长链非编码RNA 母系表达基因3调控miR-34a对糖尿病视网膜病变Müller细胞活化及炎症因子分泌的影响

目的　探讨母系表达基因3（maternally expressed gene 3,MEG3）对糖尿病视网膜病变（DR）Müller细胞的活化及炎症因子分泌的影响及机制。方法　高脂饮食联合链脲佐菌素腹腔注射构建小鼠DR体内模型。高糖刺激人视网膜Müller细胞株MIO-M1构建DR体外模型。免疫荧光化学染色及Western blot检测小鼠视网膜及Müller细胞中胶质纤维酸性蛋白（GFAP）的表达。Western blot及酶联免疫吸附实验（ELISA）检测小鼠视网膜及细胞培养基上清中血管内皮生长因子（VEGF）蛋白的表达。ELISA检测小鼠视网膜及细胞培养基上清中IL-1β蛋白的表达。分别或同时向Müller细胞中转染pcDNA-MEG3及miR-34a mimic对其表达进行干预。qRT-PCR检测MEG3 mRNA及miR-34a表达。结果　与正常对照组小鼠比较,DR组小鼠视网膜中GFAP、VEGF及IL-1β蛋白表达均增多（均为P<0.05）,MEG3 mRNA表达降低(P<0.01)。与对照组比较,高糖组Müller细胞中MEG3 mRNA表达降低(P<0.01),而GFAP、VEGF及IL-1β蛋白表达均升高（均为P<0.05）。与高糖组比较,高糖+pcDNA-MEG3组中GFAP、VEGF及IL-1β蛋白表达均降低（均为P<0.05）。与正常对照组比较,DR组小鼠视网膜及高糖刺激的Müller细胞中miR-34a表达均升高(均为P<0.05)。与pcDNA组比较,pcDNA-MEG3组中miR-34a表达减少(P<0.01)。与pcDNA+NC mimic组比较,pcDNA+miR-34a mimic组中GFAP、VEGF及IL-1β蛋白表达均升高（均为P<0.05）,而pcDNA-MEG3+NC mimic组中GFAP、VEGF及IL-1β蛋白表达均减少（均为P<0.05）。与pcDNA-MEG3+miR-34a mimic组比较,GFAP、VEGF及IL-1β蛋白表达水平均升高（均为P<0.05）。结论　MEG3在DR小鼠视网膜及高糖刺激的Müller细胞中表达均降低,其可通过负向调控miR-34a抑制Müller细胞活化及炎症因子的分泌。过表达MEG3可能成为DR治疗的新靶点。     

高浓度葡萄糖对体外培养大鼠Müller细胞P2Y2受体的影响

目的:观察高浓度葡萄糖对体外培养的大鼠视网膜Müler细胞P2Y2受体表达的影响。方法:用改进的酶消化法纯化培养并用胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)和谷氨酰胺合成酶(GS)鉴定大鼠Müller细胞。分别在对照组(5.5mmol/L)与高糖组(10,25,50mmol/L)中孵育24h和72h,通过免疫荧光及荧光强度半定量分析检测Müller细胞中P2Y2受体表达的变化。结果:纯化培养到第3~4代的Müller细胞,经鉴定纯度大于90%,表达GFAP和GS。在24h,10,25,50mmol/L组的荧光强度分别为31.05±7.06,59.17±11.42和84.11±12.72,与对照组(26.60±5.15)相比较均明显增高(P<0.01)。而在72h,仅25和50mmol/L组的荧光强度明显强于对照组(P<0.01)。结论:高浓度葡萄糖上调大鼠视网膜Müller细胞P2Y2受体的表达,提示这一受体可能参与糖尿病视网膜病变过程。     

