米非司酮对培养的人眼小梁细胞外纤维连接蛋白表达的影响

目的　探讨糖皮质激素受体拮抗剂米非司酮对培养的人眼小梁细胞外纤维连接蛋白(fibronectin ,FN)表达的影响。方法　按组织块培养法进行人眼 (8只眼 )小梁细胞体外培养 ,在传 3代的小梁细胞培养液中分别先后加入不同浓度的地塞米松和米非司酮 ,应用免疫组织化学联合计算机图像分析的方法 ,检测细胞外染色区域的吸光度 (A值 )。结果　根据培养细胞的生长特性和形态特征及细胞外基质染色特点等 ,确定培养的细胞为人眼小梁细胞。含有不同浓度地塞米松和米非司酮的小梁细胞培养组与对照组比较 ,FN变化所对应的A值排列顺序为 :1 0 - 6 mol/L地塞米松 (1 2d) >1 0 - 7mol/L地塞米松 (1 2d) >1 0 - 7mol/L地塞米松 (5d) >对照组≈ 1 0 - 7mol/L地塞米松 (5d) +1 0 - 8mol/L米非司酮 (7d)。结论　地塞米松能促进体外培养的人眼小梁细胞分泌与合成FN(A值升高 ) ,米非司酮可在受体水平拮抗并逐步逆转地塞米松引起的小梁细胞外FN的过度表达 (A值下降 )。糖皮质激素受体 (glucocorticoidrecepter,GR)拮抗剂米非司酮的降眼压作用尚有待在体内环境得到证实     

压力对牛眼小梁细胞增殖和凋亡的影响

目的：探讨压力对牛眼小梁细胞的增殖周期及凋亡相关基因bcl-2和bax mRNA表达的影响。方法：体外培养牛眼小梁细胞。按照施加压力的大小分为实验组和对照组,对照组不施加压力,实验组分别给予20、40、60及80mm Hg(1mm Hg=0.133kPa）的压力,培养时间分别为24及48h。通过末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记法、流式细胞仪和原位杂交技术,检测不同压力和持续时间下小梁细胞的增殖和凋亡指数,及在此条件下凋亡相关基因bcl-2和bax mRNA的表达。结果：≤40mm Hg的压力持续24h,小梁细胞凋亡率与对照组比较差异无显著意义（P＞0．05）;≥60mm Hg的压力使小梁细胞凋亡率显著增高。40mm Hg的压力持续24h后,细胞的凋亡指数虽未显著增高,但增殖指数已显著下降,bax基因表达有明显改变。≥40mmHg的压力持续48h后,细胞的凋亡率、增殖指数及bcl-2家庭基因表达量与对照组相比,差异均有显著意义（（均P＜0．01）。结论：≥40mm Hg的压力持续一段时间后,可通过影响bcl-2家族基因抑制小梁细胞的增殖并导致细胞凋亡。     

地塞米松诱导牛眼小梁细胞凋亡的研究

目的：探讨地塞米松诱导牛眼小梁细胞凋亡的机制。方法：采取体外组织块培养法,培养新生牛眼小梁细胞。将1－500mg/L地塞米松加入融合的第3－5代小梁细胞培养液中,作用1－14d,用相差显微镜、荧光显微镜、透射电子显微镜、DNA电泳及流式细胞仪检测细胞凋亡情况。结果：125－500mg/L地塞米松作用1－14d,小梁细胞凋亡呈浓度时间依赖性。 凋亡的小梁细胞经Hoechst3258染色,于荧光显微镜下观察,细胞核呈致密度浓染的颗粒块状荧光;透射电镜下可见小梁细胞染色质固缩,并有凋亡小体,细胞器基本完好;DNA电泳呈梯状条带,流式细胞仪测到亚二倍体峰。结论：地塞米松可诱导体外培养的小梁细胞凋亡,可能是激素性青光眼的发病机制之一。     

