布雷菲尔德菌素A经内质网应激途径诱导的肝癌细胞HepG2发生p53依赖性死亡

目的探讨布雷菲尔德菌素A(BFA)作为肝脏肿瘤治疗药物的作用机制和可能的临床应用价值。方法采用细胞毒性试验(MTT法)观察BFA对肝癌细胞Hep G2的细胞毒性作用,采用定量荧光PCR法、蛋白杂交法观察BFA对Hep G2细胞有关囊泡转运相关、内质网应激相关基因和蛋白表达的影响。结果用不同浓度的BFA处理肝癌细胞24 h和48 h后,可引起肝癌细胞死亡,并呈现剂量依赖关系。(0.1~5)μg/m L BFA处理组细胞存活率与阴性对照组比较,差异具有统计学意义(24 h和48 h的H值分别为45.7和45.9,P<0.01)。2.5μg/m L BFA可引起HepG2细胞内COPI、Arf1、COPII和Sar1b的基因表达显著升高(24 h实验组的F值分别为72.5、41.4、107和134,P<0.05;48 h实验组的F值分别为69.2、51.4、49.8和170,P<0.05)。2.5μg/m L BFA处理24 h、48 h后可引起HepG2细胞内BiP(GRP78)和calnexin基因表达水平明显升高,其中BiP(GRP78)在24 h和48 h的基因表达分别为阴性对照组的46倍和36倍,calnexin在24 h和48 h的基因表达分别为对照组的10倍和5倍。2.5μg/m L BFA处理24 h、48 h后可引起HepG2细胞内Bi P(GRP78)蛋白表达明显升高,约为对照组的2倍,calnexin的表达明显减少,几乎无法检测到。2.5μg/m L BFA引起HepG2细胞内p-AMPKα(Thr 172)和p-p53蛋白表达明显增加。结论BFA可通过内质网应激途径引起肝癌细胞发生p53依赖的死亡,对肝癌细胞有一定的杀伤作用。     

氯乙烯暴露工人淋巴细胞P53基因mRNA表达

目的探讨氯乙烯(VCM)暴露工人外周血淋巴细胞P53mRNA表达的变化,分析P53基因表达与VCM暴露量以及P53基因多态的关系。方法以VCM1年的75名工人为暴露组,以43名无VCM以及其他毒物接触史的本地志愿者为对照组,实时定量PCR嵌合荧光法(SYBR Green I染料法)检测P53基因mRNA表达量。结果VCM暴露组和对照组P53 mRNA相对表达量(2-△Ct×102)的中位数及上、下四分位数分别为0.467(0.097,1.816)和1.640(0.960,2.680),经稳健线性回归分析排除年龄因素的影响,2组表达量差异有统计学意义(χ2=53.42,P0.000 1)。按累计接触剂量将暴露人群分为高接触组和低接触组,2组P53基因表达差异无统计学意义(P=0.966)。P53基因3个多态位点不同基因型对其mRNA表达量无明显影响(P0.05)。结论VCM暴露会引起机体P53mRNA表达量降低。     

P53、P21^WAF/CIP1和Cyclin D1基因蛋白在沥青烟暴露小鼠肺组织中的表达

[目的]探讨沥青烟对小鼠肺组织形态及基因蛋白P53、P21^WAF/CIP1和Cyclin D1表达的影响。[方法]建立沥青烟亚急性染毒小鼠模型，将120只昆明种健康小鼠随机分为3组，即1个对照组和2个染毒组，染毒组进行不同浓度（55、165mg,／m^3）和不同时间（30、60d）染毒，光镜下观察肺组织形态改变，采用免疫组化S-P法，对P53、P21、Cyclin D1染色，观察P53、P21和Cyclin D1基因蛋白表达。[结果]不同浓度、不同时间染毒小鼠肺组织形态有不同程度改变，高浓度染毒组出现不典型增生。小鼠肺组织P53基因蛋白表现为低浓度染毒30d组，未见阳性表达；高浓度染毒60d组呈强阳性表达（P〈0．01）。P21^WAF/CIP1基因蛋白表达低浓度染毒30d呈阳性表达；高浓度染毒60d组表达明显下调（P〈0．01）。Cyclin D1基因蛋白表达同P53基因蛋白表达。[结论]随着染毒浓度和染毒时间的增加，肺组织增生逐渐明显，P53和Cyclin D1基因蛋白的表达呈上升趋势，P21^WAF/CIP1呈下降趋势。     

