胱氨酸尿症基因型和表型研究进展

胱氨酸尿症是由SLC3A1和SLC7A9 2个基因突变引起的一类少见遗传病。随着现代技术的不断发展和进步,对于胱氨酸尿症的诊断和治疗也在不断革新,关于其基因型、表型以及基因型和表型的关系也有了更进一步的认识;此外,基因编辑有可能通过修补突变的碱基达到治愈疾病的目的。本文将对胱氨酸尿症的基因型、表型、基因型和表型关系以及治疗进展进行综述。     

共享CRISPR/Cas9成果,谱写医学发展新篇章

2014年CRISPR/Cas9(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,成簇的规律间隔的短回文重复系列区域)基因工程编辑技术的公布,在整个医学生物研究领域,引起了席卷世界的一场"风暴"。CRISPR/Cas9系统基因编辑技术现已用于医学、生物学、农业、渔业等各行各业,而且揭示出了它的创新革命前景。目前该项技术在医学领域用于构建动物疾病模型、人肝癌小鼠模型、基因治疗与预防、生物物种的改良、解密人类基因功能、促进组织和器官再生、与诱导多能干细胞(IPS)技术等相结合,使修复后的IPS重新发展成正常的组织和器官,供患者移植。随着研究的深入,有可能通过CRISPR/Cas9系统对人类社会基因进行扫描,定位并治愈疾病。     

染色体22q上与胶质瘤RNA编辑相关基因的研究进展

RNA编辑与胶质瘤的发生、发展相关.胶质瘤的肿瘤抑制基因位点涉及染色体22q.新近研究结果显示,1637种基因中存在大量、新的RNA编辑位点[1],其中,位于染色体22q上的基因有29种.本文整理了这些基因与脑部疾病、肿瘤、胶质瘤及细胞中DNA复制或RNA合成相关的文献.     

应用腺相关病毒-规律间隔成簇短回文重复序列及其相关核酸酶9系统基因治疗威尔森氏症的实验研究

目的应用腺相关病毒(AAV)-规律间隔成簇短回文重复序列及其相关核酸酶9(CRISPR/Cas9)系统体外实验研究基因治疗威尔森氏症(WD)。方法选用2月龄雄性Toxic milk(TX)小鼠作WD模型,设计小向导RNA(sgRNA)并构建含有CRISPR元件的AAV载体质粒命名为pAAV-sgRNA1、2、3,制备AAV,病毒滴度达1~4×1013 GC/ml;感染WD肝细胞,72 h后提取基因组DNA,聚合酶链反应(PCR)后测序检测基因编辑效率,筛选出其中活性最高者sgRNA1,构建相应的同源修复模板(HT)质粒命名为pAAV-HT,应用AAV-sgRNA1和AAV-HT共感染WD肝细胞,测序和T7E1酶切检测模板修复效率;用HT特异性引物行PCR,验证HT掺入。组间比较采用Student’s t检验。结果Sanger测序结果显示,sgRNA1在体外有最高的编辑效率[(20.2±2.3)%],与sgRNA2、3比较[(3.1±1.3)%、(14.6±2.0)%],差异有统计学意义(P<0.05)。进一步用HT进行基因修正,能检出特异性修正后的ATP7B基因;二代测序测序显示修复率为(7.9±2.7)%。结论AAV-CRISPR系统在体外可以达到较高编辑效率和修复效率。     

