自身免疫性干眼调节T细胞及细胞因子的表达

目的：探究调节性T细胞在自身免疫性干眼发病中的作用,并对泪液系统内调节性T细胞及相关细胞因子的表达做出分析,为自身免疫性干眼病的治疗提供更加有效的治疗方案。

方法：单独培养提纯分离出的兔泪腺上皮细胞一段时间后,将其与分离出的外周血淋巴细胞以1：1的比例混合进行培养,并用5-脱氧尿嘧啶核苷(5-Bromo-2-deoxyUridine,BrdU)检测外周血淋巴细胞的增殖情况,将已激活的自体外周血淋巴细胞通过耳缘静脉回输供体兔体内,回输细胞后的供体兔将作为兔自身免疫性干眼模型组,未诱导发病的正常兔个体为对照组,观察实验前后兔角膜染色和2、4、6、8wk的泪膜破裂时间、泪液的分泌等情况,回输细胞4wk后处死,收集双侧上下泪腺和结膜,并进行病理HE染色,然后提取泪腺组织中的总RNA,检测IL-17、TNF-α、IL-6、TGF-γ的表达。

结果：BrdU检测出的外周血淋巴细胞增值比率为3.72,激活的外周血淋巴细胞回输体内会诱导产生兔自身免疫性干眼,与正常组比较,泪膜破裂时间减少,且差异具有统计学意义(P<0.05); 模型组较对照组泪液分泌显著减少,且差异具有统计学意义(P<0.05); HE染色显示在回输细胞4wk后,结膜组织和泪腺均有淋巴细胞浸润,检测发现模型组IL-17、TNF-α、IL-6、TGF-γ的表达较对照组均有所增加,但IL-10、TGF-β的表达较对照组有所降低,且差异具有统计学意义(P<0.05); 流式细胞术检测表明,在对照组中,泪腺组织和脾脏中CD4⁺CD25⁺Treg细胞比例较高,模型组CD4⁺CD25⁺Treg细胞比例有所降低,且差异具有统计学意义(P<0.05)。

结论：兔干眼模型发病时,CD4⁺CD25⁺Treg细胞免疫抑制作用下降,IL-17、TNF-α、IL-6、TGF-γ等细胞因子在泪腺的炎症反应中都发挥着重要作用。     

实验性自身免疫性葡萄膜炎小鼠T细胞变化的动态研究

目的：了解实验性自身免疫性葡萄膜炎(experimental autoimmune uveitis, EAU)不同进展阶段小鼠T细胞动态变化,对葡萄膜炎治疗方案的优化及疗效评价提供指导。

方法：用CFA+PTX+IRBP对6～10周龄雌性C57BL/6小鼠后肢及尾部皮下进行三点免疫建立EAU模型,于免疫3,7,14,21,28d取外周血行流式细胞术检测。

结果：用特异性抗原IRBP免疫后,EAU疾病在第14d左右产生,在第21d达最高峰,以后开始逐渐缓解。随着EAU疾病的发生,CD4⁺CD25⁺调节性T细胞、CD4⁺CD3⁺辅助T细胞数量均有增加,CD4⁺CD25⁺调节性T细胞增加更为明显,CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺调节性T细胞数量第21d达到高峰,第28d开始下降,CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺/CD4⁺CD25^-Foxp3⁺比值从第3d开始逐渐增加,到第21d达到高峰,从第28d开始下降。

结论：EAU疾病的发生和转归与CD4⁺CD25^+/-Foxp3⁺Treg细胞密切相关,CD4⁺CD25^+/-Foxp3⁺Treg细胞为阐明EAU的缓解机制、预防和治疗人类葡萄膜炎提供了新思路。     

荧光染色法在实验性异种角膜移植术后免疫诊断中的应用

目的:采用单克隆抗体间接免疫荧光法测定异种角膜移植术后不同时间点角膜组织中CD4,CD8T淋巴细胞的变化。方法:取正常兔角膜、腋窝淋巴结组织;鸵鸟-兔异种角膜移植术后1,2wk角膜组织,经甲醛固定,常规石蜡包埋切片脱蜡复水,胃酶消化法进行抗原修复,用鼠抗兔CD4,CD8单克隆抗体及荧光标记的羊抗鼠IgG进行免疫组化测定,荧光显微镜下观察角膜组织中CD4+,CD8+T淋巴细胞的表达。结果:鸵鸟-兔异种角膜移植后1wk角膜组织中CD4+,CD8+T淋巴细胞的表达为阴性,2wk时T淋巴细胞CD4呈强阳性表达,CD8呈阴性表达。结论:采用间接免疫荧光法测定动物异种角膜移植术后不同时间点局部角膜组织中CD4+,CD8+T淋巴细胞的表达,为异种角膜移植排斥反应机制研究及术后药物筛选奠定实验基础。     

