铁死亡在高脂高糖心肌细胞缺氧复氧损伤中的作用

目的评价铁死亡在高脂高糖心肌细胞缺氧复氧损伤中的作用。方法正常培养的H9c2心肌细胞, 采用随机数字表法分为3组(n=20):对照组(C组)、高脂高糖-缺氧复氧组(HFHG+H/R组)和Ferrostatin-1+高脂高糖-缺氧复氧组(Fer-1+HFHG+H/R组)。采用高脂高糖处理12 h, 随后缺氧4 h, 复氧2 h的方法制备H9c2心肌细胞缺氧复氧损伤模型。Fer-1+HFHG+H/R组在高脂高糖处理同时加入铁死亡抑制剂Ferrostatin-1, 终浓度10 μmol/L。于复氧2 h时, 采用CCK-8法检测细胞活力, 2, 4二硝基苯肼显色法检测上清液LDH活性, 荧光探针DCFH-DA流式细胞术检测ROS活性, Western blot法检测心肌细胞长链脂酰辅酶A合成酶4(ACSL4)、核受体共激活因子4(NCOA4)和谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)的表达。结果与C组比较, HFHG+H/R组细胞活力降低, LDH活性、ROS活性、ACSL4和NCOA4表达水平升高(P<0.05), GPX4表达差异无统计学意义(P>0.05);与HFHG+H/R组比较...     

P物质对高糖孵育心肌细胞缺氧／复氧损伤的影响

目的：探讨P物质预处理对高糖孵育大鼠心肌细胞缺氧／复氧损伤的影响。方法：分离新生SD大乳鼠心脏为细胞悬液接种于细胞培养板,分别用正常糖和高糖培养基进行孵育,72h后将细胞随机分为5组,分别为正常对照组,高糖对照组,另外三组进行缺氧／复氧（A／R）处理：高糖A／R组,高糖SP＋A／R组和高糖SP＋D—SP＋A／R组。复氧后分别测定细胞凋亡率、缺氧液和复氧液中caspase-3活性以及LDH释放量。结果：高糖和缺氧／复氧均可引起细胞凋亡率增高,缺氧液和复氧液中CasPase-3活性以及LDH释放量均显著升高：SP可降低上述各项指标,且该作用可被NK-1受体拮抗剂（D-SP）逆转。结论：高糖孵育可造成心肌细胞损伤,缺氧／复氧可加剧高糖孵育的大鼠心肌细胞损伤．SP预处理可显著减轻该损伤,且该作用可能由NK-1受体介导。     

缺氧后处理和二氮嗪后处理对大鼠心肌细胞缺氧复氧时钙网蛋白表达的影响

目的 探讨缺氧后处理和二氮嗪后处理对大鼠心肌细胞缺氧复氧时钙网蛋白(CRT)表达的影响.方法 健康雄性SD大鼠,4～5月龄,分离心肌细胞,培养18 h后,随机分为6组(n=8):对照组(C组)、缺氧复氧组(HR组)、缺氧后处理组(HP组)和二氮嗪后处理组(DP组).C组细胞于5%CO2培养箱内继续培养2 h;HR组细胞于95%N2-5%CO2培养箱中缺氧45 min,然后于95%O2-5%CO2培养箱中复氧1 h;HP组细胞于95%N2-5%CO2培养箱中缺氧45 min,然后复氧3 min,缺氧3 min,重复3次,再于95%O2-5%CO2培养箱中复氧1 h;DP组细胞于95%N2-5%CO2培养箱中缺氧45 min,然后给予50 μmol/L二氮嗪处理10 min,再于95%O2-5%CO2培养箱中复氧1 h.测定心肌细胞caspase-3活性、CRT表达和游离钙离子浓度.结果 与C组比较,其余各组caspase-3活性升高,HP组和DP组CRT表达上调,HR组游离钙离子浓度升高(P＜0.05或0.01);与HR组比较,HP组和DP组caspase-3活性降低,CRT表达上调,游离钙离子浓度降低(P＜0.01).结论 缺氧后处理和二氮嗪后处理可上调CRT的表达,减轻细胞内钙超载,减轻大鼠心肌细胞缺氧复氧损伤.     

