条件性Smad4基因敲除鼠模型的建立和鉴定及初步表型

目的：利用Cre/LoxP系统建立眼组织特异性Smad4基因敲除小鼠并进行初步表型分析。

方法：通过PAX6启动子驱动的Cre转基因小鼠(Le-Cre)作为介导敲除的工具鼠,将其与Smad4条件基因小鼠(Smad4fl/fl)结合获得Le-Cre特异性Smad4基因敲除小鼠或变异小鼠(Le-Cre; Smad4fl/fl)。为了证实条件性基因敲除的特异性及有效性,通过PCR技术对小鼠或鼠胚进行了相关基因分析,特定组织绿色荧光蛋白(GFP)的表达及Smad4蛋白的检测,同时利用ROSA26报导基因小鼠藉LacZ染色显示Le-Cre在眼组织的表达; 并对Smad4变异小鼠的表型进行了观察。

结果：早在E10.0左右,鼠胚晶状体位置及眼周外胚层发现强荧光的GFP表达,表明Le-Cre明确出现在特定的靶组织。通过小鼠基因型分析,确定了小鼠或鼠胚是否携带Cre重组酶基因、Smad4条件性等位基因和/或Rosa报导基因,对小鼠晶体DNA的基因分析也证实Smad4基因在某些特异性眼组织内得到剔除。通过在Cre转基因小鼠导入报导基因,并籍LacZ染色对Cre重组酶的表达进行检测,显示了Cre重组酶的时空表达及其表达的组织特异性。Smad4免疫组化染色显示,在正常发育胚鼠眼可见广泛的Smad4表达,早期主要存在于胞浆,随着胚眼发育向核内转移; 而在Smad4变异鼠胚眼,结果表明Smad4在Cre重组酶所表达的组织内缺乏表达。观察发现Smad4变异鼠可以顺利存活,但表现出眼球缩小、眼窝凹陷、眼睑畸形开放、闭合不能及眼周毛发脱失的外观。

结论：通过基因和蛋白水平的检测证实了Le-Cre; Smad4基因敲除鼠的建立及Smad4在变异小鼠中表达的缺乏。Smad4在眼组织的敲除导致了眼及附属器的明显异常,为深入了解眼球发育及Smad4对其影响的机制提供了一个可信的动物模型。     

小鼠青光眼模型的相关致病基因研究现状

小鼠基因与人类有高度同源性,小鼠眼的结构和功能与人眼相似,加之某些纯系小鼠基因已经全部测序,因此小鼠青光眼模型较其他青光眼动物模型在青光眼相关致病基因方面的研究有更多的优势.通过基因敲除/敲入、转基因等操作,不仅可以研究特定基因的功能与突变,还可以研究不同致病基因间的相互作用,为青光眼的研究提供强有力的基因研究手段.     

CYP1B1基因缺失小鼠眼前房角组织结构的观察

目的 研究细胞色素P450 181(CYP1B1)基因对小鼠眼前房角组织结构的影响.方法 实验研究.采用成年CYP1B1基因缺失小鼠模型,以同龄C57BL/6J小鼠为对照.通过塑料包埋切片技术,用光学显微镜和透射电子显微镜观察两组小鼠眼前房角组织的形态和超微结构.结果 C57BL/6J小鼠眼前房角组织发育正常;CYP1B1因缺失小鼠存在不同程度的房水引流系统发育畸形,表现为小梁网发育不良,网眼狭窄,小梁细胞结构变异,有时可见小梁柱间有异常存在的均质膜,Schlemm管狭窄或缺失,虹膜突从虹膜根直达全部小梁网.这些异常改变在CYP1B1基因缺失小鼠眼前房角内呈局灶性分布.结论 CYP1B1基因在房角的发育过程中有重要作用,其缺失可导致小梁网、Schlemm管、虹膜突等房水滤过道的结构异常,可能影响房水引流系统的代谢和功能.     