C-erbB2、P53表达与子宫内膜样腺癌的临床意义研究

目的:探讨C-erbB2和P53表达与子宫内膜样腺癌侵袭、组织分化和转移的关系。方法:应用S-P免疫组化法对38例原发性子宫内膜样腺癌组织进行了C-erbB2和P53检测。结果:C-erbB2和P53在子宫内膜样腺癌中阳性表达率分别为57.9%和55.3%,而在正常子宫内膜组织中无表达;C-erbB2表达与子宫内膜样腺癌的手术-病理分期、组织分化相关(P<0.05),P53表达与子宫内膜样腺癌的手术-病理分期相关(P<0.05),而与组织分化无关(P>0.05);C-erbB2表达与P53表达呈正相关(P<0.01)。结论:C-erbB2和P53表达对判断子宫内膜样腺癌的恶性程度、预测肿瘤侵袭转移和评估预后是一种良好指标。     

普鲁卡因酰胺诱导肝癌细胞启动子区甲基化的GSTP1基因重新表达

目的　研究HepG2肝癌细胞GSTP1基因启动子区甲基化与GSTP1基因表达的关系 ,并探讨普鲁卡因酰胺用于诱导因甲基化失活的GSTP1基因重新表达的可能性。方法　分别用 5 -杂氮 - 2′ -脱氧胞苷 (5 -Aza -CdR)和普鲁卡因酰胺处理HepG2细胞后培养 ,甲基化特异性PCR(MSP)检测细胞中GSTP1基因的甲基化状况 ,RT -PCR和Westernblot分别检测细胞中GSTP1mRNA和GST -π的表达。结果　HepG2细胞在去甲基化药物处理前 ,GSTP1基因完全甲基化 ,GSTP1基因不表达 ;药物处理后 ,普鲁卡因酰胺组和 5 -Aza -CdR组GSTP1基因有表达。结论　肝癌细胞GSTP1基因启动子区甲基化可抑制GSTP1基因表达 ,普鲁卡因酰胺与 5 -Aza -CdR一样能使启动子区甲基化的GSTP1基因重新表达     

葡多酚对乳腺癌细胞P38MAPK信号传导通路的影响

目的:探讨葡多酚(grape proanthocyanidins,GPC)对P38MAPK(P38 mitogen-activated protein kinase,P38 MAPK)信号转导通路的影响。方法:将接种EMT-6乳腺癌细胞的BALB/C小鼠分别经口灌胃给予10、100、200mg/kg bw GPC,连续2w。用Western blot方法检测肿瘤组织磷酸化P38MAPK蛋白和MMP-2蛋白的表达水平。结果:肿瘤对照组和200mg/kgGPC组的磷酸化P38MAPK蛋白表达水平(相对灰度值)分别为1.16±0.18和0.58±0.12,MMP-2蛋白表达水平分别为0.98±0.04和0.69±0.04,差别均有显著性意义(P<0.05)。结论:GPC对乳腺癌P38MAPK信号转导通路的活化和MMP-2蛋白的表达均有一定抑制作用。     

ShRNA抑制gankyrin基因在肝癌细胞中表达的研究

目的 构建靶向癌基因gankyrin的短发夹状RNA （shRNA），观察其在肝癌细胞株HepG2中对gankyrin基因表达的抵制作用。方法 设计、合成三对针对gankyrin的shRNA序列，连接到带有人U6启动子的载体质粒pGenesil-1中，构建重组质粒pGenesil-1-Gandyrinl、pGenesil-1-Gankyrin2、pGenesil-1-Gankyrin3，稳定转染HepG2细胞，采用RT-PCR及Western blot检测对gandyrin表达的抵制效果。结果 酶切分析和测序证实pGenesil-1-Gankyrinl、pGenesil-1-Gankyrin2、pGenesil-1-Gankyrin3构建成功；其中pGenesil-1-Gankyrin2、pGenesil-1-Gankyrin3对gankyrin的表达有明显的抵制作用。结论 构建的pGenesil-1-Gankyrin重组质粒能有效抵制gankyrin基因在肝癌细胞株HepG2中的表达。     