年龄对水合氯醛诱导的小鼠可逆性晶状体混浊及Na+-K+-ATP酶表达的影响

目的：探究年龄对水合氯醛诱导的小鼠急性可逆性晶状体混浊及Na⁺-K⁺-ATP酶表达的影响。

方法：青年(3月龄)和老年(24月龄)C57BL/6小鼠各12只,4%水合氯醛(400mg/kg)腹腔注射诱导急性可逆性晶状体混浊。在注射后10、20、30、45、60、90、120、150min分别应用裂隙灯观察晶状体混浊程度,根据晶状体混浊评价系统记录混浊程度分级情况并拍照。苏木素-伊红(HE)染色观察晶状体病理改变,免疫组织化学染色检测晶状体Na⁺-K⁺-ATP酶表达。

结果：水合氯醛注射后两组小鼠晶状体混浊和消退过程相似,但青年组小鼠晶状体混浊出现早、持续时间略长,混浊厚重,呈乳白色; 老年组小鼠晶状体混浊出现晚,持续时间略短,混浊轻薄,呈薄雾状。HE染色显示水合氯醛注射后晶状体上皮细胞(LECs)下皮质聚集大量水泡,浅层晶状体纤维细胞结构紊乱。免疫组织化学染色显示LECs及纤维Na⁺-K⁺-ATP酶的表达呈现阳性,水合氯醛注射前青年组和老年组小鼠LECs中Na⁺-K⁺-ATP酶表达较弱,注射后45min LECs中Na⁺-K⁺-ATP酶的表达上调,且老年组小鼠LECs的Na⁺-K⁺-ATP酶上调更为显著。

结论：年龄影响水合氯醛诱导小鼠急性可逆性晶状体混浊,Na⁺-K⁺-ATP酶参与水合氯醛诱导的晶状体混浊。     

Notch信号通路调控CD4+T细胞分泌IL-22在Vogt-小柳原田综合征中的作用

目的：观察Notch受体和IL-22在Vogt-小柳原田(VKH)综合征患者中的表达变化,探讨Notch信号通路对VKH综合征患者CD4⁺T细胞分泌IL-22的调控作用。

方法：选取VKH综合征患者35例(活动期15例和静止期20例)和健康对照者12例,分选血浆和CD4⁺T细胞,qRT-PCR和Western blot法检测Notch受体,ELISA法检测血浆IL-22表达,流式细胞术检测Th17和Th22的比例。观察抑制Notch信号通路对VKH综合征患者CD4⁺T细胞转录因子相对表达量和IL-22分泌水平的变化。

结果：活动期VKH综合征患者CD4⁺T细胞中Notch1～3较静止期和健康对照者显著升高。活动期VKH综合征患者血浆IL-22及Th17、Th22水平高于静止期和健康对照者。抑制Notch信号通路可导致活动性VKH综合征患者CD4⁺T细胞中AhR mRNA降低,分泌IL-22水平降低。

结论：Notch-AhR-IL-22信号通路可能参与了VKH综合征的发病。     

地塞米松对液氮深低温保存猪角膜浸润细胞的影响

目的：本实验结合液氮深低温冻存技术与地塞米松预处理方法,研究其对猪角膜免疫原性影响情况及可能机制。

方法：选择新鲜猪角膜,以13mm直径环钻制取角膜标本,依次放入四种冷冻保护液中冷平衡,“简化四步法”程序降温后放入液氮中保存,使用前40℃水浴复温。地塞米松作用组以同法制备植片,前三步冷平衡同前,最后分别放入含0.01,0.03,0.05mg/mL地塞米松保护液中4℃孵育18h,再程序降温液氮冻存。BALB/c小鼠50只,随机分为阳性对照组(新鲜组)、程序冻存组、地塞米松程序冻存组Ⅰ、地塞米松程序冻存组Ⅱ和地塞米松程序冻存组Ⅲ,每组10只。各组角膜植入到BALB/c小鼠背部皮下,术后14d取出,做石蜡包埋,HE染色、CD25和FasL免疫组化染色,光镜观察。