高糖对体外培养的视网膜Müller细胞表达蛋白转录活化因子4的影响

目的 观察高糖对体外培养的视网膜Müller细胞表达蛋白转录活化因子4(ATF4)的影响.方法 组织块悬浮法体外原代培养Sprague-Dawley(SD)大鼠视网膜Müller细胞,用链酶亲和素生物素过氧化物酶复合物(SABC)法对Müller细胞进行神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)及谷氨酰胺合成酶(GS)的鉴定.将培养的视网膜Müller细胞分为正常对照组和A、B、C组,正常对照组使用5.5 mmol/L葡萄糖培养液,A、B、C组分别使用20.0、30.0、40.0 mmol/L葡萄糖培养液进行.培养4d后,蛋白免疫印迹(Western blot)法检测各组视网膜Müller细胞上ATF4蛋白的表达.结果 体外培养的细胞均为视网膜Müller细胞,95％以上细胞染色呈GFAP及GS阳性.A、B、C组视网膜95％的Müller细胞呈阳性.Western blot检测显示,4d后A、B、C组Müller细胞表达ATF4蛋白的量均较正常对照组升高,组间比较,差异有统计学意义(q＝0.293、0.754、0.484,P＜0.05).结论 高糖能促使体外培养下的视网膜Müller细胞表达内质网应激蛋白ATF4增加,高糖培养下的视网膜Müller细胞可发生内质网应激反应.     

牛磺酸对高糖刺激大鼠视网膜Müller细胞GLAST和GS表达的影响

目的:通过检测牛磺酸对高糖刺激大鼠视网膜Müller细胞谷氨酸转运蛋白(glutamate-aspartate transporters,GLAST)和谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase,GS)表达的影响,探讨牛磺酸保护糖尿病引起视网膜损伤的机制。方法:高糖培养大鼠视网膜Müller细胞,分正常对照组(NC)、高糖组(high glucose,HG,25mmol/L)、高糖+0.1mmol/L牛磺酸(taurine,T)干预组(HG+0.1T)、高糖+1mmol/L牛磺酸干预组(HG+1T)、高糖+10mmol/L牛磺酸干预组(HG+10T)。用免疫荧光化学法和Western-blotting检测大鼠视网膜Müller细胞中GLAST和GS的表达。结果:高糖培养后,大鼠视网膜Müller细胞中GLAST和GS的表达明显减少(P<0.05),与高糖组相比,1mmol/L和10mmol/L牛磺酸干预可明显增加GLAST和GS的表达(P<0.05)。结论:牛磺酸增加Müller细胞中GLAST和GS的表达抑制糖尿病引起的视网膜Müller细胞功能改变。     

重组人促红细胞生成素对高糖视网膜Müller细胞谷氨酰胺合成酶表达的影响

目的 观察体外培养大鼠视网膜Müller细胞在高糖培养环境下谷氨酰胺合成酶(GS)的表达变化,探讨重组人促红细胞生成素(rhEPO)对其表达的影响及作用机制.方法 出生后3～5 d新生Sprague-Dawley大鼠10只,摘除眼球分离视网膜,经胰酶消化后分离纯化视网膜Müller细胞.并将其随机分为正常对照组、高糖培养组、高糖+5U/ml rhEPO组、高糖+10 U/ml rhEPO组、高糖+20 U/mlrhEPO组、高糖+40 U/ml rhEPO组.48 h后原位缺口末端标记法检测高糖及不同浓度rhEPO对视网膜Müller细胞凋亡的影响;免疫细胞化学法半定量检测高糖组在不同浓度rhEPO干预下视网膜Müller细胞GS蛋白的表达水平.结果 与正常对照组比较,高糖培养组视网膜Müller细胞活性下降,细胞大量凋亡,GS蛋白表达下降,差异有统计学意义(t=27.4,P＜0.0l).与高糖培养组比较,不同浓度rhEPO处理组凋亡细胞随着rhEPO浓度的增加显著性减少,差异有统计学意义(t=857.2、2 374.6、2 473.2、2 537.7,P＜0.01),GS蛋白的表达显著性升高,差异有统计学意义(t=3.2、18.0、22.5、26.4,P＜0.05).结论 rhEPO对高糖作用下视网膜Müller细胞的凋亡具有保护作用,并可上调高糖损伤细胞内下降的GS蛋白表达水平;促进谷氨酸循环,有效降低高浓度谷氨酸的兴奋性毒性作用,可能是其抗高糖损伤的保护机制之一.     