慢病毒介导SOX9基因转染骨髓间充质细胞中的基因表达

目的:构建携带小鼠SOX9基因的慢病毒载体,体外转染小鼠骨髓间充质细胞,观察小鼠SOX9基因在小鼠间充质细胞中的表达。方法:从含有小鼠SOX9基因的质粒提取总RNA,利用RT-PCR方法扩增目的基因。连接目的基因与经Age-Ⅰ酶切线性化的慢病毒载体,转化感受态的大肠杆菌对质粒进行扩增,筛出阳性转化子,经293T细胞包装,收集病毒后,通过基因测序和限制性核酸内切酶酶切的方法对质粒进行鉴定。Lenti-SOX9-EGFP体外转染小鼠骨髓间充质细胞,利用倒置荧光显微镜观察转染是否成功,并通过流式细胞仪测定转染效率。同时利用RT-PCR和Western Blot检测小鼠SOX9基因的表达。结果:成功构建了携带SOX9基因慢病毒载体,Lenti-SOX9-EGFP能高效转染小鼠骨髓间充质细胞。RT-PCR和Western Blot检测显示经SOX9基因转染的小鼠骨髓间充质细胞表达目的基因产物。结论:利用慢病毒介导SOX9基因成功地转染小鼠骨髓间充质细胞,而且SOX9基因在小鼠骨髓间充质细胞中得到表达,这为SOX9修复软骨损伤的进一步研究奠定了基础。     

多囊肝病的相关基因、发病机制与临床治疗进展

多囊肝病(polycystic liver disease, PLD)是一组罕见的遗传病,并与多个基因的突变相关,目前已经发现了9个与PLD相关的基因。大多数PLD病人无症状,但如果肝脏严重肿大,PLD病人会出现腹痛、早饱、食管反流等症状。对于有症状的病人,目前主张采用手术治疗,包括抽吸-硬化治疗、开窗术、肝切除术和肝移植术。大量研究证明,环磷酸腺苷(cAMP)和Ca~(2+)水平对于囊肿的形成十分重要,目前已经有临床实验验证了生长抑素类似物和熊去氧胆酸的安全性和有效性。这种疾病的遗传机制也为基因编辑治疗提供了可能。该文主要针对PLD的相关基因、发病机制及临床治疗的进展进行综述。     

Ⅰ型神经纤维瘤病的基因治疗策略与前景

目的 总结Ⅰ型神经纤维瘤病（neurofibromatosis type 1,NF1）基因治疗策略和相关研究进展。方法 查阅近年来国内外关于NF1基因治疗的文献,对NF1基因结构、功能及其突变进行分析,并从转基因治疗和基因编辑两方面对基因治疗策略进行深入总结。结果 NF1是由抑癌基因NF1基因突变引起的常染色体显性遗传肿瘤性疾病,因神经纤维瘤蛋白功能受损而致病,临床表现复杂,目前尚无法根治。NF1的基因治疗策略仍处于研究和开发阶段。现有NF1转基因疗法主要是在神经纤维瘤蛋白缺陷的细胞中构建并表达Ras-GTP酶激活蛋白相关结构域基因片段,证实了NF1基因治疗的可行性;未来研究方向主要聚焦于使用拆分载体递送系统,增加单一载体的运载量,以及开发新的递送系统用于靶向递送全长NF1 cDNA。此外,新一代基因编辑工具在NF1等单基因遗传病的治疗领域应用潜力巨大,但效率和安全性尚需进一步验证。结论 基因治疗,包括转基因和基因编辑两大技术,有望成为NF1患者重要的新型治疗手段。     

高泳动家族性别决定基因9(Sox9)启动子转染软骨肉瘤细胞的实验研究

[目的]研究观察Sox9启动子在软骨肉瘤细胞中对软骨相关基因的调控与影响。[方法]将合成Sox9启动子表达质粒转染SW1535软骨肉瘤细胞,观察其在人体软骨肉瘤细胞中对Sox9基因和Ⅱ型胶原蛋白基因Col2a1蛋白及mRNA表达的影响。[结果]转染Sox9启动子后人体软骨肉瘤细胞中Sox9基因和Ⅱ型胶原蛋白基因Col2a1的蛋白表达及mRNA表达均较对照细胞强。[结论]外源性Sox9启动子可以稳定转染SW1535人体软骨肉瘤细胞,转染后可以增加Sox9基因和Ⅱ型胶原蛋白基因Col2a1蛋白及mRNA的表达。     