血红素加氧酶-1对乳鼠心肌细胞缺氧复氧损伤的影响

目的 探讨血红素加氧酶-1(HO-1)对乳鼠心肌细胞缺氧复氧损伤的影响.方法 新生SD大鼠8只,日龄1～3 d,原代培养心肌细胞,随机分为4组:正常对照组(C组)常规培养8 h;缺氧复氧组(HR组)采用缺氧2 h,复氧6 h的方法制备心肌细胞缺氧复氧模型;血晶素组(Hemin组)缺氧前24 h及缺氧即刻,培养基中加入Hemin,终浓度为20 μmol/L;血晶素+锌原卟啉组(Hemin+ZnPP组)缺氧前24 h及缺氧即刻培养基中同时加入Hemin及ZnPP,终浓度均为20 μmol/L.各组细胞均接种于35 mm培养皿(2 ml/皿)或50 ml培养瓶(3 ml/瓶),每组45皿和3瓶.于复氧结束后采用蛋白印迹法测定心肌细胞HO-1表达,台盼蓝染色法测定心肌细胞存活率,应用全自动生化分析仪测定细胞培养液乳酸脱氧酶(LDH)活性,超声破碎细胞离心后取上清,采用硫代巴比妥酸法测定细胞MDA水平,黄嘌呤氧化酶法测定细胞SOD活性.结果 与C组比较,其余3组培养液LDH活性、心肌细胞MDA水平及HO-1表达升高,心肌细胞存活率及SOD活性降低(P＜0.05).与HR组比较,Hemin组培养液LDH活性、心肌细胞MDA水平降低,HO-1表达、心肌细胞存活率及SOD活性升高(P＜0.05),Hemin+ZnPP组上述指标差异无统计学意义(P＞0.05).HR组和Hemin+ZnPP组细胞缺氧复氧损伤明显,Hemin组细胞缺氧复氧损伤减轻.结论 HO-1可减轻乳鼠心肌细胞缺氧复氧损伤.     

骨形态发生蛋白-7基因转染对新生大鼠心肌细胞缺氧-复氧时凋亡的影响

目的 探讨骨形态发生蛋白-7(BMP-7)基因转染对新生大鼠心肌细胞缺氧-复氧时凋亡的影响.方法 体外培养的新生大鼠心肌细胞分为3组:正常对照组(C组)、缺氧-复氧组(HR组)培养的心肌细胞置于95%N2-5%CO2混合气体饱和的缺氧罐中缺氧2 h后,放回孵育箱中继续培养4 h;BMP-7基因转染组(BT组)将含pcDNA3.1-BMP-7基因的质粒在转染试剂作用下转染心肌细胞后72 h再行缺氧2 h,复氧4 h.每组重复8次.计数心肌细胞搏动次数,采用全自动生化分析仪测定乳酸脱氢酶(LDH)活性.倒置显微镜下观察心肌细胞形态.采用流式细胞仪检测心肌细胞凋亡情况,免疫细胞化学方法测定Bcl-2、Bax蛋白的表达.结果 与c组相比,HR组和BT组心肌细胞LDH活性、细胞凋亡率增加,Bax蛋白表达上调,Bcl-2蛋白表达下调(P＜0.05);与HR组相比,BT组心肌细胞LDH活性、细胞凋亡率降低,Bax蛋白表达下调,Bcl-2蛋白表达上调(P＜0.05).结论 BMP-7基因转染可减轻新生大鼠心肌细胞缺氧-复氧损伤,其机制可能与调控Bcl-2、Bax蛋白的表达,抑制心肌细胞凋亡有关.     

尼卡地平对缺氧/复氧心肌细胞损害及细胞内Ca~(2 )的影响

目的 :研究尼卡地平对缺氧 /复氧心肌细胞损害及细胞内Ca2 的影响。方法 :培养 4～ 5天原代SD大鼠心肌细胞分为正常对照、单纯缺氧 /复氧以及低剂量和高剂量 (终浓度分别为 30ng/ml和 2 70ng/ml)的尼卡地平预防用药 2 0分钟后缺氧 /复氧四组。实验结束测定培养液乳酸脱氢氧酶 (LDH)和肌酸激酶 (CK)活性以及细胞内Ca2 含量。结果 :缺氧复氧后 ,心肌细胞内游离Ca2 浓度 ,以及培养液中LDH和CK活性显著升高。高剂量尼卡地平能明显减轻这种升高 ,而低浓度尼卡地平则无明显影响。结论 :高浓度尼卡地平减轻缺氧 /复氧心肌细胞Ca2 超载 ,对心肌细胞产生一定保护作用     