活化星形胶质细胞去抑制调控小鼠视神经再生的实验研究

目的:揭示活化星形胶质细胞去抑制对小鼠视神经再生的作用。方法:将Bcl-2高表达转基因小鼠(Bcl-2tg)和GFAP/Vimentin双基因敲除小鼠(GFAP-/-/Vim-/-)交配获得三基因突变小鼠(Bcl-2tg/GFAP-/-/Vim-/-,3M)。分别选取出生后5d(P5)小鼠3只及出生后18d(P18)小鼠3只制作标准的完全性视神经嵌断模型。应用GAP43免疫荧光染色特异性检测再生轴突。结果:Bcl-2tg/GFAP-/-/Vim-/-小鼠在P5时获得视神经再生,再生轴突可以延伸达视交叉水平,而P20时仅获得局部出芽再生。结论:在Bcl-2转基因使视网膜节细胞重获内源性再生能力基础上,通过活化星形胶质细胞去抑制可以促进视神经轴突再生,提示活化星形胶质细胞是抑制视神经再生的重要因素,从而为青光眼等视神经病变的再生治疗提出了新的方向。     

NMNAT1缺失对小鼠视网膜双极细胞和无长突细胞的影响

目的　探索烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶1（NMNAT1）缺失对视网膜神经元细胞结构及功能的损伤作用。方法　利用NMNAT1^fl/fl小鼠与Six3启动子下表达Cre重组酶的转基因（Six3-Cre）小鼠杂交,获得NMNAT1条件基因敲除小鼠及其同窝对照小鼠,实时荧光定量PCR和Western blot进行检测。在基因敲除小鼠出生后第0、4、10、30天（P0、P4、P10、P30）取材,制作冰冻切片,分别进行HE染色测量视网膜厚度,免疫荧光染色鉴定受损细胞类型以及检测恢复蛋白和视紫质表达水平。结果　与同窝对照小鼠相比,基因敲除小鼠在P0时视网膜并没有明显的形态差异,视网膜厚度比较差异无统计学意义（P>0.05）;到P4时基因敲除小鼠表现出视网膜内层和外层中的分层破坏和大规模细胞死亡,基因敲除小鼠P4时距视神经500 μm、1000 μm、1250 μm的视网膜厚度均明显低于同窝对照小鼠（均为P<0.05）,而距视神经1750 μm的视网膜厚度尚未受影响（P>0.05）;基因敲除小鼠P10时距视神经500 μm、1000 μm、1250 μm、1750 μm的视网膜厚度均低于同窝对照小鼠（均为P<0.05）。基因敲除小鼠全部视网膜内外层的退化在 P30 时几乎完成。此外,与同窝对照小鼠相比,P4时基因敲除小鼠视网膜神经节细胞、双极细胞和无长突细胞的数量差异均没有统计学意义（均为P>0.05）,P10时视网膜神经节细胞没有显著差异（P>0.05）,基因敲除小鼠双极细胞、无长突细胞分别减少了约75%、51%（均为P<0.05）。与同窝对照小鼠相比,基因敲除小鼠在P4时视网膜几乎不表达恢复蛋白和视紫质（均为P<0.05）。结论　NMNAT1缺失主要导致视网膜双极细胞和无长突细胞损害以及恢复蛋白和视紫质缺失。     