地塞米松诱导的人小梁网基因表达谱变化及生物信息学分析

目的:通过生物信息学方法分析地塞米松诱导的人小梁网基因表达谱变化,揭示激素性青光眼(GIG)发病过程中可能涉及的机制。方法:从公共基因芯片数据库(GEO)获取基因表达数据集GSE37474,GEO2R筛选地塞米松组和正常小梁网之间的差异表达基因。使用DAVID数据库对差异基因进行GO功能注释和KEGG通路富集分析,使用STRING数据库和Cytoscape软件构建蛋白相互作用网络(PPI),利用CytoHubba插件筛选关键枢纽基因,最后对关键枢纽基因的mRNA表达进行RT-PCR验证。结果:与正常小梁网组织相比,地塞米松处理的小梁网组织有252个基因存在差异表达,其中141个为上调基因,111个为下调基因。GO功能注释显示差异基因主要定位于细胞外基质,参与炎症的正调控和细胞外基质重塑等生物学过程。KEGG通路富集分析显示差异基因主要参与血管平滑肌收缩、花生四烯酸代谢、醚脂质代谢和胆碱代谢。从PPI网络中筛选出7个关键枢纽基因,包括3个上调基因EDN1、FOS、LPL和4个下调基因CCL2、IGF1、PTGS2、CCL5,RT-PCR验证结果和基因表达谱芯片一致。结论:地塞米松可引起小梁网基因表达谱发生显著变化,差异基因富集到的通路及筛选到的一些关键枢纽基因在细胞外基质重塑和房水流出调控中起着重要作用,这将有助于更全面地认识GIG的分子机制。     

视网膜色素上皮细胞凋亡中bax和bcl-2的表达

目的 探讨视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)细胞凋亡的分子机制。 方法 将柔红霉素加入培养的人RPE细胞培养液中(终浓度为180μg/L)作用12小时,撤药后继续培养24小时。通过光镜观察、酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测和末端脱氧核苷酸转移酶介导的生物素化脱氧尿苷三磷酸末端标记(terminal deoxynucleotidyl transferase mediated biotin-dUTP nick end labelling,TUNEL)染色观测细胞凋亡状态。同时行bax和bcl-2免疫细胞化学染色和定量分析。 结果 柔红霉素作用后,部分细胞皱缩、核浆比例增大;TUNEL染色显示散在的阳性细胞;ELISA检测结果表明培养细胞中凋亡细胞比例随药物剂量增加而增大。与正常对照组相比,bax表达的积分光密度由69.4±6.3升至84.7±6.1(P<0.05);对照组和实验组细胞bcl-2染色的积分光密度分别为34.4±3.7和31.0±6.6(P>0.05)。 结论 在柔红霉素引发的人RPE细胞凋亡过程中,bax表达增强,bcl-2/bax 相对比率降低,提示bax和bcl-2在RPE细胞凋亡的调控中具有一定作用。 (中华眼底病杂志, 1999, 15: 153-156)     

地塞米松对小梁细胞生长周期的影响

目的：探讨地塞米松对小梁细胞生长周期的影响。方法：按常规方法培养人眼小梁细胞,然后分为二组：常规DMEM培养液及含10^-7M地塞米松的DMEM培养液组,培养3d、5d、7d后,应用流式细胞仪检测细胞周期各阶段G1、S、G2期情况。结果：在正常未用地塞米松处理组,G2期细胞为2．0％;地塞米松处理3、5、7d后,G2期细胞比例各为8．0％、16．3％、19．87％,其差异有显著性意义。结论：地塞米松可使小梁细胞生长周期中G2期的比例增加,提示这种作用可能与激素性青光眼的发病 有关。     

