免疫磁珠法原代分离培养大鼠视网膜微血管周细胞

目的建立免疫磁珠法原代分离纯化大鼠视网膜微血管周细胞，并确定其免疫组化特征。方法免疫磁珠法结合传统的胶原酶消化及筛网过滤法分离出大鼠视网膜微血管周细胞，采用含有20％胎牛血清的DMEM培养。通过周细胞的形态和生长方式初步鉴别，再进行细胞α—SMA，vWF，GFAP抗体免疫组织化学特征鉴定，及激光共聚焦显微镜行用细胞PDGFR-β和desmin抗体荧光双标观察。周细胞生长曲线通过MTT法测定。结果本法获得的周细胞纯度可达98％，并能连续传代。原代周细胞约2～3周融合，传代后生长和融合速度加快，细胞形态不规则，胞内可见丝状结构，无接触性抑制。免疫组化证实周细胞胞浆内α-SMA蛋白表达阳性，内皮细胞特异性vWF因子表达阴性，胶质细胞特异性GFAP表达阴性。激光共聚焦显示周细胞PDGFR-β和desmin抗原表达均为阳性。结论本研究首次报道应用免疫磁珠法分离培养大鼠视网膜微血管周细胞。获得高度纯化的周细胞具有明确的免疫组化特征，可用于相关视网膜血管性疾病的进一步研究。     

大鼠胚胎视网膜干细胞的分离培养

目的分离培养大鼠胚胎视网膜干细胞。方法从胎龄第16d的SD大鼠视网膜神经上皮分离视网膜细胞并进行悬浮培养,观察细胞增殖以及自发分化情况,采用免疫细胞化学方法检测Nestin、β-Tubulin、GFAP和Recoverin的表达。结果原代细胞可形成悬浮生长的神经球,传代后能形成新的细胞球。原代及传代细胞大部分表达神经干细胞标记物Nestin,分化后的细胞部分表达神经元标记物β-Tubulin或神经胶质细胞标记物GFAP,少数细胞表达光感受器细胞标记物Recoverin。结论分离培养的SD胚鼠视网膜神经干细胞可以在体外扩增并具有多分化潜能。     

基于内皮细胞/周细胞构建大鼠视网膜血管新生体外三维模型

目的：构建基于视网膜微血管内皮细胞(ECs)和周细胞(RMPs)的大鼠视网膜血管新生体外三维模型。

方法：分离、纯化、培养大鼠视网膜微血管内皮细胞及视网膜微血管周细胞,选用第3～7代经鉴定后的细胞用于研究,采用细胞示踪剂对细胞进行染色,混合后按表面培养法接种于Matrigel,动态观察,并检测血管新生期间血管内皮生长因子A(VEGF-A)的表达。

结果：培养12h时,RMPs被ECs招募,聚集成大小不等细胞团块; 24h时,ECs/RMPs共同形成复杂的三维血管样条索网; 48h时,网状结构出现明显崩解,仅保持少量不完整的简单网状结构; 72h时,血管样条索网完全崩解。在三维模型发生过程中,VEGF-A的表达量升高; 退化时,VEGF-A的表达量下降。

结论：成功基于视网膜微血管全成分细胞ECs和RMPs构建了大鼠视网膜血管新生体外三维模型。     

兔视网膜Mūeller细胞的原代培养

目的探索体外培养兔视网膜Mūeller细胞的有效方法。方法采用酶消化法从乳兔视网膜获取Mūeller细胞，通过振荡和反复洗涤使之纯化。采用免疫组织化学技术和透射电镜对传代Mūeller细胞进行鉴定。结果培养24h后即有部分细胞贴壁生长，72h后贴壁细胞进一步增多。通过振荡吹打可使附着于Mūeller细胞上的神经元脱落。20～25d后细胞接近融合，呈三角形或不规则形。传代后细胞经1周达到融合。培养细胞GFAP阳性率在95％以上。电镜观察显示：细胞内含有线粒体、粗面内质网、核糖体及8～10nm的中间丝。结论利用酶消化法可成功分离兔视网膜Mūeller细胞，通过振荡和吹打洗涤，可使之纯化。     