CYP1A2基因在三氯乙烯毒性中的作用研究

[目的]应用分子克隆技术,建立CYP1A2基因沉默细胞株和CYP1A2基因高表达细胞株,研究CYP1A2基因对三氯乙烯毒性的影响.[方法]将三氯乙烯分别染毒L02肝细胞、CYP1A2基因沉默细胞和CYP1A2基因高表达细胞,染毒剂量分别为0.25 mmol/L、0.50 mmol/L、1.00 mmol/L、2.00 mmol/L和4.00 mmol/L,以DMSO作为对照溶剂,染毒12 h,观察凋亡基因(Bcl-2、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9)和癌基因(c-fos、c-myc、k-ras、P53)表达水平.[结果]三氯乙烯染毒CYP1A2基因沉默细胞后,Bcl-2的mRNA表达水平高于对照组(P＜0.01),三氯乙烯部分剂量组凋亡基因Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9和癌基因c-fos、c-myc表达水平低于对照组(P＜ 0.05或P＜0.01).三氯乙烯染毒CYP1A2基因高表达细胞后,Bcl-2的mRNA表达水平相比对照组下降(P＜0.01),Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9 mRNA表达水平相比对照组升高(P＜0.01); CYP1A2高表达细胞中癌基因c-fos、c-myc、k-ras表达水平高于对照组(P＜0.01),P53表达水平低于对照组(P＜0.01).[结论]在体内代谢与CYP1A2存在密切关系,沉默CYP1A2基因可以减少三氯乙烯在肝细胞内代谢活化,导致三氯乙烯对凋亡基因和癌基因表达水平下降;三氯乙烯在CYP1A2基因高表达细胞中,表现出对凋亡基因和癌基因的促进表达作用.     

MAPK8基因在小鼠源性3T3-Ll脂肪细胞诱导分化中表达水平的变化

[目的]观察小鼠源性3T3-L1脂肪前体细胞诱导分化过程中MAPK8基因表达水平的变化,探讨MAPK8基因与肥胖发生之间的关系.[方法]体外培养3T3-L1前体脂肪细胞,在诱导3T3-L1脂肪细胞分化成熟的不同时段,采用RT-PCR技术检测脂肪细胞中MAPK8基因的mRNA表达水平.[结果]MAPK8基因高表达于3T3-L1脂肪前体细胞中,随细胞分化成熟该基因表达水平逐渐下调.MAPK8基因表达水平除在诱导分化前至第4 d、第2～5 d、第6～10 d时段内差异无显著性外,其余各时段间差异均有显著性(P＜0.05).[结论]MAPK8基因与肥胖发生有关,在3T3-L1细胞分化过程中表达逐渐下调可能有利于脂肪细胞的分化成熟和脂质积聚.     

普伐他汀对人肝癌细胞株HepG2增殖及侵袭能力影响的初步研究

目的 观察普伐他汀(Pra)抑制肝癌细胞株HepG2增殖及侵袭、运动的作用及机制.方法 培养HepG2细胞,以四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法测定不同浓度Pra对HepG2细胞增殖的抑制效应,并与对照组作比较.以Matrigel侵袭实验和迁移实验检测Pra对HepG2细胞的侵袭、运动能力的影响;p38活性试剂盒测定p38活性;Western印迹法测定磷酸化p38(p-p38)、丝裂原活化蛋白激酶磷酸酶1(MKP-1)、RhoC及基质金属蛋白酶2(MMP-2)表达.结果 MTT比色法及Matrigel侵袭和迁移实验显示,Pra明显抑制HepG2细胞增殖及侵袭、运动能力;Pra可抑制p38活性,并抑制p-p38、RhoC及MMP-2表达,同时上调MKP-1表达.以0.01 g/LPra组为例,其抑制HepG2细胞增殖率为(89.51±9.55)%,对照组为100.00%(F=19.76,P＜0.05);对p38活性的影响:0.01g/L Pra组为p38活性为(87.45±8.22)%,对照组为100.00%(F=22.29,P＜0.05).结论 Pra通过抑制p38活性及p-p38表达、提高MKP-1表达,抑制肝癌HepG2细胞株增殖,并通过下调RhoC及MMP-2表达,抑制其侵袭、运动能力.     