表皮生长因子对牛眼小梁细胞c—fos基因表达的诱导

目的研究表皮生长因子（ｅｐｉｄｅｒｍａｌｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ，ＥＧＦ）对小梁细胞的作用。方法应用分子杂交技术研究ＥＧＦ对体外培养的牛眼小梁细胞ｃ－ｆｏｓ基因表达的诱导和３Ｈ胸腺核苷酸（３Ｈ－ｔｈｙｍｉｄｉｎｅｉｎｃｏｒｐａｒａｔｉｏｎ，３Ｈ－ＴｄＲ）掺入法观察细胞ＤＮＡ的合成。结果小梁细胞的３Ｈ－ＴｄＲ掺入率随着ＥＧＦ浓度不同而变化，浓度为２０～１５０ｎｇ／ｍｌ时，细胞掺入率随浓度增加升高（Ｐ＜０．０１）。与对照组相比，ＥＧＦ刺激停止生长的小梁细胞０．５小时后，ｃ－ｆｏｓ基因开始表达，１小时后达高峰，至２小时后消失。不同浓度ＥＧＦ刺激小梁细胞１小时后，ｃ－ｆｏｓ基因表达呈浓度依赖性。结论实验结果表明ＥＧＦ刺激小梁细胞增殖或进入生长状态，可能与ｃ－ｆｏｓ基因产物的信号传递作用有关。     

转染Zn2+诱导表达反义bcl-2基因对人视网膜色素上皮细胞的影响

目的:观察转染Zn2 诱导表达的反义bcl-2 基因对人视网膜色素上皮(RPE)细胞的影响。方法:培养的正常RPE细胞与转染反义bcl-2 RPE细胞采用免疫组化,克隆形成试验、MTT,流式细胞仪,TUNEL分别予以观察。结果:转染后RPE细胞细胞骨架角蛋白表达阳性;硫酸锌诱导表达的安全剂量为160μmol/L;诱导表达反义bcl-2 RPE大部分细胞bcl-2 表达为阴性,部分弱阳性;在第10d细胞克隆形成率分别为(4.65±0.043)%与(4.85±0.085)%(P >0.05),诱导表达反义bcl-2 的RPE生长曲线在5d后表现为低增生率(P <0.01);柔红霉素作用后G2期细胞由9.9%增加至30.4%;180μg/L柔红霉素作用反义bcl-2转染组TUNEL阳性细胞可见典型凋亡小体。结论:转染可诱导表达的bcl-2 基因的RPE细胞可以进行细胞凋亡的后续研究。     

人眼小梁细胞体外滤膜培养及其通透阻力测定

目的:建立人眼小梁细胞体外滤膜培养体系及通透阻力测定的模型。方法:将永生化的人眼小梁细胞株用酶消化法传代于细胞培养池的PET膜上,观察细胞的生长情况,同时分别在细胞融合后3、5d和1、2周,应用内皮细胞电阻测量仪(EVOM)测定滤膜上单层小梁细胞电阻,客观评价其通透阻力。结果:人眼小梁细胞在滤膜上生长良好,单层融合后3、5d和1、2周的平均电阻分别为(36.4±1.4)Ω、(35.0±1.7)Ω、(36.1±2.9)Ω、(39.3±3.0)Ω,各时间点无显著统计学差异(P=0.305)。结论:人眼小梁细胞滤膜上培养单层融合后,在不同时间段其阻力基本稳定。滤膜培养体系及应用EVOM对其通透阻力的测定可作为今后对小梁细胞特性研究的一个新的较好模型。     

糖视明胶囊对糖尿病大鼠视网膜神经细胞凋亡及bcl-2、bax、caspase-3表达的影响

目的 研究糖视明胶囊对糖尿病视网膜病变(DR)神经细胞凋亡的影响.方法 将雄性SD大鼠随机分为阴性对照组、模型对照组、糖视明组,采用链脲佐菌素腹腔注射的方法制作大鼠DR模型,末端脱氧核糖核酸介导生物素化脱氧尿嘧啶缺口末端标记法(TUNEL)标记大鼠视网膜凋亡细胞,免疫组织化学SABC法测定bcl-2、bax以及caspase-3的基因表达.结果 与阴性对照组比较,模型对照组大鼠视网膜神经细胞凋亡数、caspase-3和bax阳性细胞数显著增加,bcl-2/bax明显下降,糖视明组能明显降低视网膜神经细胞凋亡数、caspase-3和bax阳性细胞数,提高bcl-2阳性细胞数与bcl-2/bax的比值,与模型对照组比较差异有统计学意义.结论 糖视明可通过对caspase和bcl-2两大家族的调节抑制细胞凋亡,从而减轻早期DR的程度.     