TNF-α对培养视网膜微血管内皮细胞与周细胞PDGF—B／PDGFR-β表达的作用

目的：研究TNF-α对内皮细胞与周细胞PDGF—B／PDGFR—β表达的作用。方法：常规剂量100ug／L以及大剂量2450ug／L TNF-α作用于培养的视网膜微血管内皮细胞、周细胞，通过免疫组化、Western Blot、RT—PCR检测PDGF—B／PDGFR—β表达。结果：内皮细胞组大剂量TNF-α组，PDGF—B表达显著下调，8h表达开始出现下调，在12h，PDGF-B的表达量为原来的39％；在人视网膜微血管周细胞组，与对照组相比，常规TNF-α剂量组PDGFR-β表达并未出现显著改变；大剂量TNF-α组，与对照组相比，PDGFR-β表达在12h下调为45％。结论：TNF-α可引起内皮细胞与周细胞PDGF—B／PDGFR-β表达降低。     

改良的人视网膜Müller细胞的原代培养方法与鉴定

背景 视网膜Müller细胞是视网膜重要的胶质细胞,也是视网膜干细胞的来源之一,研究Müller细胞的生物学行为对研究视网膜的各种生理病理过程和视网膜干细胞治疗研究具有重要意义,而建立稳定的视网膜Müller细胞培养体系是相关研究的基础. 目的 优化分离培养和纯化人视网膜Müller细胞的方法,为相关的实验研究提供良好优质的Müller细胞来源. 方法 分离人供体眼视网膜组织,然后将剪碎的视网膜组织置入质量分数0.25％胰蛋白酶+100 U透明质酸酶混合溶液中进行消化,添加含体积分数10％胎牛血清的DMEM/F12培养液1～2 ml终止消化,然后加入含体积分数20％胎牛血清的RPMI1640培养液培养72 h,行半量换液,再以含10％胎牛血清的培养液进行传代.光学显微镜下根据细胞的形态特征进行细胞鉴定,并分别采用免疫荧光技术和免疫组织化学法检测胶质细胞标志物胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和Müller细胞特异性标志物谷氨酰胺合成酶(GS)的表达,对培养的细胞进行鉴定.结果 应用0.25％胰蛋白酶+100 U(商品单位)透明质酸酶的混合酶消化法可成功获取人视网膜Müller细胞,原代培养后24 h细胞贴壁,培养后9～1Od细胞融合.培养的细胞胞体呈长圆形,细胞质丰富,部分细胞体两端锥状长突起,末端膨隆,细胞核大.传代后的细胞胞体大,呈扁平多角形,符合Müller细胞的形态.细胞免疫组织化学和免疫荧光技术检测显示95％以上的细胞中GFAP呈阳性表达,90％以上的细胞中GS呈强阳性表达. 结论 应用透明质酸酶和胰蛋白酶混合液消化法可以成功分离人视网膜Müller细胞,分别用含20％胎牛血清和含10％胎牛血清的RPMI1640培养液培养和传代的人视网膜Müller细胞产量高且纯度好.     

胎儿视网膜前体细胞的分离培养

目的建立视网膜前体细胞的培养方法。方法分离8~12周流产胎儿的视网膜神经上皮细胞，采用悬浮和贴壁两种方法分别进行培养和传代，取传代细胞用含5%胎牛血清的、无碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）的培养基诱导分化培养14 d，并采用免疫荧光法检测培养细胞诱导分化前后前体细胞和视网膜终末细胞标记物表达的改变。结果悬浮培养的细胞形成神经球并表达神经干细胞的标记物巢蛋白nestin，但无法成功传代扩增；贴壁培养的细胞可连续传代并表达nestin，传代细胞诱导分化后表达视网膜终末细胞的标记物胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)、β微管蛋白(β-tubulin)和恢复蛋白recoverin。结论从8～12周的人胚胎视网膜神经上皮分离培养的视网膜前体细胞具有体外扩增和多分化潜能。（中华眼底病杂志，2007，23：98-100）     