结果：术后14d剖取角膜植片,见植片与周围组织粘连,植片明显肿胀,半透明,色微黄。HE染色结果：新鲜组角膜植片全层有大量淋巴细胞浸润; 程序冻存组角膜浸润细胞较新鲜组减少,多位于内皮和上皮层分布; 地塞米松作用各组细胞浸润数最少。免疫组化显示：新鲜组植片CD25⁺和FasL⁺浸润细胞数最多,与程序冻存组、各地塞米松作用组比较有明显统计学差异。程序冻存组CD25⁺和FasL⁺浸润细胞数多于各地塞米松作用组,比较有显著性差异。各地塞米松作用组CD25⁺和FasL⁺浸润细胞数差异比较无统计学意义。

结论：地塞米松作用组角膜免疫原性最低。各地塞米松作用组角膜免疫原性在0.01～0.05mg/mL范围内无浓度依赖效应。     

生物工程角膜移植术后排斥反应的临床及免疫病理观察:附5例报告

目的：对生物工程角膜移植术后发生免疫排斥反应患者进行激光共焦显微镜观察和免疫病理研究,初步探究生物工程角膜移植排斥反应的发生机制。

方法：回顾性病例研究。纳入2018-09/2020-12我院收治的感染性角膜炎行生物工程角膜移植术后发生免疫排斥患者5例5眼。裂隙灯检查角膜透明度、角膜新生血管; 激光共焦显微镜对角膜进行动态观察,记录免疫排斥反应后角膜上皮下朗格罕氏细胞和基质炎症细胞密度,并以对侧眼作为对照进行统计分析。行同种异体角膜移植时取下生物工程角膜,免疫组织化学染色后对CD4⁺细胞和CD8⁺细胞及炎症细胞的浸润和分布进行观察。

结果：激光共焦显微镜显示,术眼角膜上皮下可见大量活化郎格罕氏细胞,其活化比例与对侧眼比较有差异(χ²=38.29,P<0.001)。基质层大量炎症细胞,与对侧眼比较具有差异(t=32.5,P<0.05)。对生物工程角膜组织进行免疫组织化学染色和HE染色,角膜基质层均可见CD4⁺细胞和CD8⁺细胞,仅1眼角膜基质层可见大量嗜酸性粒细胞。

结论：生物工程角膜移植术后免疫排斥反应经免疫病理证实以T细胞介导的细胞免疫在发病机制中具有重要作用,对异种抗原的超敏反应可能参与其中。     

鸵鸟角膜对兔板层角膜移植的排斥反应

目的：角膜穿孔属眼科急症，角膜外伤、感染和化学伤都可引起角膜穿孔，用角膜移植治疗穿孔效果较好，但角膜供体资源在我国目前仍较为缺乏。角膜移植排斥反应是造成移植失败的主要原因。为探索异种角膜移植材料，本实验研究鸵鸟对兔板层角膜移植的植片存活时间及排斥反应特点，以便评价鸵鸟角膜的应用前景。方法：将24只≤8周龄的健康新西兰白兔随机分成两组：A组12只兔为兔一兔同种异体板层移植组；B组12只兔为鸵鸟一兔异种角膜板层移植组，治疗及观察时间均为6wk。两组术后均予结膜下注射地塞米松。术后每日在裂隙灯显微镜下观察植片存活情况和排斥反应指数；术后每周测量新生血管面积；术后1，3，5wk各组取1只兔的术眼角膜行病理检查。结果：鸵鸟板层角膜植片的平均存活时间为23d。驼鸟一兔异种板层和同种板层角膜在1，2wk排斥反应指数及角膜新生血管面积无显著差异，第3wk起差异显著。结论：鸵鸟角膜植片在移植早期能保持透明，且有较好的生物相容性。鸵鸟角膜植片后期因新生血管生长和排斥反应加重而混浊，说明单独应用地塞米松不能完全控制异种植片的排斥反应。     

纤维蛋白粘合剂粘贴双层基质透镜行兔板层角膜移植术

目的：研究纤维蛋白粘合剂(FS)粘贴的双层角膜基质透镜体内生物相容性,探讨使用该种材料行角膜移植的可行性。

方法：选取健康清洁级新西兰白兔15只,采用自身对照,以兔右眼为实验眼,左眼为对照眼。实验眼使用FS粘贴的双层角膜基质透镜作为移植材料行板层角膜移植手术,对照眼不进行人工干预。分别于术后7、14、28d使用手持裂隙灯观察双眼角膜情况,并进行生物相容性评分,同时取双眼角膜行HE染色进行组织病理学检测,观察角膜恢复情况。