牛磺酸对高糖刺激大鼠视网膜Müller细胞GLAST和GS表达的影响

目的:通过检测牛磺酸对高糖刺激大鼠视网膜Müller细胞谷氨酸转运蛋白(glutamate-aspartate transporters,GLAST)和谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase,GS)表达的影响,探讨牛磺酸保护糖尿病引起视网膜损伤的机制。方法:高糖培养大鼠视网膜Müller细胞,分正常对照组(NC)、高糖组(high glucose,HG,25mmol/L)、高糖 0.1mmol/L牛磺酸(taurine,T)干预组(HG 0.1T)、高糖 1mmol/L牛磺酸干预组(HG 1T)、高糖 10mmol/L牛磺酸干预组(HG 10T)。用免疫荧光化学法和Western-blotting检测大鼠视网膜Müller细胞中GLAST和GS的表达。结果:高糖培养后,大鼠视网膜Müller细胞中GLAST和GS的表达明显减少(P<0.05),与高糖组相比,1mmol/L和10mmol/L牛磺酸干预可明显增加GLAST和GS的表达(P<0.05)。结论:牛磺酸增加Müller细胞中GLAST和GS的表达抑制糖尿病引起的视网膜Müller细胞功能改变。     

巢蛋白和神经胶质纤维酸性蛋白在大鼠视网膜发育中的动态表达

目的 观察巢蛋白(nestin)和神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)在大鼠视网膜发育中的动态变化.方法 48只Wistar大鼠,其中24只大鼠分为出生后1 d,1、2、3、4、7、12、20周8组,每组3只.制作眼球矢状位冰冻切片,采用共聚焦激光显微镜观察nestin和谷氨酰胺合成酶(GS)以及GFAP和GS免疫荧光染色情况.18只大鼠分为出生后id,1、2、3、4、12周,每组3只.提取大鼠视网膜总RNA,实时定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测nestin、GFAP和GS mRNA表达.选择6只出生后7～12 d新生鼠,取眼球体外培养Müller细胞,行GS和(或)nestin免疫荧光染色,共聚焦激光显微镜观察荧光染色情况.结果 出生后1 d,nestin免疫阳性细胞贯穿神经视网膜全层,主要定位于视网膜前体细胞放射状排列的细长纤维中,在视网膜内侧出现GFAP阳性的星形胶质细胞.出生后1周出现表达GS的Müller细胞,同时表达nestin,但不表达GFAP;GFAP阳性细胞仍然位于视网膜内侧.出生后2～12周,nestin在Mfiller细胞上的表达逐渐减少直至消失,GFAP在星形胶质细胞中的表达强度投有显著变化.体外培养的Müller细胞表达nestin,不表达GFAP.Nestin和GFAP mRNA在视网膜中的表达与免疫荧光染色结果相一致.结论 随大鼠视网膜不断发育,Müller细胞上nestin表达逐渐减少,成年大鼠视网膜Müller细胞不再表达nestin;新生鼠和成年鼠Müller细胞均不表达GFAP.     

缺氧对视网膜Müller细胞上水通道蛋白-4表达的影响

目的 利用体外培养的视网膜Müller细胞,研究在缺氧条件下视网膜Müller细胞上水通道蛋白-4(AQP-4)表达的变化.方法 采用组织块培养法从新西兰大白兔视网膜中获取Müller细胞,在含20%胎牛血清的DMEM培养液中原代培养,培养的细胞通过胶质纤维酸性蛋白(GFAP)免疫细胞化学染色及透射电子显微镜进行鉴定.取第2代细胞进行实验,将化学缺氧诱导剂CoCl_2联合DMEM培养液培养24h的细胞作为缺氧组;将DMEM培养液单独培养24h的细胞作为对照组.采用免疫细胞化学法及半定量RT-PCR法分别检测2组Müller细胞上AQP-4蛋白及AQP-4 mRNA的表达.结果 Müller细胞(第2代)上GFAP的阳性率为90%以上,细胞质染色呈棕色.细胞内含特征性的中间丝,细胞表面有微绒毛,细胞质内含丰富的细胞器.CoCl_2联合DMEM培养液培养24h后Müller细胞上AQP-4蛋白的表达较对照组明显增加(t=6.74,P＜0.05);AQP-4 mRNA的表达亦明显增加(t=21.79,P＜0.05).结论 缺氧能增强Müller细胞上AQP-4的表达,进而使视网膜内液体的积聚增加.提示Müller细胞在糖尿病视网膜病变(DR)或增生性视网膜病变的视网膜水肿形成过程中起重要作用.     