兔视网膜Mller细胞的原代培养

目的探索体外培养兔视网膜Mller细胞的有效方法。方法采用酶消化法从乳兔视网膜获取Mller细胞,通过振荡和反复洗涤使之纯化。采用免疫组织化学技术和透射电镜对传代Mller细胞进行鉴定。结果培养24h后即有部分细胞贴壁生长,72h后贴壁细胞进一步增多。通过振荡吹打可使附着于Mller细胞上的神经元脱落。20～25d后细胞接近融合,呈三角形或不规则形。传代后细胞经1周达到融合。培养细胞GFAP阳性率在95%以上。电镜观察显示:细胞内含有线粒体、粗面内质网、核糖体及8～10nm的中间丝。结论利用酶消化法可成功分离兔视网膜Mller细胞,通过振荡和吹打洗涤,可使之纯化。     

光损伤鼠视网膜片培养上清液诱导 MSCs 分化为视网膜样细胞的研究

目的：应用大鼠视网膜片光损伤后的培养上清液,在体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞（ mesenchymal stem cells , MSCs）成为视网膜样细胞的可能性。 方法：贴壁筛选法分离、培养大鼠MSCs ,流式细胞仪对其细胞纯度鉴定。取材大鼠视网膜神经上皮层作为视网膜片,常规石蜡切片HE染色鉴定各层组织完整性。电镜观察大鼠视网膜片光损伤程度。制备3种诱导分化大鼠MSCs的条件培养液。3种条件培养液均培养诱导至第3代大鼠MSCs 7～8d,用RT-PCR检测视紫红质（Rhodopsin）、神经元特异性烯醇化酶（neuron-specific enolase,NSE）、胶质纤维酸性蛋白（ glial fibrillary acidic protein ,GFAP）等视网膜细胞标志物在诱导后细胞中的表达情况。 结果：HE染色显示大鼠视网膜片取材结构完整,电镜显示大鼠视网膜片光损伤后结构损伤严重。 RT-PCR鉴定：条件培养液诱导大鼠MSCs 7～8d,条件培养液Ⅰ组Rhodopsin （0．3915±0．00644）、NSE （0．2019±0．00682）、GFAP （0.1972±0．00211）,条件培养液Ⅱ组Rhodopsin（0．0983±0．00319）、NSE （0．1048±0．00323）、GFAP （0．1040±0.00254）,条件培养液Ⅲ组Rhodopsin（0．0044±0．00126）、NSE（0．0498±0．00149）、GFAP（0．0467±0．00333）,组间差异有统计学意义。 结论：光损伤大鼠视网膜片培养上清液可诱导大鼠MSCs分化为视网膜样细胞,为干细胞治疗视网膜变性疾病提供新思路。     

大鼠视网膜微血管内皮细胞的原代培养及鉴定改进

【摘要】 目的 探讨大鼠视网膜微血管内皮细胞原代培养改进方法,为研究视网膜新生血管疾病的病理机制奠定基础。设计 实验研究。研究对象 大鼠视网膜微血管内皮细胞。方法 采用机械剪除大鼠视网膜血管联合酶消化分离,用含胎牛血清、内皮细胞培养特制添加剂等的条件培养基培养及纯化大鼠视网膜微血管内皮细胞,倒置相差显微镜下观察细胞生长状态。应用因子VIII、血小板内皮细胞黏附分子-1（CD31）免疫鉴定细胞。主要指标 微血管内皮细胞形态,免疫荧光染色。结果 原代培养的大鼠视网膜微血管内皮细胞贴壁后散在分布,呈单层排列,多为梭形,边界清楚,少量呈铺路石样螺旋向外生长,3~5天后融合,呈簇状单层分布。免疫荧光细胞染色显示,因子VIII抗体染色核周出现黄绿色荧光反应,CD31因子抗体染色以胞浆着色为主。细胞纯度较高,荧光染色阳性细胞率为95%。结论 采用机械剪除大鼠视网膜血管、胰蛋白酶和胶原酶消化、含特制添加剂培养基的应用、明胶包被培养瓶等综合法可获得较纯的大鼠视网膜微血管内皮细胞。（眼科,2012,21：261-263）     