结果：裂隙灯观察结果显示,至角膜移植术后28d,实验眼角膜上皮生长情况良好,角膜透明度基本恢复,水肿程度减轻,新生血管生长至角膜缘后未加重,未见上皮、内皮排斥线等排斥反应; 对照眼角膜透明,角膜上皮光滑。生物相容性评分结果显示,角膜移植术后实验眼角膜植片水肿程度逐渐减轻,透明度逐渐恢复,排斥反应较小,角膜植片的生物相容性较好; 至术后28d,实验眼和对照眼角膜透明度、水肿程度及新生血管生长程度均无差异(P>0.01)。组织病理学检测结果显示,至角膜移植术后28d,实验眼植片表面有4～5层角膜上皮细胞覆盖,角膜胶原排列整齐、规则,植片内未见明显炎性细胞浸润,双片透镜间分界消失,层间FS被机体完全吸收,植片与植床融合,未见明显分界。

结论：使用FS粘贴的双层角膜基质透镜作为植片行板层角膜移植术后恢复较好,排斥反应较小,生物相容性较好,可用于板层角膜移植。     

纤维蛋白胶对眼表的作用

目的观察以纤维蛋白胶（FG）为载体构建兔角膜上皮、基质和内皮细胞片,以及FG对兔结膜和角膜的黏合作用。方法在培养板孔底制作薄层和厚层FG,将培养兔角膜3种细胞分别接种于FG表面,观察细胞生长情况。FG对兔结膜的黏合研究：分为A组（结膜原位粘合组）,B组（结膜移位粘合组）,对照组（单纯切除结膜植片）,每组5只眼,观察结膜组织黏合情况。FG对兔角膜的黏合研究：3例兔前板层角膜移植术,先用10—0尼龙线间断缝合4针固定植片,再用FG黏合,将植片固定于植床。结果角膜3种细胞在薄层和厚层FG表面生长良好：角膜上皮细胞可形成单层和复层;角膜基质细胞间网状连接;角膜内皮细胞排列紧密。对兔结膜的黏合研究：A组和B组植片与植床对位良好,紧密黏合。组织切片显示术后第4周A组和B组结膜上皮完整,炎症基本消退。对照组结膜上皮有局部脱落区,纤维层局部显示瘢痕组织结构特征。兔前板层角膜移植术后3个月,植片与受体角膜愈合良好。结论FG可作为角膜3种细胞的生长载体构建细胞片。FG对兔结膜和角膜组织有良好的黏合作用。     

CD4+CD25+调节性T细胞在Graves眼病患者外周血中的表达

目的:通过检测CD4+CD25+调节性T细胞在Graves眼病患者外周血中的表达,以观察该病患者外周血中CD4+CD25+调节性T细胞的变化规律。方法:临床实验研究。采用流式细胞术检测对Graves病不伴有眼征患者组(53例),Graves眼病患者组(51例),正常对照组(51例)的外周静脉血CD4+CD25+Treg细胞比例进行检测。结果:与正常对照组比较,Graves病不伴有眼征患者组Treg水平下降(P<0.01);与正常对照组比较,Graves眼病患者组外周血Treg水平显著下降(P<0.01);Graves眼病患者组外周血Treg数量明显低于Graves病不伴有眼征患者组(P<0.01)。结论:Graves眼病患者外周血中CD4+CD25+Treg在淋巴细胞中所占的比例降低,存在自身免疫调节紊乱。可能是其机体细胞免疫抑制受损的重要机制,为对该疾病进行免疫学治疗提供了新线索。     

PDR患者外周血CD4+CD25+T细胞和相关基因FOXP3的变化及临床意义

目的：探讨增殖性糖尿病视网膜病（ proliferative diabetic retinopathy,PDR）患者外周血CD4＋CD25＋T细胞及相关基因FOXP3表达变化意义,观察其在PDR发病中的临床意义。
　　方法：采用流式细胞术检测PDR患者及正常对照外周血CD4＋CD25＋T细胞比例,Q－PCR测PDR患者、糖尿病和正常人中 FOXP3, IL－17和CTLA－4的 mRNA 表达,并用Wilcoxon秩和检验和直线相关分析法分析PDR患者糖化血红蛋白、年龄、血脂、肾功能的临床资料及它们之间相关度。
　　结果：PDR患者CD4＋T细胞降低,CD4＋CD25＋T无显著差异,FOXP3和CTLA－4在PDR中下降, IL－17增高。 CD4＋T细胞与年龄相关,CD4＋CD25＋T与患者的血肌酐存在正相关性,CD4＋CD25＋T细胞水平与年龄、糖化血红蛋白、血脂、血肌酐（ Cr）、尿素氮（ BUN）均无明显相关性。 PDR患者糖化血红蛋白、甘油三酯、总胆固醇、低密度脂蛋白均高于正常值。
　　结论：CD4＋CD25＋T细胞可能参与PDR的发病机制,并且血脂异常提示PDR可能与血脂相关。     