丙泊酚降低高糖环境下H9C2心肌细胞缺氧后的损伤

目的探讨小窝蛋白3(Cav-3)在丙泊酚降低高糖环境下H9C2心肌细胞缺氧后损伤中的作用。方法培养大鼠原代H9C2心肌细胞,构建细胞缺氧-复氧模型。将心肌细胞分为六组:正常培养组(NC组)、高糖培养组(HG组)、高糖缺氧-复氧组(HR组)、丙泊酚处理组(P组)、Cav-3抑制剂组(PI组)和DMSO溶剂组(D组)。比较六组心肌细胞损伤程度、氧化应激反应、线粒体功能、Cav-3蛋白含量、蛋白激酶B(AKT)及信号传导及转录激活因子3(STAT3)活化情况。结果与HR组比较,P组细胞活力、总SOD(T-SOD)活性、线粒体活力、ATP含量、Cav-3蛋白含量、AKT及STAT3活化明显增加,LDH、CK-MB活性、cTnI含量、Bcl-2相关X蛋白(Bax)与B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)比值(Bax/Bcl-2)明显下降,含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3(caspase 3)及含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-9(caspase-9)蛋白含量、MDA浓度、JC-1染色的荧光绿红比明显降低,DCF-DA荧光阳性细胞数、MPTP开放明显减少(P0.05);与P组比较,PI组和D100组细胞活力、T-SOD活性、线粒体活力、ATP含量、Cav-3蛋白含量明显降低,AKT及STAT3活化明显减少(P0.05),LDH、CK-MB活性、cTnI含量、Bax/Bcl-2值、caspase-3及caspase-9蛋白含量、MDA浓度、JC-1染色的荧光绿红比明显升高,DCF-DA荧光阳性细胞数、MPTP开放明显增加(P0.05)。结论丙泊酚通过上调Cav-3减少高糖环境下H9C2心肌细胞的缺氧后线粒体的损伤及细胞的死亡。     

咪达唑仑对新生大鼠心肌细胞缺氧/复氧时细胞凋亡的影响

目的 探讨咪达唑仑对新生大鼠心肌细胞缺氧/复氧时细胞凋亡的影响.方法 分离、培养出生2～4 d的Wistar大鼠心肌细胞,将培养融合的心肌细胞随机分为7组(n=7):正常对照组(C组)、缺氧/复氧组(HR组)、外周型苯二氮革类受体(PBR)拮抗剂PK 11195组(P组)、PBR激动剂Ro 5-4864组(R组)、咪达唑仑组(M组)、PK 11195+Ro 5-4864组(PR组)和PK 11195+咪达唑仑组(PM组).HR组缺氧30 min复氧2 h建立缺氧/复氧模型.P组、R组、M组、PR组、PM组在培养皿中分别加入终浓度为10-4mol/L的PK 11195、Ro 5-4864和咪达唑仑及相应混合药物共同孵育,30 min后行缺氧/复氧.复氧2 h时收集细胞,采用HTC-Annexin V/PI双标法检测细胞凋亡情况,计算细胞凋亡指数(AI);Western blot法测定心肌细胞蛋白激酶C(PKc)表达水平;Meta Flour单细胞内钙测定系统测定细胞内钙离子浓度.结果 与C组比较,其余各组AI升高,除R组外其余各组细胞内钙离子浓度升高,PKC表达下调(P<0.01);与HR组比较,R组AI和细胞内钙离子浓度降低,PKC表达上调,M组和PM组AI降低(P<0.01);与P组比较,R组AI和细胞内钙离子浓度降低,PKC表达上调(P<0.01),PR组、PM组差异无统计学意义(P>0.05);与R组比较,M组、PR组、PM组Al和细胞内钙离子浓度均升高,PKC表达下调(P<0.01).结论 咪达唑仑10-4mol/L可减轻新生大鼠心肌细胞缺氧/复氧时细胞凋亡,其作用机制可能是非PBR依赖性的,且与细胞内钙离子浓度和PKC表达无关.     