高糖对体外培养的视网膜Mǖller细胞活性的影响

背景视网膜Mǖiler细胞具有为视网膜组织提供营养、维持视网膜的正常结构等多种生理功能,研究发现Mǖiler细胞的病变会导致视网膜血管发生相应的改变。探讨高糖对视网膜Mǖiler细胞的影响对于糖尿病视网膜病变（DR）的发病机制研究具有重要意义。目的研究不同浓度的葡萄糖对体外培养的视网膜Mǖiler细胞活性的影响。方法取出生后10d清洁级SD大鼠的视网膜组织,用组织块培养法在含质量分数20％胎牛血清的DMEM培养液中体外原代培养Mǖiler细胞并传代,取第3代细胞用免疫组织化学法对细胞进行鉴定。将不同浓度（5．5、30．0、40．0mmol／L）的葡萄糖加入培养基中培养4d,MTT比色法测定各组波长570nm处Mǖller细胞的吸光度（A570）值,计算各组细胞的相对存活率;采用流式细胞仪检测各组Mǖller细胞的凋亡率。结果培养的细胞贴壁生长,呈长梭形;95％以上细胞神经胶质纤维酸性蛋白（GFAP）反应阳性。MTT比色法检测显示,正常葡萄糖组及30．0mmo／L、40．0mmol／L葡萄糖处理组Mǖller细胞A570值分别为0．24±0．01、0．21±0．03和0．20±0．02,总体差异有统计学意义（F=6．755,P〈0．05）。与正常葡萄糖组比较,30．0mmol／L、40．0mmol／L葡萄糖处理组A570值均明显降低,差异有统计学意义（q=0．645、0．486,P〈0．05）。流式细胞仪检测结果表明,正常葡萄糖组、30．0mmol／L和40．0mmol／L葡萄糖处理组Mǖller细胞凋亡率分别为（26．40±0．25）％、（30．19±0．16）％和（36．23±0．19）％,总体差异有统计学意义（F=294．530,P〈0．05）,与正常葡萄糖组比较,30．0mmol／L、40．0mmol／L葡萄糖组凋亡率均明显升高,差异有统计学意义（q=0．754、0．484,P〈0．05）。结论高浓度葡萄糖可抑制视网膜Mǖller细胞的生长并增加其凋亡率,葡萄糖的上述作用呈浓度依赖性。     

The growth and behaviour of rat retinal Müller cells in vitro. 1. An improved method for isolation and culture

Eyeballs were enucleated from young (postnatal day 8-12) pigmented rats and the retinas were dissected free after soaking the globes overnight in growth medium. The retinas were digested with enzymes, dissociated and maintained in stationary culture in 10% serum supplemented growth medium. Cultures displayed extensive cellular outgrowth after 1-5 days, with abundant fusiform and epithelioid cells. Removal of aggregates and cellular debris after 6-7 days yielded a purified flat cell preparation, which could be maintained either as a primary culture for several weeks or passaged repeatedly as rapidly proliferating epithelioid cells. Staining with monoclonal antibodies RET-G1, G3 and G7, and polyclonal S-100, glutamine synthetase and carbonic acid anhydrase antisera, all markers for Müller cells, showed positive labelling of all cells present in these purified cultures, both primary and passaged cells. This contrasted with the use of RET-G2, anti Factor VIII and anti glial fibrillary acidic protein (GFAP) antibodies. RET-G2, another Müller cell marker, failed to recognize passaged cells. Anti Factor VIII also did not label any cells, and anti GFAP stained very few cells: these remained associated with aggregated material so that vigorous washing to remove loosely adherent tissue from primary cultures resulted in the total absence of GFAP positive cells. In addition, no GFAP positive cells were detected in passaged cells or in cells regrown following freezing and storage. The Müller cell nature of these flat cells in soaked retinal cultures was further supported by the specific uptake of 5-bromo-deoxyuridine by nuclei located within the inner nuclear layer of retinal fragments in vitro. Hence the soaking treatment greatly reduces the number of surviving astrocytes whilst stimulating the rapid growth of cells expressing many properties of mature retinal Müller cells.     

