人腺病毒7型DNA结合蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

目的原核表达人腺病毒(HAdV)7型DNA结合蛋白(DBP), 制备DBP蛋白多克隆抗体。方法合成HAdV-7 DBP基因并克隆至pET30a载体, 转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞, IPTG诱导进行原核表达。经镍离子金属螯合层析纯化后免疫家兔制备多克隆抗体, 使用间接酶联免疫吸附试验(ELISA)测定该抗体效价;使用Western blotting方法与间接免疫荧光方法(IFA)检测抗体特异性。以rDBP包被ELISA反应板使用间接ELISA对HAdV感染儿童急性期血清中抗DBP蛋白IgM和IgG抗体进行检测。结果成功构建HAdV-7 DBP原核表达载体, 表达的重组DBP蛋白经镍柱亲和层析纯化后纯度>95%, 间接ELISA方法测得制备的多克隆抗血清的抗体效价为1∶1 024 000, Western blotting方法和IFA方法显示该抗体具有较高的特异性, 间接ELISA方法检测HAdV感染儿童急性期血清中抗DBP蛋白IgM和IgG抗体的阳性率分别为50.0%(19/38)和63.2%(24/38)。结论成功构建HAdV-7 DBP蛋白的原达表达载体, 获得了...     

与流行性出血热有关动物血清中IgG之间的抗原关系及其应用

目前进行流行性出血热(EHF)宿主动物血清流行病学调查,多采用双层间接免疫荧光法,但此法需制备相应的动物IgG的抗血清为中间抗体。EHF流行病学调查涉及的动物种类较多,分别制备各种动物IgG的抗血清困难较大。本文研究了与流行性出血热有关的多种动物血清IgG之间的交叉抗原关系,以便选用尽可能少的IgG抗血清检查宿主动物中的抗EHF病毒抗体,以利推广应用。现将试验结果报告如下。     

肺炎嗜衣原体蛋白酶样活性因子重组蛋白的表达与临床应用

目的探讨肺炎嗜衣原体(CPN)蛋白酶样活性因子(CPAF)重组蛋白在CPN感染实验室诊断中的应用价值。方法构建CPAF免疫优势区基因重组质粒,诱导表达并纯化重组蛋白,分析其抗原特异性;间接ELISA法检测CPN参考血清、临床血清标本中的特异性IgM和IgG抗体,以及沙眼衣原体(Ct)阳性血清。结果高效表达和有效纯化出一相对分子质量(Mr)约为5.13×103的特异性重组蛋白;间接ELISA法测定用其免疫兔血清中的特异性IgG和IgM抗体效价,分别高达1∶16 000和1∶8 000;检测Cpn IgM和IgG参考血清,阴性和阳性结果符合率均为100.0%;与"金标准"方法MIF比较,检测300份呼吸道感染患者抗血清,IgMI、gG符合率分别为98.3%、99.0%;检测Ct阳性参考血清和阳性临床血清标本,无阳性结果。结论表达的CPN CPAF免疫优势区重组蛋白具有良好的抗原性,在CPN感染的实验室诊断中具有较高的应用价值。     

哺乳动物细胞西尼罗病毒样颗粒表达、纯化及其鉴定

目的利用哺乳动物细胞表达含有西尼罗病毒(WNV)prM和E蛋白,形成病毒样颗粒(virus-like particles,VLPs),为西尼罗病毒感染的免疫诊断试剂的研制奠定基础。方法筛选典型西尼罗病毒株,构建重组质粒,转染293T细胞,表达并纯化西尼罗病毒prM-E蛋白,利用透射电镜、免疫印迹试验、间接免疫荧光实验(IFA)和酶链免疫吸附试验(ELISA)对表达产物进行鉴定。结果重组质粒转染细胞后产生病毒样颗粒(viruslike particles VLPs),转染细胞上清纯化物中透射电镜观察到重组蛋白形成的球型颗粒,免疫印迹试验和间接免疫荧光试验表明,表达的病毒样颗粒蛋白能够与抗西尼罗病毒抗体特异结合,具有良好的抗原性;间接ELISA证实,重组蛋白可以作为抗原用于检测患者血清特异性抗体。结论在哺乳动物细胞中表达的西尼罗病毒样颗粒具有良好的抗原性,为西尼罗病毒感染快速特异诊断试剂研制奠定了基础。     