Smad4对小鼠泪腺发育的影响

背景Smad4是转化牛长因子β(TGF-β)超家族分子信号通路的一个关键调节因子.在许多组织器官的正常发育中起重要作用,目前其在泪腺发育中的作用鲜有报道. 目的 利用Smad4条件性基因敲除小鼠模型探讨Smad4在泪腺失活后对其发育的影响.方法 通过使用Pax6启动子控制下的Le-Cre转基因小鼠和Smad4条件基因敲除小鼠建立晶状体外胚层特异性Smad4条件性基因敲除小鼠(C57BL/6小鼠系),失活Smad4在泪腺、晶状体、角膜和眼睑外胚层的表达,采用常规组织学方法观察其泪腺的形态学改变,同时Cre及Rosa26报道基因双转基因小鼠通过LacZ染色观察泪腺发育过程中与同龄野生型小鼠泪腺发育和形态的差别.每组至少使用6只同龄小鼠或小鼠胚胎进行比较.结果 LacZ染色显示,与孕15.0d的野生型相比,同胎龄Smad4基因敲除小鼠胚胎仍可形成泪腺原芽,但其明显短小;孕16.5d的野生型泪腺芽已有分支,而变异型仍未见分支,仅前端变圆钝,至孕18.0d虽有分支并出现腺泡,但其分支、腺泡大小和数目均明显少于野生型;组织解剖学发现Smad4变异小鼠出生后其泪腺发育仍旧缓慢,表现为其腺体大小、分叶及腺泡数目均较同龄野生小鼠者显著减少,并自P7起出现渐进性增加的色素及脂肪堆积,至成熟期,腺体完全被脂肪组织和色索所取代.结论 Smad4对于小鼠泪腺的正常发育有着重要的作用,并可能影响腺体内色素和脂肪的代谢.     

激光诱发小鼠脉络膜新生血管后骨髓来源细胞在眼部的表型特征

目的 探讨激光诱发小鼠脉络膜新生血管(CNV)后,骨髓来源细胞(BMC)在其眼部的表型特征.方法 实验研究.以绿色荧光蛋白(GFP)转基因小鼠为供体,野生型C57BL/6J小鼠为受体进行骨髓移植后,应用532 nm倍频激光对嵌合子小鼠(处理组)和野生型小鼠(对照组)的右眼进行光凝,建立CNV模型,应用荧光素眼底血管造影和组织病理学分析确定模型稳定后,对实验眼进行免疫荧光染色,观察GFP阳性细胞在眼部的表型特征.结果 激光照射后14 d CNV生长趋于稳定,此时GFP阳性细胞分布于CNV区域(包括CNV深层的脉络膜)、CNV表层的视网膜、角巩膜缘、睫状体、视乳头周围及远离CNV的视网膜、脉络膜和巩膜.CD31或αSMA 阳性的GFP+细胞仅出现于CNV区域,F4/80和GFP双阳性的细胞不仅出现在CNV区域,还出现在CNV表层的视网膜、角巩膜缘和睫状体.结论 分化为血管细胞的BMC可特异性向CNV区域趋化,出现在眼部其他区域的BMC中有部分是巨噬细胞或树突状细胞.BMC在眼部除参与CNV形成外,可能还有其他功能.(中华眼科杂志.2008.44:212-216)     

基因敲除小鼠模型在眼科的应用

基因敲除动物模型是以基因敲除技术和胚胎干细胞技术为基础,通过DNA同源重组使特定基因失活.目前应用最广的是基因敲除小鼠模型.本文综述了基因敲除小鼠模型的构建方法、基因敲除动物模型在眼科的应用.如用于研究角膜上皮的分化、角膜移植免疫反应的机制、白内障及青光眼的发病机制、视网膜的发育与分化等.     

表达视网膜Müller细胞的转基因小鼠基因鉴定△

目的 通过基因鉴定方法检测出可表达视网膜Müller细胞的Sox2-Cre和Rosa26转基因小鼠杂交的后代。方法 采用传统提取DNA、聚合酶链反应(PCR)扩增、电泳及免疫荧光方法检测。结果 PCR方法检测野生型小鼠是长度为324 bp的条带;杂合子小鼠是长度为250 bp和324 bp的双条带,且免疫荧光发现转基因小鼠的自发红色荧光可以和Müller细胞标记物谷氨酰胺合酶(GS)绿色荧光共标。结论 建立了可表达视网膜Müller细胞的转基因小鼠模型,为今后研究视网膜Müller细胞的增殖分化作用及其作用机制提供了动物模型。     