褪黑素通过Müller细胞保护糖尿病视网膜神经节细胞的机制

目的　探讨褪黑素对糖尿病视网膜Müller细胞的影响及其对视网膜神经节细胞的保护作用。方法　SD大鼠54只随机分为对照组、糖尿病组和褪黑素治疗组，糖尿病组和褪黑素治疗组制造糖尿病模型。造模后，对照组和糖尿病组大鼠腹腔注射体积分数10%乙醇溶液，褪黑素治疗组大鼠腹腔注射褪黑素溶液（10 mg·kg^-1）。3个月后，试剂盒检测视网膜中丙二醛（malondialdehyde，MDA）和还原型谷胱甘肽（reduced glutathione，GSH）的含量，Western blot检测视网膜中神经胶质酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）及谷氨酰胺合成酶（glutamine synthetase，GS）的表达变化，免疫组织化学染色观察GFAP阳性染色的空间分布并进行定量分析，高效液相色谱检测视网膜中谷氨酸含量变化，HE染色计数视网膜神经节细胞密度。结果　对照组及褪黑素治疗组GFAP免疫阳性染色主要局限于视网膜神经纤维层，而糖尿病组GFAP阳性染色几乎贯穿视网膜全层。与对照组相比，糖尿病组视网膜MDA含量增加而GSH含量减少，GFAP表达增加而GS表达减少，谷氨酸含量增加，视网膜神经节细胞密度明显下降（均为P<0.01）。褪黑素治疗组与对照组各指标相比差异均无统计学意义（均为P>0.05）。结论　褪黑素能抑制糖尿病视网膜的氧化应激反应，恢复视网膜Müller细胞功能酶GS的含量，减少视网膜内谷氨酸堆积，保护视网膜神经节细胞。     

胶质纤维酸性蛋白在青光眼大鼠视网膜神经胶质细胞中的表达

目的:探讨胶质纤维酸性蛋白(GFAP)在青光眼大鼠视网膜Müler细胞上的诱导表达情况及可能的意义。方法:采用烧灼涡静脉的方法制作大鼠青光眼模型,分别于术后2h;1,3d;1,2,3wk取材,制作视网膜矢状位冰冻切片和视网膜铺片,进行GS/GFAP免疫荧光双标。提取视网膜总蛋白行GFAP免疫印迹半定量分析。结果:视网膜矢状位切片可见,正常大鼠视网膜中,GFAP阳性染色只出现在神经节细胞层的星形胶质细胞上,而Müller细胞不表达GFAP。制作青光眼模型术后2h,Müller细胞上出现GFAP阳性染色,术后1,3d,GFAP的表达显著增加,到术后1wk,GFAP在Müller细胞上的表达量达到高峰,一直持续到术后3wk,免疫印迹半定量分析与以上结果吻合。术后1wk视网膜铺片中清晰可见Müller细胞足板出现GFAP的诱导表达。结论:高眼压时GFAP在Müller细胞上的诱导表达尤其在足板处的强烈表达是Müller细胞对眼压升高产生的一种反应,GFAP可能是一种潜在的有用的生物标记物。     

高浓度胰岛素对视网膜Müller细胞VEGF表达的影响(英文)

目的:探讨在高浓度胰岛素条件下,体外培养的兔视网膜Müller细胞的血管内皮细胞生长因子(vas-cularendothelialgrowthfactor,VEGF)的变化。方法:在不同浓度胰岛素条件下(4,8,12kU/L),体外培养兔视网膜Müller细胞,采用免疫细胞化学法、原位杂交法,定性测定Müller细胞分泌VEGF的变化,采用ELISA方法,定量测定Müller细胞分泌VEGF的变化。结果:高浓度胰岛素能明显增强VEGF的表达(P< 0.05)。结论:高浓度胰岛素可能通过刺激Müller细胞编码VEGF基因的转录,进而增强VEGF蛋白的表达,而在糖尿病视网膜病变的新生血管生成中发挥重要作用。     