利用AlphaLISA技术建立版纳病毒IgG抗体检测方法

目的建立检测版纳病毒(BAV)Ig G抗体的Alpha LISA方法。方法利用BAV重组VP9蛋白(GST-BAV VP9),以及制备的BAV兔抗血清和鼠抗血清,先将不同浓度的GST-BAV VP9和兔抗血清共同孵育,优化最佳抗原、抗体浓度;再用鼠抗血清与之竞争,建立竞争法检测方法,并应用于50份云南省发热病人BAV Ig G的检测。结果当GST-BAV VP9和兔抗血清浓度为1 nmol/L和1∶5 000时,结合力强并且可以被鼠抗血清竞争性抑制,即可用于BAV Ig G的检测。利用建立的方法,在50份发热病人血清中检测到9份阳性。结论建立了竞争性Alpha LISA方法,可用于BAV感染的筛查。     

间接免疫荧光技术检测狂犬病抗体IgG

目的：研究间接免疫荧光技术在检测狂犬病抗体IgG中的应用。方法：研制狂犬病抗原片和生产荧光血清，研究间接免疫荧光技术检测狂犬病抗体IgG的灵敏度、稳定性及实际应用效果。用研制的狂犬抗原片和荧光血清，比较间接免疫荧光技术与酶标检测狂犬病抗体的效果。结果：间接免疫荧光技术检测狂犬病抗体IgG是特异、稳定的，变异系数CV=4．9％。间接免疫荧光技术与ELISA同时检测狂犬病抗体，间接免疫荧光法阳性率为92．89％，ELISA法阳性率为40．48％。结论：间接免疫荧光法测定狂犬病抗体IgG特异性、稳定性好。狂犬疫苗免疫后应用该技术检测抗体，保证免疫效果。     

蓖麻毒素B链蛋白多克隆抗体的制备及胶体金免疫层析快速检测法的建立

目的:结合蓖麻毒素(RT)的多克隆抗体和单克隆抗体,建立检测RT的胶体金免疫层析快速检测方法。方法:将纯化得到的重组蓖麻毒素B链蛋白(rRTB)免疫兔,获得抗血清经正辛酸-硫酸铵分步沉淀法纯化,利用间接ELISA方法鉴定抗体效价和特异性。结合抗重组蓖麻毒素A链蛋白(RTA)单克隆抗体,采用双抗体夹心法,建立检测天然RT的胶体金免疫层析技术,并对该方法进行特异性、敏感性、稳定性等评价;在奶粉、血清、土壤等材料中进行模拟添加RT检测。结果:间接ELISA法测定抗体效价为1:105,并可特异性与rRTB结合;胶体金法能在5~10 min内完成检测,多种不同的蛋白及近缘毒素检测评价显示该法特异性良好,检测灵敏性为50 ng/ml,环境样品的检测敏感性也相同。结论:利用兔抗RTB多抗和抗RTA单抗,建立了适用于现场的快速、特异检测天然蓖麻毒素的胶体金免疫层析方法。     