EPO预处理对培养心肌细胞缺氧/复氧损伤TNF-α表达的影响及机制

目的 观察促红细胞生成素（erythropoietin，EPO）预处理对培养心肌细胞缺氧复氧前后TNF-α表达的影响，并进一步研究其可能的NF-kB信号机制。方法采用培养乳鼠心肌细胞建立缺氧复氧损伤模型，分为对照组、EPO组[缺氧复氧前24h，培养液中加入终浓度10U/ml的重组人促红素（recombinant human erythropoietin，RHuEPO）]、EPO＋吡咯烷二硫氨基甲酸盐（PDTC）组（缺氧复氧前24h，加入终浓度10U／ml的RHuEPO和5μg/ml的PDTC）和PDTC组（缺氧复氧前24h，加入终浓度5μg/ml的PDTC）。分别于缺氧复氧损伤前后，以RT-PCR和western blot检测各组心肌细胞TNF-α基因表达变化，同时以EMSA检测各组心肌细胞NF-kB活性变化。结果缺氧复氧损伤前，各组心肌细胞TNF-α基因表达水平差异无统计学意义，均较弱。损伤后各组心肌细胞TNF-α基因表达水平较损伤前对照组显著升高（P〈0．01），而EPO组TNF-α基因表达水平低于其他各组（P〈0．01）。缺氧复氧损伤前EPO组NF-kB活性高于其他各组（P〈0．01），损伤后各组NF-kB活性显著高于损伤前对照组（P〈0．01），EPO组NF-kB活性低于其他各组（P〈0．01）。结论EPO预处理抑制缺氧复氧后心肌细胞TNF-α基因表达升高，可能与缺氧复氧后NF-kB活性升高被抑制有关。EPO预处理可能通过NF-kB活化的负反馈机制抑制缺氧复氧后心肌细胞NF-kB活性的升高。     

降钙素基因相关肽对原代培养大鼠心肌组包缺氧／复氧损伤的影响

目的：探讨降钙素基因相关肽（CaICitoninGene-ReIatedPeptide,CGRP）预先给药对大鼠心肌细胞缺氧／复氧（Anoxia-reoxygenatiOR,A／R）损伤的影响。方法将出生1～3天的大乳鼠心脏经体外分离为心肌细胞后接种于6孔细胞培养板（3×105个／孔）,培养72h后进行实验。采用随机数字表法,取12子L心肌细胞随机分为4组（n=3）：（1）对照组,不加任何药物干预,并且不进入缺氧／复氧程序;（2）缺氧／复氧组,不加任何药物干预,只进行缺氧／复氧程序;（3）缺氧／复氧＋CGRP组,缺氧前1小时给予CGRP（10-8mol/L）,之后进入缺氧／复氧程序：（4）缺氧／复氧＋CGRP＋CGRP8—37组．缺氧前1小时给予CGRP（10—8tooI／L）＋CGRPl受体拮抗剂CGRP8—37（10-7mol／L）,之后进入缺氧／复氧程序。缺氧／复氧损伤后测定心肌细胞凋亡率、乳酸脱氢酶fLDH）释放量以及培养液中半胱氨酸天冬蛋白酶3（caspase-3）活性。结果：与对照组比较,缺氧／复氧组的细胞凋亡率、LDH释放量以及培养液中caspase-3活性均显著升高（p均〈0.01）：缺氧／复氧＋CGRP组的细胞凋亡率、LDH释放量以及培养液中caspase-3活性均显著低于单纯缺氧／复氧组（p均〈0．01）,上述指标变化可被CGRPl受体拮抗剂CGRP8-37所逆转。结论：缺氧／复氧可诱发心肌细胞损伤,cGRP预先给药可显著减轻心肌细胞在缺氧／复氧过程中的损伤,该作用可能由CGRP1受体介导。     

缬沙坦预处理对乳鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤的保护作用

目的:探讨缬沙坦预处理对乳鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤的保护作用及其机制.方法:常规方法培养心肌细胞,培养72小时后,分为三组:正常对照组、心肌细胞缺氧/复氧损伤组、缬沙坦预处理后心肌细胞缺氧/复氧损伤组.分别观察心肌细胞结构,测定心肌细胞存活率、乳酸脱氢酶(LDH)、丙二醛(MDA)及超氧化物歧化酶(SOD)水平.结果:与对照组比心肌细胞缺氧/复氧损伤组细胞存活率明显下降、培养液中LDH、MDA含量明显增高,SOD含量明显下降；与心肌细胞缺氧/复氧损伤组比,缬沙坦预处理组心肌细胞存活率明显提高,培养液中LDH、MDA含量明显下降、S0D含量明显上升.结论缬沙坦通过抗氧化、抗脂质过氧化反应,清除氧自由基对乳鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤有保护作用.     