人视网膜Mūller细胞培养及超微结构免疫组织化学观察

用酶消化法培养人视网腆Mūller细胞井传代，用电镜及免疫组织化学(免疫组化)技术对细胞进行鉴定。结果显示Mūller细胞贴壁生长，原代细胞胞体狭长，胞质丰富，细胞内含丰富的8~10nm直径的微丝及细胞连接结构。免疫组化显示细胞呈神经胶质纤维酸性蛋白、波形蛋白阳性，证实为Mūller细胞。提示酶消化法培养是一种可靠的、大量获取人视网膜Mūller细胞的方法． （中华眼底病杂志，1995，11：178-180）     

缺氧条件下高糖及高胰岛素对Mller细胞VEGF表达的影响

目的观察缺氧、高糖及高胰岛素对视网膜Muller细胞胞浆内血管内皮生长因子（VEGF）表达的影响。方法采用组织块悬浮贴壁法原代培养兔视网膜Miiller细胞,于正常和缺氧条件下分别分为对照组、高糖组、高浓度胰岛素组、高糖高浓度胰岛素组,通过AO／EB染色法观察不同缺氧时相Mtiller细胞的凋亡情况,免疫细胞化学染色测定各组Mailer细胞胞浆内VEGF的表达。结果免疫细胞化学技术测定结果显示缺氧条件下1、2、3d各实验组与对照组相比VEGF表达量增加差异均有统计学意义（P〈0．05）。缺氧2d、3d各实验组与正常条件下各实验组相比VEGF表达增加,差异均有统计学意义（P〈0．05）。结论缺氧条件下高糖及高胰岛素环境刺激Mtiller细胞VEGF表达作用增强。     

应用反义寡核苷酸沉默PDGFR-α表达对RPE细胞增生和凋亡的影响

背景 视网膜色素上皮( RPE)细胞能分泌血小板源性生长因子(PDGF),又具有PDGF受体(PDGFR),已有研究表明PDGF对增生性玻璃体视网膜病变(PVR)的形成起着关键性作用. 目的 应用反义寡核苷酸( ASODN)技术抑制血小板源性生长因子受体-α(PDGFR-α)基因的表达,观察其对RPE细胞增生和凋亡的影响.方法 将人RPE细胞株在含质量分数10％胎牛血清的低糖DMEM培养基中进行培养,取对数生长期细胞调节细胞密度为5×105个/孔,接种于96孔板,待细胞生长至80％～90％融合时进行转染.空白对照组不加PDGFR-α ASODN及阳离子脂质体Lipofectamine 2000,1.0μmol/L Lipo-ASODN组、2.0μmol/LLipo-ASODN组使用阳离子脂质体Lipofectamine 2000将靶向PDGFR-α基因的ASODN转染至RPE细胞株.细胞转染48 h后,MTT法检测各组细胞的吸光度(A)值并以A490表示,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测PDGFR-α mRNA在RPE细胞中表达的变化;hoechst 33258荧光染色观察培养细胞的凋亡情况;流式细胞仪检测RPE细胞的细胞周期和凋亡率. 结果 空白对照组、1.0 μmol/L Lipo-ASODN组及2.0μmol/L Lipo-ASODN组RPE细胞的A490值分别为1.45±0.12、1.07±0.06、0.65±0.05,差异有统计学意义(F=97.72,P=0.00),1.0μmol/L Lipo-ASODN组和2.0 μmol/L Lipo-ASODN组RPE细胞A490值明显低于空白对照组,差异均有统计学意义( P=0.00、0.00);2.0 μmol/L Lipo-ASODN组RPE细胞A490值明显低于1.0 μmol/L Lipo-ASODN组,差异有统计学意义(P=0.00).Hoechst 33258荧光染色显示,转染PDGFR-α ASODN后RPE细胞凋亡数量多于空白对照组.流式细胞仪检测表明,转染PDGFR-α ASODN后RPE细胞阻滞于G0/G1期(F=206.70,P=0.00),1.0 μmol/L Lipo-ASODN组和2.0μmol/L Lipo-ASODN组RPE细胞凋亡率均明显高于空白对照组(37.8±1.3 vs 10.5±0.1,61.2±1.9 vs 10.5±0.1)(F=1808.90,P=0.00).PDGFR-α在RPE细胞中的表达随PDGFR-α ASODN浓度的升高有降低的趋势. 结论 利用ASODN技术沉默PDGFR-α基因表达可以显著抑制PVR过程中RPE细胞的增生,并能诱导其凋亡,不同浓度PDGFR-α ASODN转染后能下调PDGFR-α mRNA的表达,PDGFR-α基因的ASODN靶向技术为PVR的基因治疗提供了实验依据.     