紫外线照射致皮肤P53抑癌基因诱变的研究

选择不同紫外线暴露量人群４５例，采用单链构象多态性分析对暴露部位皮肤ＤＮＡ进行Ｐ５３基因第七外显子突变检测，并采用１０例Ｂｏｗｅｎ病病变皮肤为对照。结果Ｂｏｗｅｎ病例检出Ｐ５３抑癌基因诱变阳性２例（２／１０），但不同紫外线暴露量的人群无一例诱变阳性。结果提示Ｐ５３基因突变可能在癌前期发生，但其出现不早于癌前期。     

弓形虫P30基因在大肠杆菌中的表达研究

将编码弓形虫主要表面膜抗原（Ｐ３０）基因插入原核表达载体ｐＧＥＭＥＸ１的Ｔ７启动子下游,构建的重组质粒ｐＧＥＭＥＸ１／Ｐ３０转入宿主菌Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）。用ＩＰＴＧ诱导Ｐ３０基因表达,ＳＤＳＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ实验表明重组子能够表达３０ｋＤ蛋白,表达产物可以和兔抗弓形虫阳性血清特异性结合,具有较好的免疫原性。     

广西16株狂犬病毒P基因序列分析

目的分析广西16株狂犬病毒P基因序列特点,探讨广西狂犬病高发的可能原因。方法 2005-2008年在广西14个市采集健康犬脑标本3 961份,用直接免疫荧光法（DFA）和RT-PCR法检测狂犬病毒,P基因PCR扩增阳性者进行序列测定和分析。结果 16株狂犬病毒完成P基因序列测定,核苷酸及氨基酸同源性分别为86%-100%和93%-100%,属于基因Ⅰ型狂犬病毒;广西境内至少存在3条狂犬病毒传播链;16株狂犬病毒P基因序列推导的氨基酸序列多个位点发生变异。结论广西存在多个Ⅰ型狂犬病毒株系的流行,可能是近几年广西狂犬病持续高发的原因之一。     

恶性卵巢上皮肿瘤的P53基因点突变及其意义

目的 为揭示P53抗癌基因与卵巢上皮肿瘤发病学的关系，对P53基因5—8外显子突变进行了检测。方法 采用聚合酶链反应—DNA单链构象多态性分析法，以同期良性卵巢上皮肿瘤作对照组。结果 30例卵巢良性上皮肿瘤中P53基因突变3例(10％)；而50例恶性卵巢上皮肿瘤中发生突变19例(38％)，经x^2检验，差异有显著性(P＜0．05)。但不同组织学分级时P53基因点突变差异不显著(P＞0．05)。结论 恶性卵巢上皮肿瘤P53基因5—8外显子点突变发生率，明显高于卵巢良性上皮肿瘤，该种突变可能与恶性卵巢上皮肿瘤的发生有关。但P53基因5—8外显子点突变与组织学分级天关。     

P~(53)基因对染尘肺泡巨噬细胞作用下成纤维细胞增殖的影响

采用脂质体介导的基因转移技术,将外源野生型Ｐ５３基因转染染尘肺泡巨噬细胞（ＡＭ）作用下的体外培养的人胚肺二倍体成纤维细胞（２ＢＳ）,观察其细胞增殖活力及羟脯氨酸含量变化。结果显示：转染Ｐ５３基因后,２ＢＳ细胞的增殖能力明显低于未转染Ｐ５３的对照细（Ｐ＜００５）,羟脯氨酸含量变化不明显。因此提示：野生型Ｐ５３基因对染尘ＡＭ作用下的２ＢＳ细胞增殖有一定抑制作用。     

砷接触工人尿甲基砷酸水平与P53基因损伤的关系

[目的]观察砷职业暴露人群尿甲基砷酸水平与P53基因损伤的关系,深入认识砷的遗传毒性。[方法]选取砒霜厂95名砷接触工人作为暴露组,另选对照组55人,采集外周血和晨尿。用氢化物发生原子吸收分光光度法检测尿中各形态砷化合物和总砷含量,并计算一、二级甲基化指数。实时荧光定量PCR扩增人群外周血淋巴细胞P53基因外显子5和8,通过循环阈值推算损伤后扩增效率,间接计算损伤指数。[结果]暴露组工人尿中无机砷（iAs）、甲基砷酸（MMA）、二甲基砷酸（DMA）均明显高于对照组;暴露组工人二级甲基化指数明显低于对照组;暴露组工人P53基因外显子5和8的损伤指数均明显高于对照组;尿中砷一级甲基化指数与P53基因第5外显子损伤指数存在明显的正相关,尿中砷二级甲基化指数与P53基因第5外显子损伤指数存在明显的负相关。[结论]职业砷暴露工人二级甲基化指数明显增加,体内存在较多甲基砷酸,可能是P53基因外显子5损伤的主要原因。     