间接免疫荧光法在检测SARS冠状病毒特异性抗体中的应用

目的 利用间接免疫荧光技术(IFA)建立SARS冠状病毒(SARS—CoV)特异性抗体血清学诊断方法。方法 采用组织培养技术，用SARS病人的咽漱液样本，在Vero—E6细胞中培养，分离SARS冠状病毒；用已制备的SARS病毒抗原片与临床确诊为SARS的病人双相血清和正常人对照血清作用，再用荧光标记羊抗人IgM/IgG抗体与之结合，在荧光显微镜下观察荧光图像。结果 通过建立检测SARS冠状病毒特异性抗体的间接免疫荧光方法，在44份SARS临床病例标本中，检出IgG抗体阳性3l份，与临床诊断符合率为70．45％。31份IgG阳性者的急性期血清中IgM检出率为38．70％，IgM最早产生于发病第3天，发病7d以上的6例的IgM抗体均为阳性，滴度在发病12～15d达到高峰(1：80)；恢复期血清中IgG抗体最早产生于发病第8天，滴度在发病15～20d达到高峰(1：320～1：640)。97份正常人的血清标本中IgG抗体阳性率为3．09％，IgM抗体为阴性。结论 利用此方法，证实被SARS冠状病毒感染后，在机体中产生有特异性的IgM／IgG抗体；本方法检测结果与临床诊断符合率较高，可以用于早期临床诊断SARS病毒感染和辅助临床做出鉴别诊断。     

酵母表达的风疹病毒E1在ELISA检测中应用

目的将毕赤酵母表达系统中表达的E1糖蛋白作为包被抗原,建立一种优于病毒作为包被抗原的风疹病毒(rubellavirus,RV)抗体ELISA检测方法。方法将重组包膜糖蛋白(E1)抗原和风疹病毒分别作为包被抗原,用间接ELISA法检测90份临床血清标本,同时用晶美(JINGMEI)进口分装试剂盒和德国RECI公司试剂盒进行检测;将RECI试剂盒作为金标准,计算另外三者检测结果的特异性、灵敏性和符合率;比较他们之间的差异有无统计学意义,特别是重组抗原与病毒抗原作为包被抗原检出RV抗体阳性率的差异有无统计学意义。结果重组蛋白重复性实验结果经统计学处理,P>0·05,差异无统计学意义;RECI试剂盒与重组抗原、病毒抗原的检测结果差异有统计学意义(P<0·05);重组抗原与病毒抗原的检测结果差异有统计学意义(P<0·05),作为包被抗原,重组抗原优于病毒抗原。结论用毕赤酵母表达的RVE1重组蛋白作为包被抗原进行ELISA检测优于病毒作为包被抗原,具有广阔的应用前景。     

犬狂犬病毒抗体ELISA检测方法的建立

目的 建立犬狂犬病毒抗体ELISA检测方法.方法 采用RV-CTN株感染Vero细胞制备狂犬病毒抗原,并经浓缩和纯化后,分别建立间接ELISA和竞争ELISA方法.结果 经初步质量鉴定,特异性10份阳性,20份阴性,符合率均达100%,间接ELISA的灵敏度达1∶640,竞争ELISA达1∶32;间接ELISA的精密性(变异系数CV)为6.98%,竞争ELISA为5.10%.结论 建立了用间接ELISA检测抗狂犬病毒IgG抗体和竞争ELISA检测抗狂犬病毒总抗体的方法,并生产出相应试剂盒.     

建立固相酶联免疫吸附试验技术诊断社区糖尿病患者人巨细胞病毒活动性感染

目的建立检测人巨细胞病毒(HCMV)抗原特异性IgM的抗体捕捉酶联免疫吸附试验(Capture-ELISA),并分析糖尿病患者HCMV活动性感染状态。方法利用抗人IgM(μ链特异性)抗体包被固相载体,作为捕捉抗体吸附待检血清中的IgM,经过洗涤除去血清中IgG及其他成分,再加入特异性抗原与捕捉到的相应IgM抗体结合,然后加入酶标抗体和底物显色进行测定;同时,应用建立的酶联免疫捕获法诊断糖尿病患者HCMV近期感染状态,并与常用的间接酶联免疫吸附试验(In-ELISA)及RT-PCR进行比较。结果 Capture-ELISA的特异性及敏感性均高于间接法,且不受RF因子的影响。结论 Capture-ELISA操作简单、快速,且具有较高的特异性和灵敏度,是检测IgM抗体理想的方法之一。     