周细胞对缺氧诱导下视网膜微血管内皮细胞增生的影响

目的探讨视网膜微血管内皮细胞（RMECs）与共培养的周细胞（PCs）及PCs条件培养液（PCM）对常氧和缺氧条件下RMECs增生的影响。方法传代培养大鼠RMECs和PCs,采用兔抗鼠Ⅷ因子多克隆抗体和小鼠抗大鼠CD31单克隆抗体免疫组织化学法鉴定RMECs,PCs采用小鼠抗大鼠desmin多克隆抗体和兔抗鼠抗血小板衍生生长因子受体-β（PDGFR-β）进行免疫荧光双标鉴定。Millicell小室建立PCs和RMECs共培养系统,PCs培养近融合期后制备PCM,向共培养系统或PCM中加入终浓度为200μmol/L的CoCl2诱导形成细胞化学缺氧模型,观察常氧和缺氧条件下PCs和PCM对RMECs增生的影响。使用MTT法、3H-TdR掺入法检测RMECs在不同培养条件下的增生数量,并用流式细胞仪检测RMECs在不同细胞周期的细胞率。结果近融合期的RMECs呈类纺锤状、单层生长,可见明显的接触抑制,Ⅷ因子和CD31均阳性表达。PCs形状不规则,细胞重叠生长无接触抑制,PDGFR-β和desmin抗体双标阳性。缺氧3～9d缺氧RMECs单独培养组较常氧RMECs单独培养组各时间点的RMECs均明显增生,缺氧6d时增生达高峰（P〈0.01）,细胞生长抑制率（GIR）为-24.9%。缺氧共培养组较缺氧RMECs单独培养组RMECs增生下降（P〈0.05）。缺氧3、6、9d时常氧共培养组较常氧RMECs单独培养组RMECs数目均明显下降（P〈0.05,P〈0.01,P〈0.01）。缺氧6d时S期RMECs数量明显增加,占各期细胞总数的（43.9±0.8）%;常氧或缺氧共培养组,PCs均可抑制RMECs的增生,S期细胞分别占各期细胞总数的（3.6±0.1）%、（15.1±0.9）%（P〈0.05,P〈0.01）。常氧PCM组RMECs的吸光度（A）值和3H-TdR掺入量4～24h均低于对照组（P〈0.05）。结论缺氧和常氧条件下RMECs和PCs共培养时PCs均可抑制RMECs的增生,常氧条件下PCM可抑制RMECs的增生。     

美满霉素对损伤后大鼠视神经的保护作用

目的探讨美满霉素（minocycline）对大鼠视神经损伤后的保护作用。方法观察美满霉素对凋亡诱导因子（AIF）、胶质纤酸性蛋白（GFAP）表达的影响。取成年SD大鼠60只（右眼60只）,随机分为正常组、实验组、对照组,每组各20只（右眼20只）。后两组均制备右眼视神经钳夹伤模型,伤后1h分别给予45mg／kg美满霉素和等量生理盐水腹腔注射,此后1次／d。于伤后1、3、7、14d取材,观察视网膜组织形态学变化,利用计算机图像分析技术对经免疫组织化学染色后视网膜组织中AIF、GFAP表达的平均光密度值进行半定量检测。结果1d、3d、7d及14d实验组AIF表达水平较对照组降低（F1d=17．343、F3d=61．928、B7d=104．586、F14d=25．169,均P〈0．05）。3d、7d实验组GFAP表达水平较对照组明显降低（F3d=42．678、F7d=147．012,均P〈0．05）;14d实验组GFAP表达水平较对照组明显升高（F14d=11．773,P〈0．05）。结论美满霉素可能通过抑制视神经钳夹伤后视网膜组织中AIF的表达、GFAP的过度表达,而对损伤视神经起到抗凋亡和促修复作用。     