羊膜对体外培养的兔视网膜Müller细胞表皮生长因子受体表达的影响

目的研究羊膜对兔视网膜Müller细胞表皮生长因子受体（EGFR）表达的影响及其机制。方法取出生15d新西兰白兔视网膜Müller细胞进行原代培养及传代,采用神经胶质纤维酸性蛋白（GFAP）和S-100进行细胞鉴定。0.25%胰蛋白酶、0.05%EDTA酶消化取第3代Müller细胞,实验组加0.5mL羊膜匀浆上清液继续培养12h,采用免疫组织化学法检测羊膜诱导和非诱导条件下兔视网膜Müller细胞EGFR表达的变化并进行分析。结果培养的兔视网膜Müller细胞GFAP和S-100表达阳性,透射电镜检查细胞质内可见8～10nm的中间丝。未经羊膜诱导的视网膜Müller细胞EGFR有少量表达,经羊膜诱导12h后,EGFR表达明显增多,2组灰度值分别为571588.80±67862.68和1000352.00±98386.22,差异有统计学意义（t=4.035,P〈0.01）。结论经羊膜诱导后可促进培养的兔视网膜Müller细胞EGFR的表达。     

豚鼠近视眼视网膜Müller细胞中TGFβ2、VIP、DA的表达

目的 研究转化生长因子β2(TGFβ2)、血管活性肠肽(VIP)和多巴胺(DA)在原代培养的豚鼠近视眼视网膜Müller细胞中的变化.方法 眼罩遮盖诱导豚鼠近视眼,酶消化法原代培养其视网膜Müller细胞,GFAP、Vimentin免疫组织化学染色进行细胞鉴定.Westren blotting检测TGFβ2、VIP、酪氨酸羟化酶(TH)蛋白在正常对照眼、自身对照眼和近视眼视网膜Müller细胞中的表达情况.高效液相色谱-电化学法测定视网膜Müller细胞分泌DA的质量浓度变化.结果 眼罩遮盖14d后,豚鼠遮盖眼眼轴延长,近视形成.酶消化法成功培养出豚鼠视网膜Müller细胞,95%以上的培养细胞阳性表达GFAP和Vimentin.正常对照眼、自身对照眼和遮盖眼视网膜Müller细胞均阳性表达TGFβ2、VIP、TH蛋白,遮盖眼表达TGFβ2和VIP蛋白上调(P＜0.05)、TH蛋白下调(P＜0.05).与正常对照眼、自身对照眼比较,遮盖眼视网膜Müller细分泌DA减少.结论 Müller细胞是视网膜近视信号因子TGFβ2、VIP和DA的一个重要来源.在近视发生过程中Müller细胞可能通过合成、分泌这些近视信号因子,参与近视发生的调控.     

腺苷A2A受体（A2AR）拮抗剂ZM241385对视网膜脱离动物模型视网膜光感受器细胞的保护作用

目的　探讨腺苷A_2A受体（A_2AR）拮抗剂ZM241385对视网膜脱离（RD）动物模型视网膜光感受器细胞的保护作用。方法　选取健康雄性SPF级C57BL/6J小鼠48只作为研究对象。将实验小鼠随机分为对照+二甲基亚砜（DMSO）组、对照+ZM241385组、RD+DMSO组、RD+ZM241385组,每组12只。RD模型建立后,实验小鼠立即腹腔注射ZM241385（3 mg·kg^-1,剂量不超过0.2 mL）或同体积DMSO,连续给药3 d。采用免疫荧光染色检测视网膜中Müller细胞谷氨酰胺合成酶(GS)的表达,Western blot检测单核细胞趋化蛋白（MCP）-1、肿瘤坏死因子（TNF）-α、Cleaved caspase 3和B细胞淋巴瘤抗体（Bcl）-2的表达。结果　免疫荧光染色结果显示:RD+DMSO组小鼠视网膜Müller细胞GS荧光强度较对照+DMSO组显著降低,而RD+ZM241385组小鼠视网膜Müller细胞GS荧光强度较RD+DMSO组显著升高。RD+DMSO组小鼠视网膜MCP-1、TNF-α蛋白表达水平较对照+DMSO组均显著升高,差异均有统计学意义（均为P<0.001）,而RD+ZM241385组小鼠视网膜MCP-1、TNF-α蛋白表达水平较RD+DMSO组均显著降低,差异均有统计学意义（均为P<0.001）。与对照+DMSO组相比,RD+DMSO组小鼠视网膜Cleaved caspase 3蛋白表达水平显著升高,Bcl-2蛋白表达水平显著下降,差异均有统计学意义（均为P<0.001）。而与RD+DMSO组相比,RD+ZM241385组小鼠视网膜Cleaved caspase 3蛋白表达水平显著下降,Bcl-2蛋白表达水平显著升高,差异均有统计学意义（均为P<0.001）。结论　A_2AR拮抗剂ZM241385通过促进RD小鼠视网膜Müller细胞GS表达,抑制炎症细胞因子MCP-1、TNF-α的表达,缓解光感受器细胞凋亡。     