敲减SOX9基因对骨髓间充质干细胞表达的影响

目的:构建小鼠S0X9基因干扰的慢病毒载体,体外转染小鼠骨髓间充质干细胞,观察小鼠SOX9基因在小鼠间充质干细胞中的表达影响。方法:针对小鼠SOX9基因序列,设计RNA干扰靶点序列,合成含干扰序列的双链DNAoligo连入酶切后的RNA干扰载体上,构建Lenti-SOX9-siRNA-EGFP载体,鉴定扩增。利用SOX9基因沉默载体体外转染小鼠骨髓间充质细胞,利用倒置荧光显微镜观察转染是否成功,并通过流式细胞仪测定转染效率。同时利用RT-PCR和Western Blot检测小鼠SOX9基因的表达。结果:成功构建了Lenti-SOX9-siRNA-EGFP,SOX9基因沉默慢病毒载体,能高效转染小鼠骨髓间充质细胞。RT-PCR和Western Blot检测显示经SOX9基因转染的小鼠骨髓间充质细胞基因表达沉默。结论:利用慢病毒结合RNA干扰技术敲减小鼠SOX9基因成功地转染小鼠骨髓间充质干细胞,且SOX9基因在小鼠骨髓间充质干细胞中发生了沉默,这为SOX9修复软骨损伤的进一步研究奠定了基础。     

位于染色体22q13上的APOL1、ARSA和GGA1基因在人脑胶质瘤组织中mRNA表达

胶质瘤的发生源于多种基因的相互作用[1].新近研究表明染色体22q13上APOL1、ARSA和GGA1基因可能参与多种肿瘤细胞中的RNA编辑过程[2].本研究旨在观察中国人群胶质瘤肿瘤组织中是否存在这3种基因的异常表达.     

HyTK基因逆转录病毒重组质粒的构建及其在PA317细胞中的高表

目的:为开展逆转录病毒介导的HyTK基因治疗恶性肿瘤奠定实验基础。方法:利用逆转录病毒载体与潮霉素磷酸转移酶和单纯疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶的融合基因(HyTK)连接构建重组质粒pL(HyTK)SN,应用新一代的非脂质体基因转导系统FuGENETM6将构建的pL(HyTK)SN导入Ψ2单嗜性包装细胞并获得瞬间表达,继而再转染PA317双嗜性细胞。结果:获得高滴度重组病毒,上清逆转录病毒滴度为5.4×106cfu/ml。结论:所构建的HyTK基因可用于治疗恶性肿瘤。     

��״���ٹ��ܵ���֢������������������ϵpCKM-mPTH�����Ĺ�������

目的 研究构建重组表达体系pCKM-mPTH质粒，寻找甲状旁腺功能低下症的基因治疗途径。方法 采用重叠聚合酶链反应(PCR)法、巢式PCR法及粘端连接法构建pCKM-mPTH质粒，以脂质体转染骨骼肌细胞，用β-actin半定量和放免法分别测定其在细胞内外的表达。结果 嵌合基因pCKM-mPTH质粒测序完全符合已知核苷酸序列，并完成定点突变，转染骨骼肌细胞后，β-actin半定量法测得mPm在细胞内成功高效表达，放免法测得24h克隆细胞培养液中甲状旁腺激素蛋白的含量为26．37ng／L。结论 成功构建了SD(Sprague Dew-ley)大鼠重组基因表达体系pCKM-mPTH质粒，并证实其在骨骼肌细胞中有高效表达。     

肝细胞肝癌中p27KIP1基因的表达及意义

目的 探讨p27^KIP1与原发性肝细胞癌(HCC)发生、发展的关系。方法 应用SASC(链霉 素亲和康—生物康复合物)免疫组化染色和mRNA原位杂交方法，对52例肝细胞肝癌中p27^KIP1蛋白和mRNA的表达进行了检测。结果 p27^KIP1基因的表达主要位于肝或肝癌细胞的细胞核中，呈纫颗粒状分布。p27^KIP1蛋白在癌旁肝组织中的阳性细胞指数为(10．7士7．6)％，明显高于癌组织的(1．5士o．9)％，并且p27^KIP1蛋白表达的阳性细胞指数与HCC细胞的分化程度呈正相关。p27^KIP1mRNA杂交阳性物呈蓝色纫颗粒状，主要位于肝或肝癌细胞的细胞核和细胞浆中，mRNA阳性的细胞分布更广泛，但在癌旁肝组织和不同分化程度的HCC组织中，p27^KIP1mRNA的阳性细胞指数差异无显著性意义。结论p27^KIP1蛋白与HCC的发生及细胞分级有关。     