白假丝酵母菌天冬氨酸蛋白酶Sap2多克隆抗体的制备、纯化及鉴定

目的制备白假丝酵母菌天冬氨酸蛋白酶Sap2多克隆抗体,并对其进行鉴定。方法提取白假丝酵母菌基因组DNA为模板,经聚合酶链反应（PCR）获取SAP2目的基因;双酶切SAP2基因与原核表达载体pMAL c2x（+）,构建pMAL c2x/SAP2重组质粒;在大肠埃希菌BL21(DE3)感受态细胞中经IPTG诱导表达出可溶性的融合蛋白;用可溶性Sap2免疫小鼠制备抗血清,间接酶联免疫吸附试验(ELISA)检测抗血清效价,亲和层析法纯化抗血清后,利用Western免疫印迹(Western Blot)检测抗体特异性。结果该研究成功制备了抗Sap2多克隆抗体,抗体效价＞1∶51 200;Western Blot检测结果表明,该抗体可特异性识别Sap2蛋白。结论纯化后的Sap2作为抗原免疫小鼠,有较好的抗原性和免疫原性,可成功制备多克隆抗体,并具有高特异性,为快速检测侵袭性白假丝酵母菌感染奠定了基础。     

扎伊尔型埃博拉病毒实时荧光定量PCR方法的建立

目的 建立扎伊尔型埃博拉病毒实时荧光定量PCR快速检测技术。方法 人工合成扎伊尔型埃博拉病毒包膜糖蛋白GP基因上1 969～2 113 bp的保守特异片段,克隆到pUC57重组质粒中,构建阳性模板;以103～109拷贝数的重组质粒样品共7组作为标准品,制作标准曲线;设计上游引物5' - GAACCACATGATTGGACCAAGA - 3'、下游引物5' - TAACTCCAATACCTGCCGGTATC - 3'及TaqMan探针FAM 5' - TTGTTGATAAAACCCTTCCGGACCAGG - 3' BHQ1,采用普通PCR和实时荧光定量PCR,检测其特异性和灵敏度。结果 克隆出含GP 1 969～2 113 bp片段的阳性重组质粒pUC57 - GP,其浓度为97.75 ng/μl;以pUC57 - GP为标准品,制备标准曲线,拷贝数为103～109 copies/μL有较好线性关系,相关系数R2 = 0.999;能特异性检测扎伊尔型埃博拉病毒,而与I型登革病毒、寨卡病毒无交叉反应,其检测最低拷贝数达3.10×101copies/μl。 结论 建立了扎伊尔型埃博拉病毒荧光定量PCR快速检测技术,具有快速、灵敏、特异、定量检测等特点,可为埃博拉疫情的综合防控提供技术支撑。     

登革病毒抗体检测方法的比较研究

[目的]针对目前实验室检测抗登革病毒IgG和IgM抗体的常规方法间接免疫荧光试验(IFA)操作烦琐,需要使用昂贵的荧光显微镜的缺点,研究1种简便、敏感、特异的检测登革病毒特异性IgG、IgM抗体的方法.[方法]分别采用酶联免疫吸附试验(ELISA)、免疫斑点试验(DIBA)、斑点免疫金渗滤试验(DIGFA)检测44份可疑登革热患者血清抗登革病毒IgG抗体,与间接免疫荧光试验(IFA)作一致性检验,keppa统计量值分别为1.0938、1.1979、1.0557,表明实验结果重现性极好.分别采用酶联免疫吸附试验(ELISA)、IgM抗体捕获酶联免疫吸附试验(MacELISA)、斑点免疫金渗滤试验(DIGFA)检测44份可疑登革热患者血清抗登革病毒IgM抗体,与间接免疫荧光试验(IFA)作一致性检验,kappa统计量值分别为1.0537、1.0554、1.0552,表明实验结果重现性极好.     