脑源性神经营养因子对鼠视网膜Müller细胞GLAST蛋白表达及功能的调控

目的 研究脑源性神经营养因子（BDNF）对鼠视网膜Müller细胞L-谷氨酸/L-天门冬氨酸转运体（GLAST）蛋白表达及功能的调控作用.方法 实验研究.取出生3～7 d的新生昆明小鼠视网膜组织进行Müller细胞培养,取传代后第3代Müller细胞进行后续试验.实验分为BDNF干预组和空白对照组：BDNF干预组小鼠视网膜Müller细胞分别加入50、75、100、125和150 ng/ml的BDNF培养24 h：空白对照组培养的Müller细胞不加BDNF.采用Western blot方法检测Müller细胞GLAST蛋白的表达.采用L-[3,4-H3]-谷氨酸检测100 ng/ml的BDNF干预组与空白对照组Müller细胞对谷氨酸的摄取功能的差异.对各组视网膜Müller细胞GLAST蛋白表达水平的比较采用单因素方差分析,100ng/ml的BDNF干预组与空白对照组对谷氨酸摄取量的比较采用独立样本t检验.结果 Western blot检测结果显示,空白对照组GLAST蛋白的相对表达量为0.151±0.025,50、75、100、125和150 ng/ml的BDNF干预组蛋白相对表达量分别为0.331±0.076、0.413±0.110、0.497±0.080、0.411±0.072、0.319±0.084,不同浓度的BDNF均能上调GLAST蛋白的表达水平（F=6.793,P=0.003）.当BDNF浓度为100 ng/ml时,CLAST蛋白表达量最大.100 ng/ml的BDNF组与空白对照组对谷氨酸的摄取量分别为（81 213±5982）和（68 743±2688）cpm/（mg·ml）,100 ng/ml的BDNF组能够增加Müller细胞对谷氨酸的摄取,两组差异有统计学意义（t=6.462,P=0.023）.结论 BDNF能够上调GLAST蛋白的表达,并增加细胞对谷氨酸的摄取.     

体外诱导猪Müller细胞定向分化为光感受器细胞的研究

背景 大鼠、小鼠Müller细胞在体外能诱导分化为表达视网膜光感受器细胞特异标记的细胞,但目前有关成年猪Müller细胞分化为视网膜光感受器细胞的研究鲜有报道.目的 研究成年猪Müller细胞于体外定向诱导后分化成视网膜第一级传导神经元光感受器细胞.方法 消化成年猪眼视网膜组织,分离Müller细胞行体外继代单层贴壁培养.使用定向分化培养基对P2、P3和P4代Müller单层贴壁细胞及先形成细胞球悬浮培养2—3d,然后再对贴壁细胞进行诱导分化,最后结合细胞形态和免疫荧光染色结果鉴定Müller细胞以及诱导分化效果.结果 免疫荧光染色结果显示,P2,P3和P4 Müller细胞均能表达Müller细胞特异蛋白分子标记,即谷氨酸合成酶(GS),P3 Müller细胞还同时表达另一种Müller细胞特异蛋白分子标记,神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP).免疫荧光染色分析并计算视网膜光感受器细胞特异标记视紫质Rhodopsin阳性率,P2 Müller单层贴壁分化细胞为(27.99±6.53)％,P2悬浮细胞球分化为(16.54±3.40)％.P2悬浮细胞球诱导分化后形态更趋向神经元,而P2代Müller单层贴壁细胞分化后形态仍趋向于成纤维细胞.随着培养代数的增加,细胞球定向分化Rhodopsin阳性表达程度逐渐减弱,P2、P3和P4 Rhodopsin阳性率分别为(56.23±7.32)％、(35.26±8.55)％和(12.68±3.18)％,差异无统计学意义(F=2.618,P=0.099).同代细胞随着诱导时间的延长,Rhodopsin阳性表达有所减弱,差异无统计学意义(P=0.099),但分化细胞形态更为细长.结论 成年猪Müller细胞离体培养后可定向分化为表达视网膜光感受器样细胞特异标记的细胞.细胞球悬浮培养2～3d,以及延长诱导分化时间都能使得分化细胞形态更为细长.     