原发性肝癌PTEN和p27表达的相关研究

目的：研究PTEN和p27两种抑癌基因在原发性肝癌中的表达和两者间的关系。方法：应用免疫组化方法，对43例原发性肝癌患者、21例份肝硬化患者和16例正常对照的正常肝脏组织进行PTEN和p27的免疫组化研究。结果：原发性肝癌组PTEN的阳性表达率为41．9％（18／43），比肝硬化组和正常对照组明显下降：原发性肝癌组p27的阳性表达率为86．0％，比肝硬化组和正常对照组显著升高。PTEN的表达与肿瘤数目、分化高低、有无血管侵犯有关；p27的表达与原发性肝癌的大小、肿瘤数目、分化高低、有无血管侵犯有关。PTEN蛋白和p27蛋白在原发性肝癌中无相关关系。结论：PTEN作为抑癌基顺在原发性肝癌中发挥作用，p27有其组织特异性，PTEN和p27表达在原发性肝癌中无相关性。     

携带融合基因CTLA4-Ig重组腺病毒载体的构建及表达

目的　为进行基因转移阻断T细胞共刺激通路诱导移植免疫耐受的研究 ,构建携带融合基因CTLA4 Ig的重组腺病毒载体。方法　构建含人CTLA4 Ig的重组腺病毒载体质粒pShuttle Tracker CMV CTLA4 Ig ,与腺病毒骨架质粒 pAdEasy 1 △E1、△E3共转化大肠杆菌BJ5 183 ,经细菌内同源重组 ,获得重组腺病毒质粒pAd Tracker CTLA4 Ig ,转染 2 93细胞 ,制备携带CTLA4 Ig的重组腺病毒 ,体外感染L O2细胞 72h后ELISA检测其外分泌性表达。 结果　获得携带CTLA4 Ig的重组腺病毒 ,滴度为 6× 10 1 3 PFU L ;在其感染的L O2细胞培养上清中能检测到可溶性重组蛋白CTLA4 Ig的表达 (P N =4.6 ,阳性 )。结论　制备的重组腺病毒在体外能有效感染L O2细胞 ,受感染细胞能表达、分泌可溶性的融合蛋白CTLA4 Ig ;为进行体内移植免疫耐受的基因治疗研究奠定基础。     

人生长激素基因的克隆、高效表达及纯化

目的 研究人生长激素(hGH)基因在原核中的高效表达、纯化及鉴定。方法 设计带双酶切位点引物,采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法获得hGH cDNA片段,并亚克隆入pUC19质粒中进行 DNA序列测定。将 hGH cDNA片段克隆入原核表达载体 pBV220中进行表达。表达产物经 7mol/L 盐酸胍裂解变性、复性、层析等一系列纯化研究,纯化产物经SDS-PAGE电泳,高压液相色谱法(HPLC)纯度分析及活性测定,并通过N末端氨基酸序列测定鉴定表达产物。结果 RT-PCR扩增所得片段大小与预期值一致。pBV220-hGH表达产物经SDS-PAGE电泳显示,分子量为 22×10~3与预计结果相符。rhGH表达量占菌体总蛋白量的 40％。表达产物纯化后,纯度达 97％以上,比活性大于 3.0 IU/mg。纯化产物经 N末端 15个氨基酸测定验证,为重组人生长激素。结论 成功构建了 pBV220-hGH原核表达质粒,并在大肠杆菌中高效表达,表达产物经纯化得到纯度≥97％的 rhGH,比活性大于 3.0 IU/mg。该研究为 rhGH的中试生产奠定了基础。     

TRANSFER OF PLATELET-DERIVED GROWTH FACTOR-BB GENE BY GENE GUN INCREASES CONTRACTION OF COLLAGEN LATTICE BY FIBROBLASTS IN DIABETIC AND NON-DIABETIC HUMAN SKIN