OVA-specific CD8+T cells do not express granzyme B during anterior chamber associated immune deviation

Purpose To examine antigen (Ag)-specific CTL response during anterior chamber associated immune deviation (ACAID).Methods OVA or OVA257-264 peptide was injected into the anterior chamber (AC) of C57BL/6 mice. There were 16 mice in each ACAID group induced with OVA or OVA257-264 peptide. The mice were primed by SC injection with OVA or OVA 257-264 peptide in complete Freund’s adjuvant (CFA) on day 7. Ag-specific CD8⁺T cells in spleens were analyzed on day 14 using Pentamer H-2K^b-SIINFEKL(OVA257-264 peptide). IFN-γ ELISPOT and intracellular granzyme B staining were used to characterize the CTL response. Twelve mice in each group immunized with OVA or OVA257-264 peptide in CFA served as positive controls. Twelve normal mice served as negative controls and 12 receiving injection of CFA as CFA controls for studying the influence of CFA on the Ag-specific CTL response.Result The results showed that anterior chamber inoculation of OVA or OVA257-264 peptide could induce ACAID as evidenced by an impaired DTH response. The frequency of Ag-specific CD8⁺T cells in ACAID mice was not different from that in mice challenged with Ags in CFA only (positive controls). IFN-γ production by these cells in ACAID mice was not different compared to positive controls. However, Ag-specific CD8⁺T cells in ACAID mice failed to secrete granzyme B. Mice challenged only with OVA peptide and CFA also showed a granzyme B negative CD8⁺T cell response. Ag-specific CTL response induced by CFA alone was similar with the negative control.Conclusion These results show that the frequency of Ag-specific CD8⁺T cells is not altered during ACAID. The Ag-specific CTL response during ACAID is characterized by the absence of granzyme B expression.This study was supported by the Fund for Innovative Research Groups of China (30321004), National Natural Science Foundation (30572004) and Natural Science Foundation for Research Groups of Guangdong Province (2005-04).     

板层角膜移植术联合前房注药治疗真菌性角膜溃疡

目的:总结板层角膜移植术联合前房注药治疗真菌性角膜溃疡的效果。方法:对照组:临床上确诊为真菌性角膜溃疡并行板层角膜移植术的患者;试验组:行板层角膜移植术,并于术中,术后第3,10d前房注入氟康唑0.1mL(0.05mL 2g/L氟康唑+0.05mL生理盐水)的真菌性角膜溃疡患者。结果:随访观察3~6mo,对照组复发率11%,试验组均未见复发。结论:板层角膜移植术联合前房注药是治疗真菌性角膜溃疡的有效方法,并可有效降低术后复发率。     

Observation on ultrastructure and histopathology of cornea following femtosecond laser-assisted deep lamellar keratoplasty for acute corneal alkaline burns

AIM: To demonstrate the changes in ultrastructure and histopathology of the cornea in acute corneal alkaline burns after femtosecond laser-assisted deep lamellar keratoplasty. METHODS: The New Zealand white rabbits treated with alkaline corneal burn were randomized into two groups, Group A (16 eyes) with femtosecond laser-assisted deep lamellar keratoplasty 24h after burn and Group B (16 eyes) without keratoplasty as controls. All eyes were evaluated with transmission electron microscopy (TEM) at 1, 2, 3, and 4wk follow-up, then all corneas were tested by hematoxylin and eosin staining histology. RESULTS: The corneal grafts in Group A were transparent, while those in Group B showed corneal stromal edema and loosely arranged collagen fibers. One week after treatment, TEM revealed the intercellular desmosomes in the epithelial layers and intact non-dissolving nuclei in Group A. At week 4, the center of the corneas in Group A was transparent with regularly arranged collagen fibers and fibroblasts in the stroma. In Group B, squamous cells were observed on the corneal surface and some epithelial cells were detached. CONCLUSION: Femtosecond laser-assisted deep lamellar keratoplasty can suppress inflammatory responses, prevent toxic substance-induced injury to the corneal endothelium and inner tissues with quicker recovery and better visual outcomes.