非结构蛋白1抗原捕获酶联免疫吸附法评价登革病毒抗体中和活性

目的 在获得具有中和活性的针对Ⅰ型登革病毒(dengue virus serotype Ⅰ,DENV-1)的抗体基础上,评价已建立的非结构蛋白1(nonstructural protein 1,NSI)抗原捕获酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)分析抗体中和活性的可行性,为中和抗体的筛选和疫苗效果的评价提供一个更为快速、简便的检测方法.方法 使用重组DENV-1包膜蛋白Ⅲ区(envelopeprotein domainⅢ,EDⅢ)免疫5只BALB/c小鼠制备单克隆抗体(简称单抗),采用间接ELISA、间接免疫荧光法(immunofluorescenee assay,IFA)和免疫印迹法(Western Blot)对单抗进行筛选及鉴定;同时用该重组蛋白免疫1只新西兰兔,制备多克隆抗体血清;以传统噬斑减少中和试验(plaquereduction neutralization test,PRNT)作为参比方法,采用NSI抗原捕获ELISA对所获抗体进行中和活性检测.结果 获得4株针对DENV-1 EDⅢ单抗和1份兔多抗血清,且被PRNT试验证明均具有中和活性,四株单抗腹水(1A1、1B3、3D3、9D6)和兔多抗血清中和效价分别为1:1024、1:512、1:256、1:4096和1:4096.使用NS1抗原捕获ELISA法检测不到PRNT中和效价最低的3D3抗体对DENV-1有中和能力,而检测其余3株单抗(1A1、1B3、9D6)和多抗兔血清中和效价均远低于PRNT测定结果,分别为1:32、1:32、1:128和1:128.结论 简单、快速的NS1抗原捕获ELISA可用于评价DENV抗体的中和活性,该方法适合于高效价中和抗体的筛选,有望成为评价疫苗效果的方法之一.     

新生儿先天性弓形体感染病原学及临床初步研究

利用敏感性及特异性均较强的间接血凝方法(IHA)与间接免疫荧光方法(IIFA)对临床诊断为先天性感染的新生儿脑病、肝炎、肺炎等患儿132例进行血清弓形体IgM、IgG抗体的定量测定,阳性病例部分母血也进行同样测定,结果证实弓形体病因约占6.82％(9/132),除表明弓形体感染导致中枢神经系统与肝脏的损害情况与国内外报道相符外,还特别指出先天性弓形体肺炎问题应引起注意。对被检血也进行了巨细胞病毒、疱疹病毒、风疹病毒等宫内感染中相关病毒特异性抗体检测,说明与病毒合并感染情况。     

人偏肺病毒多表位抗原的构建与表达

目的构建含人偏肺病毒(h MPV)B细胞和T细胞表位的多表位抗原,并在原核系统表达,评价其免疫原性和免疫反应性。方法以人偏肺病毒NL/1/00不同蛋白为模板,采用在线生物信息学软件Bepipred、ABCpred、Bcepred、LEPS及LBTOPE预测B细胞表位,以Net MHCpan及Net MHC预测CTL细胞表位,以Net MHCⅡ预测Th细胞表位。综合各软件预测结果,确定候选B细胞及T细胞表位,各表位间加入间隔序列"GPGPG"和"KK",串联为多表位抗原基因mea,与p ET32a(+)连接后转化E.coli BL21(DE3)宿主菌,经含氨苄的LB平板培养基筛选、鉴定获得重组p ET32a(+)-mea,经IPTG诱导表达获得多表位抗原(MEA),以镍层析柱纯化,以Western blot鉴定表达蛋白,以MEA免疫小鼠,以ELISA法检测产生抗体效价,以间接免疫荧光法(IFA)检测抗体特异性。结果共预测筛选人偏肺病毒B细胞表位6个,CTL表位4个,Th细胞表位2个,串联为多表位抗原基因mea,经与p ET32a(+)重组后,转化E.coli BL21(DE3)宿主菌,经IPTG 30℃诱导5 h,上清及沉淀均有目的蛋白表达。上清经镍层析柱纯化后获得重组多表位抗原MEA,浓度为1 mg/ml。Western blot检测显示,表达的MEA可与抗His抗体结合。经MEA免疫的BALB/c小鼠的抗血清经ELISA检测,抗体效价达105以上;经间接免疫荧光检测,抗血清能与感染vero-E6细胞的h MPV结合。结论成功构建了h MPV多表位抗原基因,并在原核系统成功表达,获得多表位抗原MEA。该抗原具有很好的免疫原性和免疫反应性,并可与h MPV病毒发生结合,具有病毒特异性。     