地塞米松及Lat—A对人眼小梁细胞蛋白质表达的影响

目的探讨地塞米松（Dex）及latrunculin—A（Lat-A）处理后人眼小梁细胞蛋白质表达的变化。方法正常供体人眼小梁细胞培养后用Dex及Lat—A处理,经二维凝胶电泳分离小梁细胞蛋白质,分析凝胶电泳图谱,选取部分差异凝胶斑点并采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（MALDI—TOFMS）鉴定蛋白质。结果采用24cm IPG胶条获得正常人眼小梁细胞对照组、Dex组、Dex＋Lat—A组以及Lat—A组的二维电泳凝胶图谱,得出不同培养条件下人眼小梁细胞蛋白质表达的差异。应用GDPi MALDI—TOFMS得出不同培养条件下差异表达的蛋白质斑点并成功鉴定出其中的24种蛋白质,主要包括细胞骨架相关的蛋白、热休克蛋白、氧化还原相关的蛋白和糖代谢相关的蛋白4类蛋白质。ADLH和Rab蛋白在Lat—A组的人小梁细胞中表达增加,但在Dex组表达减少,而热休克蛋白27（HSP27）和人CRMP2呈现相反的结果。结论成功建立Dex及Lat—A诱导人眼小梁细胞蛋白质表达图谱。Dex及Lat—A能诱导人眼小梁细胞的蛋白质表达变化,可能与青光眼致病的分子机制相关。     

可溶性CD44分子对人眼小梁网细胞凋亡调节蛋白bcl-2相关死亡因子bad表达的影响

背景 研究表明可溶性CD44分子(sCD44)在原发性开角型青光眼(POAG)患者眼中的质量浓度高于正常人,POAG患者房水中sCD44水平与小梁网细胞凋亡相关蛋白的表达是否有关及其对POAG的共同作用机制至今尚不明确. 目的 探讨不同质量浓度的sCD44对POAG患者小梁网细胞凋亡调节蛋白bcl-2相关死亡因子bad表达的影响.方法 收集POAG患者行小梁切除术中切除的小梁网组织,采用组织块培养法原代培养小梁网细胞,并用免疫细胞化学法对培养细胞进行鉴定,将第3代的小梁网细胞按随机数字表法随机分为6个组,分别在无血清培养基中加入含终质量浓度为0(对照组)、1、5、10、25、50 μg/L的sCD44,培养细胞48 h.采用细胞计数试剂8(CCK-8)法和ELISA法检测小梁网细胞中凋亡调节蛋白bc1-2相关死亡因子bad蛋白的表达.结果 培养的细胞经层黏连蛋白(LM)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)单克隆抗体、纤维连接蛋白(FN)免疫组织化学染色呈阳性反应.CCK-8法检测0、l、5、10、25、50μg/L sCD44作用48 h后小梁网细胞吸光度(A450)值分别为:0.2460±0.0019、0.1874±0.0015、0.1570±0.0016、0.1302±0.0019、0.1084±0.0018、0.0940±0.0020,差异有统计学意义(F=14.922,P=0.000),各实验组A450值均低于对照组,差异均有统计学意义(P=0.013、0.008、0.011、0.005、0.004).ELISA法检测表明,0、l、5、10、25、50 μg/LsCD44作用48 h后小梁网细胞中bad蛋白质量浓度分别为(114.8461±2.9560)、(137.8270±2.4259)、(161.4194±3.7381)、(170.9453±3.2006)、(221.2252±4.3738)、(324.6167±4.4220) ng/L,差异有统计学意义(F=16.610,P=0.000),各实验组小梁网细胞中bad蛋白质量浓度均明显高于对照组,差异均有统计学意义(P=0.017、0.013、0.008、0.007、0.006).结论 sCD44在一定质量浓度范围内可促进POAG小梁网细胞的凋亡,并且能上调凋亡调节蛋白bcl-2相关死亡因子bad蛋白的表达.     

cDNA microarray analysis of gene expression changes induced by dexamethasone in cultured human trabecular meshwork cells

