓度）。ＭＴＴ法检测细胞活力,ＡｎｎｅｘｉｎＶ-ＦＩＴＣ／ＰＩ法检测细胞凋亡,酶标仪检测细胞内超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶活性及丙二醛、总抗氧化能力水平,荧光素ＤＣＦＨ-ＤＡ探针法测定细胞内活性氧含量,ＲｅａｌｔｉｍｅＰＣＲ、ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ检测细胞核因子Ｅ２相关因子２（ｎｕｃｌｅａｒｆａｃｔｏｒｅｒｙｔｈｒｏｉｄ２-ｒｅｌａｔｅｄｆａｃｔｏｒ２,Ｎｒｆ２）、血红素加氧酶-１、醌氧化还原酶-１和谷氨酸半胱氨酸连接酶的表达水平。结果　形成磷脂复合物后槲皮素在水和氯仿中的溶解度分别为（３８．３６±２．９１）μｇ·ｍＬ－１、（１３５１．２７±２８．１２）μｇ·ｍＬ－１,较单体显著提高;浓度为４００μｍｏｌ·Ｌ－１、２００μｍｏｌ·Ｌ－１和１００μｍｏｌ·Ｌ－１的槲皮素及其磷脂复合物对氧化损伤ＡＲＰＥ-１９细胞有保护作用,而且高、中浓度的槲皮素磷脂复合物的作用优于单体;浓度为２００μｍｏｌ·Ｌ－１的槲皮素及其磷脂复合物均能降低氧化损伤ＡＲＰＥ-１９细胞的凋亡率,槲皮素磷脂复合物作用明显优于单体;槲皮素磷脂复合物能显著提高细胞内超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶活性,降低细胞内活性氧、丙二醛水平,槲皮素单体则不能,但槲皮素及其磷脂复合物能提高细胞内总抗氧化能力;槲皮素及其磷脂复合物能诱导Ｎｒｆ２核转位,激活Ｎｒｆ２通道,上调血红素加氧酶-１、醌氧化还原酶-１和谷氨酸半胱氨酸连接酶的表达。结论　槲皮素形成磷脂复合物后,水溶性、脂溶性提高,对氧化损伤ＡＲＰＥ-１９细胞的保护作用比单体强,其作用机制与激活Ｎｒｆ２信号通路,上调下游Ⅱ相代谢酶和抗氧化酶的表达有关。     

碱性成纤维细胞生长因子对人晶状体上皮细胞增殖及移行作用的影响

目的 探讨碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）对体外培养的人晶状体上皮细胞（HLEC）增殖及移行作用的影响.方法 在无血清培养液培养的HLEC中分别加入不同终浓度的bFCF（0.01、0.1、1、10及100 μg/L）,MTT法测定其促细胞增殖的情况;流式细胞仪分析细胞周期;HLEC损伤愈合模型,观察不同终浓度bFGF处理24 h后HLEC的移行情况.结果 bFGF浓度为0.1、1、10、100 μg/L时,其对HLEC细胞有明显的促增殖作用,与阴性对照组比较差异具有统计学意义（P〈0.01）,100 μg/L作用24 h增殖率最大,达112.78%,作用强度呈浓度时间依赖性.bFGF通过促进细胞周期变化,与阴性对照组比较差异具有统计学意义（P〈0.01）,G0/G1期细胞减少,S期和G2/M期细胞增多,通过促进HLEC由G0向G1的转化来促进细胞的增殖;bFGF浓度1、10、100 μg/L作用24 h.可明显促进HLEC的移行,其移行能力分别为27.21%、154.42%、和238.77%,与阴性对照组相比,差异有显著统计学意义（P〈0.01）.结论 bFGF可促进HLEC的增殖和移行,是HLEC强有力的有丝分裂原和促移行因子.     

整合素β1介导的ERK/MAPK通道在人晶状体上皮细胞转分化中的作用

目的研究转化生长因子-β2(transforming growth factor β2,TGF-β2)对培养的人氉晶状体上皮细胞(human lens epithelial cells,HLEC)整合素β1、磷酸化ERK(pERK)及F-actin表达的影响,探讨整合素β1介导的ERK/MAPK通路在HLEC转分化中的作用。方法体外培养的HLEC,加入不同浓度(0ng·L-1和10ng·L-1、33ng·L-1、100ng·L-1、333ng·L-1、1000ng·L-1)的TGF-β2处理不同时间(12h、24h、48h、72h),采用MTT法测定TGF-β2对HLEC增殖的影响,并确定最佳干涉浓度和时间用于后续实验。实验分2组,实验组用含最佳干涉浓度TGF-β2的培养基培养HLEC,对照组使用无血清培养基培养,于最佳干涉时间对2组细胞行免疫细胞化学染色检测HLEC中整合素β1、pERK及F-actin的表达,RT-PCR检测整合素β1、pERK及F-actin mRNA的表达。结果 TGF-β2抑制HLEC的增殖,呈浓度和时间依赖性,TGF-β2的最佳干涉终浓度为100ng·L-1,作用48h后达到最大抑制效果。TGF-β2增加HLEC整合素β1、pERK及F-actin的表达,相对表达量分别为0.116±0.031、0.123±0.028、0.140±0.033,均较对照组(0.045±0.011、0.025±0.009、0.079±0.024)明显升高(均为P<0.01)。RT-PCR结果显示,TGF-β2明显促进整合素β1mR-NA、pERK mRNA及F-actin mRNA的表达,相对表达量分别为0.658±0.146、0.582±0.171、0.760±0.193,较对照组(0.246±0.051、0.338±0.092、0.138±0.027)明显升高(均为P<0.01)。结论 TGF-β2抑制了HLEC的增殖,促进整合素β1、pERK及F-actin的表达,整合素β1介导的ERK/MAPK信号通路可能参与了HLEC转分化过程,导致后囊膜混浊。     

bFGF诱导人晶状体上皮细胞增殖过程中细胞外信号调节激酶的作用

目的:检测细胞外信号调节激酶(extracellular regulated kinase,ERK)在碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)诱导的人晶状体上皮细胞增殖过程中的表达与活化;检测ERK1/2特异性阻断剂PD98059对人晶状体上皮细胞增殖的影响。方法:人晶状体上皮细胞系SRA01/04体外培养,采用MTT比色法和[3H]-TdR掺入法检测ERK阻断剂PD98059对人晶状体上皮细胞活力和DNA合成的影响;Westernblot法测定bFGF对培养的人晶状体上皮细胞ERK,c-Jun氨基末端激酶(JNK),P38蛋白表达及PD98059对环氧合酶-2(COX-2)表达的影响。结果:10μg/LbFGF能显著刺激人晶状体上皮细胞增生,1μmol/LPD98059即能显著抑制bFGF启动的HLEC增殖,其效应呈浓度依赖性(P<0.01)。10μg/LbFGF可激活ERK信号通路,诱导COX-2蛋白表达,其效应在30min内达到高峰,6h后逐渐减弱,此作用可被10μmol/LPD98059阻断;10μg/LbFGF对非磷酸化ERK,磷酸化和非磷酸化JNK及P38表达无明显影响。结论:有丝分裂原活性蛋白激酶信号传导通路中ERK磷酸化对bFGF启动的人晶状体上皮细胞增殖具有重要的调节作用。