利用Cre/loxP系统定位腺苷A2A受体在小鼠视网膜上的分布

目的：运用Cre/loxP系统来定位腺苷A2A 受体（A2AR）在小鼠视网膜上的分布情况。方法：实验研究。将雄性B6.FVB（Cg）-Tg（Adora2a-cre KG139Gsat/Mmucd（简称A2A-cre）小鼠与雌性B6．129S6-Gt（ROSA）26Sortm9（CAG-tdTomato）Hze/J（简称Ai9）小鼠交配,对新生小鼠基因型进行鉴定,并选取5 只4 周龄A2A-cre+,Ai9 鼠,此小鼠表达的Cre酶能敲除Ai9 小鼠中的STOP序列使Tomato荧光蛋白表达。采用免疫荧光方法分别将Tomato红色荧光蛋白与不同类型的视网膜细胞抗体共标记,通过观察Tomato红色荧光蛋白和视网膜细胞特异性抗体的共定位结果,来明确A2AR在视网膜上的定位情况。结果：免疫荧光结果显示Tomato+细胞主要分布在视网膜神经节细胞层和内核层,外核层并没有发现。其中神经节细胞层中的Tomato+细胞少数为神经节细胞,多数为异位无长突细胞,而分布于内核层的Tomato+细胞主要为Müller细胞和无长突细胞。进一步对无长突细胞亚型分析发现,Tomato+无长突细胞多数为AⅡ型无长突细胞,而胆碱能无长突细胞和多巴胺能无长突细胞并无Tomato+表达。结论：在4 周龄A2A-cre+,Ai9 小鼠视网膜中,A2AR主要表达于神经节细胞、无长突细胞和Müller细胞中。     

Fate mapping of neural crest cells during eye development using a protein 0 promoter-driven transgenic technique

PURPOSE: To map neural crest cell fate during eye development. METHODS: Neural crest cells were tracked in developing mouse eyes using a transgene expressing Cre recombinase controlled by the Protein 0 promoter and a Rosa26 Cre-responsive reporter gene that produced beta-galactosidase after Cre-mediated recombination. RESULTS: beta-galactosidase-positive cells were detected in the periocular segment on embryonic day (E) 9.5. Several neural crest cell-derived tissues including corneal stroma, corneal endothelium, iridocorneal angle, ciliary body, primary vitreous and eyelid were strongly stained on E13.5-E18.5. The staining decreased in the corneal stroma after birth, but persisted in the presumptive iridocorneal angle. CONCLUSIONS: Protein 0-Cre transgenic mice offer a conditional knock-out strategy to investigate anterior eye segment differentiation.     

Inducible expression of cre recombinase in the retinal pigmented epithelium

PURPOSE: The retinal pigmented epithelium (RPE) expresses many genes that play important roles in the support and maintenance of photoreceptors. The present study was conducted to develop a system amenable to the dissection of the temporal function of these genes, specifically within RPE cells. Transgenic mice were generated and characterized in which the expression of Cre recombinase could be specifically induced within the RPE. METHODS: Transgenic mice carrying the human vitelliform macular dystrophy-2 (VMD2) promoter (P(VMD2))-directed reverse tetracycline-dependent transactivator (rtTA) and the tetracycline-responsive element (TRE)-directed cre were generated. Inducible Cre expression was achieved by feeding doxycycline to these mice and was characterized by using a Cre-activatable lacZ reporter mouse strain (R26R). RESULTS: A beta-galactosidase assay of rtTA/Cre-R26R mice demonstrated that the basal level of Cre expression without doxycycline induction was negligible. Addition of doxycycline led to induction of RPE-specific Cre expression/function at least from embryonic day 9 to postnatal day 60. The highest induction occurred at approximately postnatal day 4. As measured by ERG and histology, retinal function and morphology were normal in 10-month-old rtTA/Cre mice that were treated with doxycycline at weaning age. CONCLUSIONS: Transgenic mice were generated that express Cre recombinase in the RPE in an inducible fashion. These mice will be useful for studies of the RPE-specific role of genes that are expressed in the RPE as well as other cells, particularly for avoiding embryonic lethality and dissecting the function of genes that play dual roles in development and adulthood.     