体外共培养诱导人羊膜间充质干细胞分化为眼表上皮细胞的研究

背景 人羊膜间充质干细胞（hAMSCs）在体外能诱导分化为多种体细胞,但目前有关hAMSCs分化为眼表细胞的研究鲜有报道. 目的 探讨体外共培养诱导hAMSCs向眼表细胞分化的可能性及其分化机制.方法 本研究经广州医科大学第二附属医院伦理委员会批准,在健康产妇的知情同意下从人胎盘中分离hAMSCs并进行培养,采用流式细胞术计数分析CD44、CD45、CD73、CD90在培养细胞中的表达以鉴定细胞,此外通过成骨诱导分化实验和成脂诱导分化实验对培养细胞进行体外分化鉴定.在患者知情同意下获取眼科手术中弃用的人眼球结膜组织,用组织块培养法分离和培养人球结膜成纤维细胞（hBCFs）,将hAMSCs与hBCFs在Transwell培养体系中进行共培养,分为hAMSCs培养组和hAMSCs与hBCFs共培养组,用含质量分数5％胎牛血清（FBS）的DMEM高糖/F12培养基培养7d,采用免疫荧光技术检测hAMSCs中对上皮细胞角蛋白19（CK19）的表达,评价hAMSCs向眼表细胞分化的程度,并检测hAMSCs中α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的表达,评价其分化过程与间质上皮化转换（MET）过程的关系.结果 传代至3～7代的hAMSCs均为细长形,但随着传代增加,细胞体积增大,细胞中CD44、CD73、CD90表达呈强阳性,但不表达CD45.经成骨或成脂诱导分化后3～4周,细胞中茜素红S（ARS）染色或油红O染色阳性.hAMSCs与hBCFs共培养后1周,hAMSCs形态由细长形变为类上皮细胞型,共培养组的部分细胞中CK19表达阳性,所有细胞α-SMA表达呈微弱阳性,而hAMSCs细胞培养组可见呈绿色荧光的α-SMA阳性细胞,但不表达CK19. 结论 通过体外共培养可诱导hAMSCs向人眼表细胞分化,其分化机制可能与MET过程相关.     

白藜芦醇对急性低压缺氧诱导的大鼠视网膜损伤的保护作用

目的　探讨白藜芦醇对急性低压缺氧诱导的大鼠视网膜损伤的保护作用及机制。方法　将72只健康SD大鼠随机分成3组:常氧对照组、低氧模型组、低氧+白藜芦醇（resveratrol,RES）干预组（RES干预组）。常氧对照组大鼠在常氧环境下喂养,低氧模型组及RES干预组大鼠置于低压氧舱内（模拟5000 m的海拔高度）喂养,RES干预组每日并给予腹腔注射30 mg·kg^-1 RES 1次。各组大鼠在不同处理7 d后剥离视网膜,免疫组织化学法观察大鼠视网膜组织中胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein,GFAP）和缺氧诱导因子-1（hypoxia-inducible factor-1,HIF-1）的表达,RT-PCR检测核转录因子-kappaB（nuclear factor-kappa B,NF-κB）和脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor,BDNF）mRNA的表达。结果　低氧模型组大鼠视网膜GFAP与HIF-1的表达较常氧对照组增加,BDNF mRNA（2.627±0.633）和NF-κB mRNA（1.712±0.198）的相对表达量较常氧对照组（2.000±0.518、1.053±0.483）上调（P= 0.013、0.008）。与低氧模型组对比,RES干预组视网膜受损程度减轻,GFAP与HIF-1的表达减少,BDNF mRNA相对表达量（2.053±0.938）显著下调,差异有统计学意义（P=0.024）,而NF-κB mRNA相对表达量（1.481±0.397）与低氧模型组相比,差异无统计学意义（P=0.455）。结论　RES对高海拔缺氧诱导的视网膜损伤有保护作用,其机制可能与调节GFAP、HIF-1、BDNF以及NF-κB的表达有关。