外周血P53基因检测在大肠癌高危对象筛查中的意义

目的　分析大肠癌发生过程中P5 3基因的突变作用 ,评估外周血P5 3基因突变分析作为大肠癌高危对象筛查指标的实际应用价值。　方法　用聚合酶链反应—单链构象多态 (PCR -SSCP)银染技术对 40例大肠癌患者及其 40例家系成员外周血P5 3基因第 5 -8外显子进行检测。　结果　大肠癌患者和对照组健康人的外周血P5 3基因突变率为3 0 %和 0 % (P <0 .0 5 ) ,P5 3基因阳性者家系成员和P5 3基因阴性者家系成员的P5 3基因突变率为 2 5 %和 5 % (P <0 .0 5 )。　结论　P5 3基因突变在大肠癌的发生过程中起重要作用 ,外周血P5 3基因突变分析可望成为大肠癌高危对象的有效筛查手段。     

维生素叶酸缺乏对体外HBL-100 P53蛋白表达与mRNA含量的影响

目的 研究维生素叶酸缺乏对人乳腺细胞株HBL-100 P53蛋白表达及mRNA含量的影响.方法 将HBL-100在叶酸缺乏的培养基（实验组）和正常培养基（对照组）中培养30天,用免疫组织化学和原位杂交方法测定叶酸缺乏对HBL-100 P53蛋白表达及mRNA含量的影响.结果 HBL-100在两种培养基中生长30天后,叶酸缺乏可引起HBL-100 P53蛋白表达及mRNA含量增高.结论 维生素叶酸缺乏可引起HBL-100 P53突变增加.     

双酚A对斑马鱼急性毒性及P53基因诱变性影响

目的研究双酚A(bisphenol A,BPA)对斑马鱼P53基因诱变性。方法根据斑马鱼急性暴露试验结果,确定斑马鱼暴露浓度。试验设对照组与双酚A暴露组,连续染毒30 d,从斑马鱼肝脏组织中提取RNA,通过逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法扩增得到有完整编码区序列的P53基因,并进行测序分析。结果序列分析表明,斑马鱼P53基因编码区序列长1 122 bp,编码373个氨基酸,与网上已经登陆斑马鱼P53序列有99.9%相似系数,而与其他生物P53基因序列存在一定差异;在0.3 mg/L双酚A染毒30 d后,双酚A暴露组斑马鱼P53基因序列发生了突变;直接测序证明,分别在861、35、311位密码子发生了ACA→ACG、GAG→GGG、AGG→CGG转变,可使其编码P53蛋白氨基酸发生谷氨酸→甘氨酸变异。结论双酚A对斑马鱼P53基因有诱变性。     

P22phox与PPAR-γ基因多态性与冠心病的关系

[目的]探讨细胞色素b24(5P22phox)C242T和过氧化体增殖物激活型受体-γ(PPAR-γ)C161T基因多态位点的基因型分布与冠心病危险性的关系。[方法]采用病例-对照研究,应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)方法分别检测P22phox和PPAR-γ基因型。[结果]总的研究人群中P22phox基因的C和T两种等位基因分布频率为92.72%和7.28%;携带CT TT基因型的研究对象患冠心病的危险性降低(OR=0.45,95%CI:0.23~0.87);在PPAR-γ基因中TT基因型者在冠心病组和对照组的分布分别为15.23%和24.01%,两组比较差异有显著性(P<0.05);TT基因型者患冠心病的危险性降低(校正OR=0.49,95%CI:0.25~0.98);与携带PPAR-γCC基因型且P22phoxCC基因型个体相比,具有PPAR-γCT基因型且P22phoxCT TT基因型的个体患冠心病的危险性降低(校正OR=0.24,95%CI:0.07~0.85,P<0.05)。[结论]携带P22phoxCT TT基因型和PPAR-γCT基因型的个体,患冠心病的危险性降低。