Site-specific somatic mutagenesis in the retinal pigment epithelium

PURPOSE: Generate site-specific somatic mutations selectively in the retinal pigment epithelium (RPE) in mice. METHODS: A transgenic mouse line expressing the Cre recombinase under the control of the tyrosinase-related protein (TRP)-1 promoter was generated. The presence of Cre was determined by in situ hybridization, and Cre-mediated excision of DNA was analyzed by PCR and alkaline phosphatase (AP) histochemistry in reporter mice carrying a loxP-flanked (floxed) retinoid X receptor alpha (RXRa) gene and in Z/AP mice, respectively. RESULTS: Cre was expressed in the RPE from embryonic day 10.5 to postnatal day 12, resulting in efficient floxed excision of DNA in the RPE from embryonic day 10.5 to adulthood in TRP1-Cre mice. Expressed Cre and excision of DNA were also detected in the ciliary margin of the retina and in some cells in the neural retina, but not in the embryonic periocular mesenchyme or in the choroid. CONCLUSIONS: The TRP1-Cre mouse line, which induces efficient Cre-mediated excision of DNA selectively in the RPE, provides a new, powerful tool to study gene functions in the RPE in vivo.     

Transgenic models for eye malformations

Several lines of transgenic mice developing eye malformations have been described in the literature and appear to be of increasing interest for the study of eye teratology in humans, since gene expression and regulation can be studied in the developing animal. Transgenic applications are briefly described here and an overview of existing transgenic mouse models carrying different eye abnormalities is given according to the major diagnosis (e.g., cataract, microphthalmia, anterior segment dysgenesis, retinal dysplasia). Interestingly, many transgenic models exhibit pathological findings similar to those observed in human pediatric ophthalmology. Unfortunately, detailed embryological studies in transgenic mice bearing congenital eye malformations are not available for all lines. Thus, the importance of creating further transgenic models to study the function of morphogenes and growth factors in eye development is also discussed.     

脉络膜新生血管形成的模型构建与选择

脉络膜新生血管形成（choroid neovascularization,CNV）已成为眼科界难题之一,制备一种可靠、稳定的CNV动物模型对于深入研究CNV的发病机制及治疗方法有深远的意义.目前,CNV动物模型主要有3种：激光诱导、生长因子诱导、基因缺陷动物模型.其理论基础主要建立于击破Bruch膜或产生过量的VEGF.常用的实验模型动物包括鼠科类、兔、猪和灵长类动物.各种模型动物具有不同的生理特性,不同动物模型具有不同病理变化,应根据不同的实验要求选择最合适的实验动物.     

角膜新生血管转基因老鼠模型的应用进展

角膜新生血管是由于毛细血管或淋巴管侵入角膜所致,如不及时处理,将严重影响视力,角膜新生血管转基因老鼠模型的建立和应用为角膜新生血管机制的研究、抗血管药物的筛选和治疗方案的评估等提供了良好的平台,是一种非常有价值和潜力的动物模型。本文主要介绍转基因老鼠模型在角膜新生血管研究中的应用进展。     

青光眼小鼠基因模型的研究进展

青光眼作为目前全球首位不可逆性致盲眼病，是具有遗传倾向的多因素复杂疾病，病理性眼压升高是其危险因素。关于青光眼的发病机制尚不完全清楚，现有研究多建立在动物模型的基础上，以小鼠为主要研究对象，通过实验诱导手段或转基因操作复建青光眼病理损伤过程，进一步研究相关的发病机制和病理变化。实验诱导构建青光眼小鼠模型技术经过诸多学者的研究，逐渐趋于成熟。而随着分子生物学和遗传学的研究深入，越来越多的研究集中在青光眼的相关疾病基因上，转基因小鼠模型成为近年的热点，与实验操作控制单一因素相比，基因编辑更能模拟出疾病发病的复杂过程。本文主要通过阐述相关青光眼小鼠转基因模型的研究进展，为今后研究中模型的选择提供更完整的方向与策略。