二氮嗪后处理对缺氧/复氧成年大鼠心肌细胞存活率及磷酸化糖原合成激酶-3β、Bcl-2和Bax表达的影响

目的 研究线粒体ATP-敏感性钾通道(mitochondrial ATP-sensitive potassium channel,mitoKATP通道)开放剂二氮嗪(diazoxide,DZ)后处理对成年大鼠心肌细胞缺氧/复氧(hypoxia/reoxygenation,H/R)后细胞存活及对磷酸化糖原合成激酶-3β(phospho glycogen synthase kinase-3β,pGSK-3β),Bcl-2,Bax表达的影响. 方法 体外培养原代成年大鼠(30只)心肌细胞建立H/R损伤模型,按随机数字表法随机分为5组(每组6只):①Normal组:在二氧化碳(CO2)培养箱中持续培养6h组;②H/R组:缺氧3h复氧3h组;③DZ组:缺氧3h复氧3h,复氧5 min时给予100 μmol/L DZ组;④DZ+5-HD组:缺氧3h复氧3h,缺氧末给予100 μmol/L 5-羟葵酸盐(5-hydroxydecanoate,5-HD),复氧5 min时给予100μmol/L DZ组;⑤5-HD组:缺氧3h复氧3h,缺氧末给予100 μmol/L 5-HD组.复氧3h末通过计数细胞长杆率测定存活率,免疫印迹法测定心肌细胞内pGSK4β,Bcl-2和Bax的表达. 结果 复氧3h末,Normal组单个心肌细胞收缩幅度为(13.12±0.19)％,与Normal组比较,其他各组单个心肌细胞收缩幅度明显降低[H/R组为(7.97±0.22)％,DZ组为(10.48±0.20)％,DZ+5-HD组为(7.97±0.19)％,5-HD组为(8.22±0.22)％](P＞0.05),心肌细胞内Bcl-2表达水平降低,Bax表达水平升高(P＜0.05).DZ后处理组心肌细胞存活率为(64±5)％,与H/R组比较明显增高(P＜0.05),心肌细胞内Bcl-2、pGSK4β表达水平升高,Bax表达水平降低,而缺氧末即刻给予5-HD可以逆转DZ后处理的这些作用(P＜0.05);5-HD组与H/R组比较差异无统计学意义(P＞0.05). 结论 DZ后处理可能通过激活mitoKATP通道、上调pGSK-3β及Bcl-2,下调Bax的表达增加H/R后成年大鼠心肌细胞的存活.     

活性氧在缺氧后处理激活大鼠心肌细胞Nrf2/ARE信号通路中的作用

目的评价活性氧(ROS)在缺氧后处理激活大鼠心肌细胞核因子E2相关因子2(Nrf2)/抗氧化反应元件(ARE)信号通路中的作用。方法分离、培养成年大鼠原代心肌细胞, 采用随机数字表法分成4组(n=20):正常组(N)、缺氧复氧组(HR组)、缺氧后处理组(HPO组)及HPO+ROS清除剂组(HPO+MPG)。采用缺氧45 min复氧60 min的方法制备心肌细胞缺氧复氧损伤模型;HPO组缺氧45 min后, 行3个循环的氧合5 min-缺氧5 min处理, 再复氧60 min;HPO+MPG组缺氧35 min时加入ROS清除剂N-(2-硫基丙酰)-甘氨酸(终浓度2 mmol/L)继续缺氧处理10 min, 余同HPO组。于复氧末, 检测心肌细胞内Ca2+水平和Nrf2活性, 观察心肌细胞超微结构并进行线粒体Flameng评分;采用Western blot法和RT-PCR法分别检测心肌细胞Nrf2、醌氧化还原酶(NQO1)、SOD1、血红素加氧酶1(HO-1)及其mRNA表达。结果与N组比较, HR组心肌细胞内Ca2+水平、Nrf2活性和Flameng评分升高, Nrf2、NQO1、SOD...     