PURPOSE: To profile gene expression changes induced by dexamethasone in cultured human trabecular meshwork (TM) cells and identify genes related to the occurrence of steroid-induced glaucoma. METHODS: At confluence, dexamethasone (final concentration 10(-7) M in 0.1% ethanol) or vehicle alone (control, 0.1% ethanol) was applied to cultured human TM cells from eyes of four normal subjects. After 7 days of application, a labeled cDNA probe was synthesized from extracted total RNA and hybridized to a human cDNA microarray containing 2400 genes. After hybridization, the tyramide signal was amplified, and the fluorescent signals on each microarray were scanned and analyzed. RESULTS: In dexamethasone-treated TM cells, simultaneous analysis of 2400 human genes indicated a more than twofold increase in 30 genes. Five of them, myocilin (MYOC), decorin, insulin-like growth factor binding protein 2, ferritin L chain, and fibulin-1C, were the most upregulated genes with higher-than-control expression levels in all four experiments. Their upregulation was further confirmed by semiquantitative RT-PCR. Downregulation, with fluorescent signals decreased to less than a half, was found in 34 genes. The dexamethasone-induced expression changes in most of these TM cell genes have not been reported previously. CONCLUSIONS: cDNA microarray is a useful tool for gene expression analysis that confirms previous reports of upregulated mRNA expression of MYOC after treatment with dexamethasone in human TM cells. Changes in other genes subsequent to the treatment with dexamethasone may also reduce outflow facility, providing new insights into the pathogenesis of steroid-induced glaucoma.     

地塞米松对永生化人眼小梁细胞流畅阻力和水通道蛋白-1表达的影响

目的探讨地塞米松对永生化人眼小梁细胞的流畅阻力和水通道蛋白-1(AQP-1)表达的影响。方法将永生化人眼小梁细胞株第18代接种于0.4μm孔径的滤膜上,待细胞近融合时加入含10-7mol/L地塞米松培养液。细胞融合后1、3、7d,应用内皮细胞电阻测量仪(EVOM)测定滤膜上单层小梁细胞电阻(TEER),评价其流畅阻力的变化;采用免疫印迹法检测小梁细胞AQP-1的表达情况。结果细胞融合后1、3、7d时,对照组TEER分别为(36.4±1.4)Ω、(34.0±1.7)Ω、(36.1±2.9)Ω,而经地塞米松处理组TEER则分别为(48.4±2.3)Ω、(60.3±3.1)Ω、(58.8±0.9)Ω,差异有统计学意义。用免疫印迹法检测,显示经地塞米松处理后的小梁细胞AQP-1表达量较未经处理组增多,差异亦有统计学意义。结论经地塞米松处理后的滤膜上小梁细胞AQP-1表达水平上调、表达量增多,小梁细胞TEER也升高,提示地塞米松上调AQP-1的表达水平可能与小梁细胞的流畅阻力改变有关。应用EVOM检测TEER可以体现内壁单层小梁细胞的流畅阻力,将为房水引流的研究提供新手段。(中华眼科杂志,2005,41:209-211)     

增殖细胞核抗原与bcl-2在培养的人视网膜色素上皮细胞的表达

目的观察培养的人视网膜色素上皮细胞（retinal pigment epithelial cells，RPE）的增殖细胞核抗原（proliferative cell nuclear　antigen，PCNA）和 bc1-2的表达。方法用SABC法对培养的人RPE作鼠抗人PCNA单抗及兔抗人bcl-2抗体免疫组织化学染色。结果RPE在接种后24小时和48小时，PCNA的阳性率分别为31.2%和50.6%，阳性染色位于细胞核内，斑块状。bcl-2的表达为76%～90%，阳性染色在细胞浆，细颗粒状。结论培养中一半RPE有PCNA抗原表达，提示这些细胞处于S期；bcl-2抗原在大多数RPE表达阳性。这些生物标记物可能与培养的RPE生长活性有关。(中华眼底病杂志,1998,14:26-28)     

The Effect of Dexamethasone on Integrin and Laminin Expression in Cultured Human Trabecular Meshwork Cells