登革热抗体快速免疫色谱测试卡同步检测登革病毒IgM和IgG抗体的试验

用登革热抗体快速兔疫色谱测试卡检测35份已确诊的登革热急性期患者血清,其中34份IgM抗体阳性,检出率97.14％;而用间接免疫荧光试验(IFA)检测同样的标本,32份IgM抗体阳性,检出率为91.29％,二者检出率无显著性差异(x~2=1.06,P>0.05)。应用登革热抗体快速免疫色谱测试卡检测32份确诊登革热恢复期患者血清,其中32份IgG抗体阳性,检出率为100％;同时用IFA检测,29份IgG抗体阳性,检出率为90.62％,二者检出率无显著性差异(x~2=1.39,P>0.05)。用登革热抗体快速免疫色谱测试卡检测非登革血清94份,其中IgM抗体阳性1份,IgG抗体阳性 3份,检出率分别为 1.06％和 3.19％。此法检测登革病毒 IgM和IgG抗体,操作简便、快速、敏感,可作为登革热筛选试验。     

五种SARS冠状病毒-IgG抗体检测试剂的比较

目的 比较五种SARS冠状病毒—IgG抗体诊断试剂，检测SRS冠状病毒特异性抗体的敏感性和特异性。方法 分别用间接免疫荧光(IFA)和四种ELISA诊断试剂(其中SLISA—1为全病毒抗原建立的间接法，ELISA—2为表达抗原片断建立的双抗原夹心法，ELISA—3/4为表达抗原建立的间接法)检测IgG抗体。100份血清标本分别采自发病7d以上的临床确诊SARS病例34例和疑似病例42例、发病6d以内临床确诊病例1例和疑似病例23例。结果 用IFA及四种ELISA诊断试剂检测34份发病7d以上临床确诊SARS病例的血清样本，其IgG检出率与临床诊断的符合率分别为：IFA44．12％，SLISA—1、4为41．17％、ELISA—2、3为23．52％；对42例疑似病例的检出率，IFA、ELISA—3为11．9％，ELISA—-1、2、4为9、52％；发病1～6d内的确诊和疑似病例血清中未能检出特异性的IgG抗体。结论 五种诊断试剂都可以帮助临床做出符合诊断和鉴别诊断，可以作为SARS血清学诊断方法，但其检出率与临床诊断的符合率均较低。     

乙型脑炎病毒E结构域蛋白表达、纯化与胶体金的制备

目的分离乙脑病毒临床株,制备高纯度E蛋白抗原,制作用于乙脑病毒抗体检测的胶体金快速检测试纸条。方法 PCR扩增乙脑病毒E蛋白基因、使用原核表达系统进行融合表达、Ni-柱亲和纯化,透析复性后多点皮下免疫动物获得兔抗乙脑病毒E蛋白的多克隆抗体,免疫印迹法检测该抗体与重组蛋白结合的特异性。对抗体处理后,制备快速检测乙脑病毒的胶体金试剂。结果成功克隆出乙脑病毒E蛋白基因并表达该蛋白,纯化后免疫印迹显示在蛋白分子量53kDa左右显出1条目的条带(乙脑病毒E蛋白);酶联免疫法检测多克隆抗血清的效价达到1:12 800,与阴性血清不发生特异性反应。结论成功对乙脑病毒E蛋白基因进行了克隆表达,制备的胶体金试剂能检测出乙脑患者血清中的抗体,操作简便快速,具有临床推广意义。