七氟醚和缺氧预适应对乳鼠心肌细胞生存和凋亡的影响

目的 探讨七氟醚预处理和缺氧预处理诱导乳鼠心肌细胞产生预适应的差异。方法 第2代心肌细胞随机分为正常对照组（C组）、缺氧／复氧组（A／R组）、缺氧预适应组（IP组）和七氟醚组（S组），每组均缺氧2h，复氧48h。取复氧1h心肌细胞用电镜观察细胞超微结构变化；分别取复氧0、1、2、24、36和48h的细胞用MTT法测定细胞生存情况、流式细胞仪测定细胞凋亡率。结果 （1）S组和IP组细胞超微改变不明显，未见凋亡细胞；A／R组改变明显，可见凋亡细胞；（2）在各个时点，S组和IP组的细胞生存能力显著低于C组（P＜0．05），显著高于A／R组（P＜0．01），S组和IP组间无显著性差异（P＞0．05）；随着复氧时间的延长，S组和IP组的细胞生存能力有上升的趋势；（3）在各个时点，S组和IP组的细胞凋亡率显著高于C组（P＜0．01），显著低于A／R组（P＜0．01）；S组和IP组间的细胞凋亡率只是在复氧0h和1h处有显著性差异；随着复氧时间的延长，S组和IP组的细胞凋亡率有下降的趋势，A/R组的则逐渐升高；（4）S组和IP 中的细胞生存力和凋亡之间存在着负相关关系。结论 七氟醚预适应和缺氧预适应对缺氧／复氧损伤细胞可产生早期和延迟保护作用，且两者之间的作用相似，提示在体外实验中七氟醚预适应可取代缺氧预适应。     

缺氧复氧对H9C2心肌细胞凋亡、自噬和焦亡的影响

目的:探讨缺氧复氧(hypoxia reoxygenation,HR)对H9C2心肌细胞凋亡、自噬和焦亡3种细胞死亡方式的影响。方法:将培养的H9C2心肌细胞按随机数字表法分为正常对照组(Ctrl组)和HR组,其中HR组H9C2心肌细胞在缺氧培养箱中进行氧糖剥夺8h,然后复氧12 h。通过检测细胞培养液中的乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)含量及四甲基偶氮唑盐[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5 diphenyl tetrazolium bromide,MTT]比色法检测细胞活力来评估细胞损伤情况(每组6孔),Western blot检测(每组9孔)细胞凋亡相关蛋白[天门冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶(cysteinyl aspartate-specific proteinase,caspase)-3、B细胞淋巴瘤/白血病-2(B-cell lymphoma/leukemia 2,Bcl-2)、Bcl相关蛋白(bcl-associate x protein,Bax)]、自噬相关蛋白[(轻链蛋白3(light chain 3,LC3)Ⅱ/Ⅰ、p62、Beclin-1、磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(phosphorylated mammalian target of ra-pamycin,p-mTOR)]、焦亡相关蛋白[Nod样受体蛋白-3(nod-like receptor pyrin domain3,NLRP3)、凋亡相关斑点样蛋白(apopto-sis associated speck-like protein,ASC)、caspase-1p20、IL-1β、IL-18]。通过免疫荧光染色进一步评估细胞凋亡、自噬及焦亡情况(每组6孔)。结果:与Ctrl组比较,HR组H9C2心肌细胞HR后细胞活力降低(P<0.05),LDH释放增加(P<0.05),活化的cas-pase-3及Bax的表达上调(P<0.05),Bcl-2表达下降(P<0.05),TUNEL染色显示HR后细胞凋亡显著增加(P<0.05),提示HR后细胞凋亡及损伤增加;而p-mTOR、p62均表达增加(P<0.05),但LC3Ⅱ/Ⅰ和Beclin-1蛋白降低(P<0.05),LC3Ⅱ/Ⅰ免疫荧光染色显示HR后细胞内的自噬小体增加(P<0.05),表明HR后H9C2心肌细胞自噬受到明显抑制;同时炎性小体NLRP3、ASC、cas-pase-1p20蛋白均显著上调(P<0.05),活化的炎症细胞因子IL-1β、IL-18表达增加(P<0.05),提示HR后NLRP3炎性小体活化,细胞焦亡增加。结论:H9C2心肌细胞在HR损伤过程中自噬被抑制,细胞焦亡及凋亡增加。     