葛花总黄酮对糖尿病视网膜病变大鼠视网膜Müller细胞的保护作用

目的　探讨葛花总黄酮（total flavonoids of pueraria，TFP）对糖尿病大鼠视网膜Müller细胞的保护作用。方法　取SPF级雄性SD大鼠60只，采用单次腹腔注射链脲佐菌素（55 mg·kg^-1）制作大鼠糖尿病模型。将造模成功的糖尿病大鼠随机分成糖尿病组、TFP组及TFP+Brusatol组（Brusatol为核因子NF-E2相关因子信号通路抑制剂），每组15只。另取15只正常大鼠作为对照组。造模12周后，检测各组大鼠血糖浓度、体质量、视网膜谷氨酸含量、丙二醛（MDA）及超氧化物歧化酶（SOD）含量；采用免疫组织化学法检测视网膜神经胶质纤维酸性蛋白（GFAP）的表达，免疫荧光染色检测大鼠视网膜Nrf2表达，Western blot检测大鼠视网膜Nrf2、血红素氧合酶-1（HO-1）及谷氨酰胺合成酶（GS）蛋白表达。结果　造模12周后， 糖尿病组大鼠血糖浓度高于对照组，且均大于16.7 mmol·L^-1；TFP组及TFP+Brusatol组血糖浓度均低于糖尿病组（均为P<0.05）；糖尿病组、TFP组及TFP+Brusatol组大鼠体质量均低于对照组（均为P<0.05）。糖尿病组和TFP+Brusatol组大鼠视网膜谷氨酸含量高于对照组（均为P<0.05）；TFP组谷氨酸含量低于糖尿病组（P<0.05）。糖尿病组和TFP+Brusatol组MDA含量均高于对照组，SOD活性均低于对照组（均为P<0.05）。TFP组MDA含量低于糖尿病组，SOD活性高于糖尿病组（P<0.05）。糖尿病组和TFP+Brusatol组大鼠视网膜GFAP蛋白表达阳性率均高于对照组（均为P<0.05）；TFP组GFAP蛋白表达阳性率低于糖尿病组（P<0.05）。将对照组Nrf2蛋白免疫荧光强度设定为100.00%，糖尿病组Nrf2蛋白免疫荧光强度高于对照组（P<0.05）。TFP组Nrf2蛋白免疫荧光强度高于糖尿病组（P<0.05），而TFP+Brusatol组与对照组相比差异无统计学意义（P>0.05）。糖尿病组大鼠视网膜Nrf2蛋白表达高于对照组，糖尿病组和TFP+Brusatol组大鼠视网膜HO-1和GS蛋白表达均低于对照组（均为P<0.05）。TFP组大鼠视网膜Nrf2、HO-1及GS蛋白表达均高于糖尿病组（均为P<0.05），而TFP+Brusatol组与对照组大鼠视网膜Nrf2蛋白表达差异无统计学意义（P>0.05）。结论　TFP可通过降低血糖浓度，增强大鼠视网膜的抗氧化能力，进而保护糖尿病状态下受损的Müller细胞，其机制与激活Nrf2/HO-1信号通路有关。     