We have used an in vitro model of wound contraction, the fibroblast-populated collagen lattice, to examine the effect of platelet-derived growth factor BB (PDGF-BB) and PDGF-BB gene transfer by gene gun on the contraction of lattices composed of either diabetic or non-diabetic human fibroblasts. The area of collagen lattice and DNA synthesis were measured in 12 specimens. There were significant increases in lattice contraction with increasing doses of PDGF-BB and fibroblasts transfected with the PDGF-BB gene compared with control (p &lt; 0.01). DNA synthesis of the non-diabetic and diabetic fibroblast lattices showed significantly increased incorporation of tritiated thymidine with increasing doses of PDGF-BB and fibroblasts transfected with the PDGF-BB compared with controls (p &lt; 0.05). The effect of PDGFBB gene transfer on diabetic and non-diabetic fibroblasts was similar to that of 20 ng/ml or less of PDGF-BB.     

CD基因联合GM-CSF基因对胰腺癌治疗作用的实验研究

目的：观察自杀基因CD联合GM—CSF基因的抗胰腺癌作用。方法：应用逆转录病毒方法转导CD和GM—CSF基因。皮下接种胰腺癌细胞TD2，肿瘤局部注射重组表达的pVITR02-CD-GM—CSF，然后连续10d给予5-氟胞嘧啶（5-Fc）300mg／kg治疗，观察肿瘤的生长情况。结果：CD／5-Fc联合GM—CSF治疗后，小鼠肿瘤体积显著缩小，存活期明显延长，与对照组以及GM—CSF组和CD／5-Fc组比较差异有统计学意义（P〈0．05，P〈0．01），且肿瘤瘤体内CD8^＋细胞浸润增加，MHC—Ⅰ和B7—1表达明显增加。结论：CD基因联合细胞因子基因GM—CSF可增强CD的抗肿瘤作用，其疗效要好于GM—CSF或CD基因单独治疗。     

肠粘连引起肠梗阻的基因水平研究

目的通过分析基因层面的差异表达,以探讨与肠梗阻相关的发病基因和治疗靶基因。方法在基因表达公共数据库（geneexpressionomnibus,GEO）中收集到10个样品的基因表达数据,其中小鼠粘连小肠组织术后1、3、7、和14d时间点的基因芯片数据共8个,小鼠正常小肠组织芯片数据2个,应用基因本体论（geneontology,GO）富集分析和微阵列显著性分析（significanceanalysisofmicroarray,SAM）方法,分析10个样品的基因表达情况,并对差异表达的基因进行功能注释和生物学分析。结果肠粘连的发生伴随着大量应答刺激的基因表达上调,且这些基因产物都分布在细胞膜上。分析术后不同时间点的基因表达情况发现,Hmgcs2基因的表达上调出现在术后3～14d,融助5基因的表达上调出现在术后14d。结论粘连的发生可能与应答刺激的基因及其分布于细胞膜上的基因产物有关,Hmgcs2和s抚幼5基因可能与因粘连而导致的其他并发疾病的发生有关。这为发现肠梗阻潜在的治疗靶点提供了依据。     

增生性瘢痕相关基因的筛选

目的　利用基因芯片技术寻找增生性瘢痕形成过程中的相关基因 ,并发现相关基因间的相互关系 ,探讨增生性瘢痕的机理。方法　选择 6例标本 ,3例增生性瘢痕与 3例正常皮肤 ,分成 3组 ,提取各个标本的总DNA ,制成荧光标记的cDNA探针 ,与含 4 0 0 0个人类靶基因的芯片 ( 15 0 0个为已知基因 ,2 5 0 0个为未报道或未知功能的基因 )杂交 ,经扫描、生物信息学分析比较两种组织间的差异表达。结果　增生性瘢痕与正常皮肤的差异表达基因在 3组间仅出现 1次的有 3 96个、重复 2次出现的有 186～ 2 4 2个、共同出现的有 116个 ,其中上调 10 8个、下调 8个 ,涉及 13大类基因 ,包括抑癌与原癌基因、细胞凋亡、细胞骨架与运动蛋白、细胞周期类蛋白等 ,有些为已知基因 ,有些仍未知其功能。结论　基因芯片扫描对研究增生性瘢痕有效可靠 ,发现多种基因参与了增生性瘢痕的形成过程