PI3K/Akt信号通路在乳化异氟醚预先给药减轻乳鼠心肌细胞缺氧复氧损伤中的作用

目的 评价磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白质丝氨酸苏氨酸激酶(PI3K/Akt)信号通路在乳化异氟醚预先给药减轻乳鼠心肌细胞缺氧复氧损伤中的作用.方法 Wistar乳鼠60只,乳鼠心肌细胞于24孔培养板原代培养后,采用缺氧2 h复氧2 h建立缺氧复氧模型.乳鼠心肌细胞随机分为6组,每组8孔,正常对照组(C组):按正常条件继续培养4 h;A/R组:制备缺氧复氧模型;EI组:于细胞缺氧前即刻在培养液中加入乳化异氟醚,终浓度为1.68 mmol/L;EI+wortmannin(PI3K特异性抑制剂)组(EIW组):于细胞缺氧前即刻在培养液中加入乳化异氟醚和wortmannin,终浓度分别为1.68 mmol/L和100 nmol/L;wortmannin组(W组):于细胞缺氧前即刻在培养液中加入wortmannin,终浓度为100 nmol/L;脂肪乳组(F组):与细胞缺氧前即刻在培养液中加入30%脂肪乳,终浓度为0.05%.复氧2 h时,取细胞培养上清液测定乳酸脱氢酶(LDH)活性、肌钙蛋白I(cTnI)浓度,心肌细胞匀浆后测定超氧化物歧化酶(SOD)活性与丙二醛(MDA)含量,并测定心肌细胞磷酸化Akt(p-Akt)的表达水平.结果 与C组比较,其余5组上清液LDH活性、cTnI浓度和心肌细胞MDA含量升高,心肌细胞SOD活性降低(P<0.05);与A/R组比较,EI组和EIW组上清液LDH活性、cTnI浓度和心肌细胞MDA含量降低,心肌细胞SOD活性升高,F组除心肌细胞SOD活性升高外(P<0.05),其余指标差异均无统计学意义(P>0.05),W组上述指标差异无统计学意义(P>0.05);与EI组比较,EIW组、W组和F组上清液LDH活性、cTnI浓度和心肌细胞MDA含量升高,心肌细胞SOD活性降低(P<0.05).C组、EIW组、H/R组、F组和EI组心肌细胞p-Akt表达水平依次升高(P<0.05).结论 乳化异氟醚预先给药减轻乳鼠心肌细胞缺氧复氧损伤可能与进一步激活PI3K/Akt信号通路有关.     

血红素加氧酶-1在七氟醚预处理减轻乳鼠心肌细胞缺氧复氧损伤中的作用

目的 探讨血红素加氧酶-1(HO-1)在七氟醚预处理减轻乳鼠心肌细胞缺氧复氧损伤中的作用.方法 新生健康清洁级SD大鼠15只,日龄1～3d,处死后取心室肌组织,原代培养心肌细胞,以1×106个/ml接种于6孔培养板或以2× 105个/ml接种于24孔培养板,采用随机数字表法,将其随机分为4组(n＝25):对照组(C组)常规培养;缺氧复氧组(H/R组)采用缺氧2h,复氧1h的方法制备心肌细胞缺氧复氧损伤模型;七氟醚预处理组(S+ H/R组)细胞经2.5％七氟醚预处理20min后行药物洗脱10 min,再行缺氧复氧处理;锌原卟啉+七氟醚预处理组(ZnPP+ S+ H/R组)细胞经HO-1抑制剂锌原卟啉3 μmol/L孵育1h后,行七氟醚预处理及缺氧复氧处理.于复氧结束后测定心肌细胞HO-1表达、细胞凋亡率、细胞内游离Ca2+浓度([Ca2+]i)、线粒体膜通透性转运孔(PTP)开放程度、细胞色素C(Cyto C)表达及培养液LDH和CK活性.结果 与C组比较,H/R组心肌细胞HO-1和胞浆Cyto C表达上调,线粒体Cyto C表达下调,培养液LDH、CK活性、细胞凋亡率、[Ca2+]i和PTP开放度升高(P<0.01).与H/R组比较,S+H/R组心肌细胞HO-1和线粒体Cyto C表达上调,胞浆Cyto C 表达下调,培养液LDH、CK活性、细胞凋亡率、[Ca2+]i和PIP开放度降低(P<0.01).与S+H/R组比较,ZnPP+ S+ H/R组心肌细胞HO-1和线粒体Cyto C表达下调,胞浆CytoC表达上调,培养液LDH、CK活性、细胞凋亡率、[Ca2+]i和PTP开放度升高(P<0.01).结论 HO-1表达上调参与了七氟醚预处理减轻乳鼠心肌细胞缺氧复氧损伤.     