Glucocorticoid treatment in vivo can produce a glaucoma similar in many ways to POAG. Treatment of trabecular meshwork cells in culture with dexamethasone allows the study of biochemical aspects of this disease process. The effects of dexamethasone on the expression of integrins and laminin in both normal and glaucomatous cultured human trabecular meshwork cells were evaluated. Human trabecular meshwork cell lines were cultured for 18 days in the presence or absence of 10⁻⁷mdexamethasone. Radioimmunoprecipitation was used to determine the relative expression of five αintegrin subunits. Laminin expression was evaluated with Western blots. Laminin was increased in all cell lines following dexamethasone treatment. α2, α5 and αV integrin chains showed consistent dexamethasone-induced changes in expression, while α3 and α4 subunits did not. There were no differences in the expression patterns for any of these integrin subunits between normal and glaucomatous cell lines. Increased laminin deposition as seen in this study with dexamethasone treatment may be partially responsible for the decreased outflow facility seen in both steroid-induced glaucoma and in POAG.     

地塞米松体外抑制人眼小梁细胞生长及表皮生长因子mRNA的表达

目的 探讨地塞米松对培养的人眼小梁细胞生长的影响及抑制小梁细胞表达表皮生长因子（epidermal growth factor EGF)mRNA的情况。方法 取人眼小梁组织进行小梁细胞体外培养,对传3代的小梁细胞进行地塞米松处理实验。实验组在传代后的培养液中按300ug/ml加入地塞米松,另一组作为对照组进行常规培养,观察生长5d后的细胞情况,取培养7d的两组的小梁细胞分别提取RNA,用EGFcDNA探针,a-^32P同位素标记进行斑点杂交,放射自显影。对显影片用计算机激光密度扫描,测定吸光度A值相对值进行组间比较。结果 加入地塞米松300ug/ml实验组,小梁细胞生长明显受到抑制,5d时对照组细胞已经融合,地塞米松组的细胞仍呈集落状态。从对照组小梁细胞提取RNA22.5ug,地塞米松组提取RNA 14ug,取14ug两组等量RNA,用EGFcNDA探针进行斑点杂交。结果阳性。激光密度扫描值地塞米松明显低于对照组。结论 地塞米松对培养的人眼小梁细胞有明显的生长抑制作用,通过抑制总RNA转录及EGFmRNA表达而抑制小梁细胞生长。提示糖皮质激素性青光眼是因抑制了小梁细胞的多种代谢和生理功能所致。     

Molecular cloning of the bovine MYOC and induction of its expression in trabecular meshwork cells

PURPOSE: Myocilin gene (MYOC) was identified as one of the disease-causing genes of primary open-angle glaucoma. This study was conducted to establish a system for the investigation of the biological role of MYOC in vitro by using bovine eyes, which are easy to obtain and have been widely used to examine the aqueous outflow system. The cDNA sequence of the bovine MYOC was determined and its expression in bovine eyes was examined with a quantitative polymerase chain reaction (PCR) assay. METHODS: Bovine MYOC cDNA was obtained from cultured bovine trabecular meshwork cells, and part of its sequence was determined using a primer pair designed based on the known sequence of the human MYOC gene. The 3' and 5' ends of this sequence were determined using the method of 3' and 5' rapid amplification of cDNA ends. The induction of the MYOC gene in cultured bovine trabecular meshwork cells after exposure to dexamethasone was quantitatively examined with real-time quantitative PCR using a probe designed according to the sequence of the determined bovine MYOC gene. RESULTS: Bovine MYOC protein was composed of 490 amino acids, which was 81.6% identical with that of human MYOC protein. Most of the amino acid residues of which mutation was reported to cause glaucoma were conserved in the bovine MYOC protein. After 2 weeks of treatment with 500 nM dexamethasone, expression of bovine MYOC mRNA was amplified 14-fold (14.1+/-5.1-fold, mean +/- SEM) measured by real-time quantitative PCR. CONCLUSIONS: The cDNA sequence of the bovine MYOC gene had a high degree of similarity to that of the human MYOC gene. Investigation of the function of bovine MYOC may contribute to identifying the role of MYOC protein in the aqueous outflow system.