色素上皮衍生因子对高糖刺激下大鼠视网膜Müller细胞凋亡的影响

目的 探讨色素上皮衍生因子(pigmentepitheliumderivedfactor,PEDF)对高糖刺激下视网膜Müller细胞凋亡的影响,为PEDF治疗糖尿病视网膜病变提供实验依据。方法 实验分3组,分别是正常对照组、高糖模型(HG)组(培养基内含有25mmolL-1的葡萄糖)和PEDF处理高糖模型(HG+PEDF)组(在高糖培养基础上加入25mgL-1的PEDF)。反复胰蛋白酶消化法培养纯化SD大鼠视网膜Müller细胞,免疫荧光双标鉴定纯度;应用倒置相差显微镜观察Müller细胞形态,AnnexinVFITC、PI染色流式细胞技术检测Müller细胞的凋亡率,RTPCR测定Müller细胞bcl2、baxmRNA的表达变化。结果 原代培养的Müller细胞传至3代时纯度为95%以上。正常对照组、HG组、HG+PEDF组Müller细胞早期凋亡率分别为(1.223±0106)%、(2.657±0.120)%、(1.907±0.117)%,baxmRNA相对灰度值分别为0.269±0.041、0.804±0.052、0.528±0.018,bcl2mRNA相对灰度值分别为0.904±0.021、0.413±0015、0.521±0.010。HG组与正常对照组相比,Müller细胞形态发生明显改变,细胞凋亡率显著增加(P<0.001),baxmRNA表达显著升高,bcl2mRNA表达显著降低(均为P<0.01);HG+PEDF组Müller细胞凋亡率较HG组显著降低(P<0.001),baxmRNA表达显著降低,bcl2mRNA表达显著升高(均为P<0.01),但仍有别于正常对照组(均为P<005)。结论 外源给予PEDF可以显著减少高糖刺激引起的Müller细胞的凋亡,对视网膜Müller细胞具有显著的保护作用。     

改良的人视网膜Müller细胞的原代培养方法与鉴定

背景 视网膜Müller细胞是视网膜重要的胶质细胞,也是视网膜干细胞的来源之一,研究Müller细胞的生物学行为对研究视网膜的各种生理病理过程和视网膜干细胞治疗研究具有重要意义,而建立稳定的视网膜Müller细胞培养体系是相关研究的基础. 目的 优化分离培养和纯化人视网膜Müller细胞的方法,为相关的实验研究提供良好优质的Müller细胞来源. 方法 分离人供体眼视网膜组织,然后将剪碎的视网膜组织置入质量分数0.25％胰蛋白酶+100 U透明质酸酶混合溶液中进行消化,添加含体积分数10％胎牛血清的DMEM/F12培养液1～2 ml终止消化,然后加入含体积分数20％胎牛血清的RPMI1640培养液培养72 h,行半量换液,再以含10％胎牛血清的培养液进行传代.光学显微镜下根据细胞的形态特征进行细胞鉴定,并分别采用免疫荧光技术和免疫组织化学法检测胶质细胞标志物胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和Müller细胞特异性标志物谷氨酰胺合成酶(GS)的表达,对培养的细胞进行鉴定.结果 应用0.25％胰蛋白酶+100 U(商品单位)透明质酸酶的混合酶消化法可成功获取人视网膜Müller细胞,原代培养后24 h细胞贴壁,培养后9～1Od细胞融合.培养的细胞胞体呈长圆形,细胞质丰富,部分细胞体两端锥状长突起,末端膨隆,细胞核大.传代后的细胞胞体大,呈扁平多角形,符合Müller细胞的形态.细胞免疫组织化学和免疫荧光技术检测显示95％以上的细胞中GFAP呈阳性表达,90％以上的细胞中GS呈强阳性表达. 结论 应用透明质酸酶和胰蛋白酶混合液消化法可以成功分离人视网膜Müller细胞,分别用含20％胎牛血清和含10％胎牛血清的RPMI1640培养液培养和传代的人视网膜Müller细胞产量高且纯度好.     

胰岛素对视网膜Müller细胞神经保护功能的影响

目的 通过观察不同浓度胰岛素对视网膜Müller细胞内谷氨酸(glutamate,Glu)-谷氨酰胺循环(glutamine,Gln)及谷胱甘肽(glutathione,GSH)的影响,探讨其在视网膜神经损伤中的作用.方法 利用生物化学检测方法 ,观察并测定体外培养的兔视网膜Müller细胞内Glu、Gln合成酶(glutamine synthetase,GS)、Gln及GSH在不同胰岛素条件下的含量变化.结果 随着胰岛素浓度的升高及作用时间的延长,Müller细胞内Glu、Gln、GS和GSH的含量均呈下降趋势,且与对照组相比明显降低(P＜0.01).结论 高浓度胰岛素能够减少视网膜Müller细胞内Glu的含量,降低GS活性,减少Gln、GSH合成,从而减弱其保护神经元的功能.