不同剂量右美托咪定对大鼠海马神经元缺氧复氧损伤中线粒体分裂的影响

目的探讨不同剂量的右美托咪定(dexmedetomidine,Dex)在大鼠海马神经元缺氧复氧损伤中对线粒体分裂的影响。方法 24h内出生的雄性SD大鼠,断头分离海马区神经组织,收集获得神经元细胞进行培养,8d后培养的海马神经元随机分为六组:正常对照组(C组);赋形剂组(V组);缺氧复氧组(HR)组;缺氧复氧+右美托咪定组(D1、D2、D3)组。C组:正常培养;V组:不行缺氧复氧、加入赋形剂二甲基亚砜培养6h,浓度0.01%;HR组:氧糖剥夺法缺氧6h,复氧12h建立缺氧复氧损伤模型;D1、D2、D3组,于缺氧6h后分别加入右美托咪定0.1、1、10μmol/L。采用激光共聚焦显微镜观察各组神经元细胞质Ca2+荧光强度,采用ELISA法检测细胞钙调神经磷酸酶活性,采用透射电镜观察线粒体的超微结构,Western-blot法检测线粒体分裂蛋白Drp1、Fis1的含量。结果与C组比较,HR组、D1组、D2组和D3组线粒体超微结构破坏加重,Ca2+荧光强度、CaN活性明显增强,Fis1、Drp1蛋白含量明显升高(P0.05);与HR组比较,D1组、D2组和D3组线粒体超微结构破坏减轻,Ca2+荧光强度、CaN活性明显减弱,Fis1、Drp1蛋白含量明显降低(P0.05);与D1组和D3组比较,D2组线粒体结构更加完整,Ca2+荧光强度、CaN活性明显减弱,Fis1、Drp1蛋白含量明显降低(P0.05)。C组和V组各指标差异无统计学意义。结论右美托咪定0.1、1、10μmol/L可以减少大鼠海马神经元缺氧复氧损伤中线粒体的分裂,其中1μmol/L是最佳的保护浓度,其机制可能是与其抑制钙超载有关。     

PEP-1-血红素加氧酶-1融合蛋白转导对大鼠H9c2心肌细胞缺氧复氧损伤的影响

目的 探讨PEP-1-血红素加氧酶(HO)-1融合蛋白转导对大鼠H9c2心肌细胞缺氧复氧损伤的影响.方法 构建含人HO-1基因的原核表达质粒pETl5b-PEP1-hHO-1,质粒转化后诱导目的 蛋白PEP-1-HO-1表达.用含15%胎牛血清高糖DMEM培养基培养H9c2心肌细胞,随机分为4组(n=4):正常对照组(C组)常规培养;缺氧复氧组(H/R组)细胞缺氧22 h,复氧8 h;低浓度融合蛋白组(L-HO组)缺氧前用终浓度为1.0 μmol/L PEP-1-HO-1融合蛋白孵育细胞;高浓度融合蛋白组(H-HO组)缺氧前即刻用终浓度为2.0 μmol/L PEP-1-HO-1融合蛋白孵育细胞.复氧结束后收集细胞及培养液上清,采用2,4-二硝基苯肼显色法检测培养液乳酸脱氢酶(LDH)活性,硫代巴比妥酸比色法检测细胞MDA含量,黄嘌呤氧化酶法检测细胞SOD活性.结果 与C组比较,H/R组、L-HO组、H-HO组心肌细胞SOD活性降低,MDA含量升高,培养液LDH活性升高(P＜0.05);与H/R组比较,L-HO组和H-HO组心肌细胞SOD活性升高,MDA含量降低,培养液LDH活性降低(P＜0.05);与L-HO组比较,H-HO组心肌细胞SOD活性升高,MDA含量降低,培养液LDH活性降低(P＜0.05).结论 PEP-1-HO-1融合蛋白转导入大鼠H9c2心肌细胞可减轻细胞缺氧复氧损伤.     

硫酸锌预处理对成年大鼠缺氧／复氧心肌细胞超微结构的影响

目的：研究硫酸锌预处理对成年大鼠缺氧／复氧心肌细胞超微结构的影响。方法：分离培养SD成年大鼠心肌细胞,建立心肌细胞缺氧／复氧损伤模型,将细胞随机分为正常组（N）,缺氧复氧组（H／R）,缺氧预处理组（HP）,硫酸锌（ZnSO4）预处理组（ZnP）,分别进行相应处理,然后用透射电镜对各组心肌细胞超微结构进行观察,并进行线粒体评分。结果：N组、HP组、ZnP组超微结构优于H／R组,线粒体评分较H／R组低（P〈0．05）,HP组、ZnP组超微结构变化相似且线粒体评分无统计学差异,但均高于N组（P〈0．05）。结论：缺氧／复氧可造成成年大鼠心肌细胞超微结构的损伤,ZnSO4预处理、缺氧预处理均能减轻这种损伤,且两者效果相当。