微小RNA-142-3p靶向CD133对肝癌细胞增殖、侵袭和干细胞特性的影响

目的观察微小RNA(miR)-142-3p靶向CD133对肝癌细胞增殖、侵袭和干细胞特性的影响。方法选取郑州大学第二附属医院2017年6月至2019年12月手术切除的肝癌组织和对应的癌旁组织作为研究对象。采用荧光定量聚合酶链反应(PCR)分析癌旁组织和肿瘤组织miR-142-3p表达水平。采用慢病毒在MHCC97H肝癌细胞建立miR-142-3p过表达和对照细胞系(miR-142-3p组和对照组),采用细胞计数试剂盒(CCK-8)和EdU染色分析两组细胞增殖;采用Transwell分析两组细胞侵袭;采用软琼脂克隆形成实验分析两组细胞干细胞特性;生物信息学和双荧光素酶报告基因分析miR-142-3p靶基因;采用蛋白质印迹法(Western blot)分析两组增殖、侵袭和干细胞标志物细胞核增殖抗原(Ki-67)、基质金属蛋白酶(MMP)-9、CD133和Nanog蛋白表达水平,组间比较采用t检验。结果miR-142-3p组细胞miR-142-3p表达水平(0.41±0.12)显著低于癌旁组织miR-142-3p表达水平(1.06±0.25),差异有统计学意义(t=3.081,P<0.05)。miR-142-3p组细胞吸光度(A)值(1.63±0.20)低于对照组细胞A值(2.13±0.22),差异有统计学意义(t=2.918,P<0.05)。miR-142-3p组细胞EdU染色阳性率[(30.48±5.12)%]低于对照组细胞EdU染色阳性率[(87.89±7.28)%],差异有统计学意义(t=3.409,P<0.05)。miR-142-3p组细胞Ki-67蛋白表达水平(0.50±0.13)低于对照组细胞Ki-67表达水平(1.15±0.14),差异有统计学意义(t=2.319,P<0.05)。miR-142-3p组细胞侵袭数量[(67.59±6.01)个]低于对照组细胞侵袭数量[(121.35±6.12)个],差异有统计学意义(t=3.409,P<0.05)。miR-142-3p组细胞MMP-9蛋白表达水平(0.48±0.18)低于对照组细胞MMP-9蛋白表达水平(1.57±0.15),差异有统计学意义(t=2.917,P<0.05)。miR-142-3p组细胞克隆形成率[(31.44±4.51)%]低于对照组细胞克隆形成率[(57.68±7.19)%],差异有统计学意义(t=5.103,P<0.05)。miR-142-3p组细胞Nanog蛋白表达水平(0.51±0.14)低于对照组细胞Nanog蛋白表达水平(1.36±0.17),差异有统计学意义(t=2.514,P<0.05)。生物信息学和双荧光素酶报告基因显示CD133是miR-142-3p的靶基因。miR-142-3p组细胞CD133蛋白表达水平(0.43±0.11)低于对照组细胞CD133蛋白表达水平(1.15±0.13),差异有统计学意义(t=2.514,P<0.05)。结论miR-142-3p通过靶向调控CD133表达水平调节着肝癌细胞增殖、迁移和干细胞特性。     

微小RNA-27b-3p与基质金属蛋白酶13在人软骨细胞的对应关系

目的探讨微小RNA-27b-3p(miR-27b-3p)与基质金属蛋白酶-13(MMP-13)在人软骨细胞表达及其靶向对应关系。 方法运用蛋白质印迹法(WB)与实时定量PCR技术(qRT-PCR)明确miR-27b-3p与MMP13在正常和骨关节炎(OA)人软骨细胞的表达。利用不同浓度的白介素(IL)1β干预原代人软骨细胞24 h,或利用不同时间点的IL-1β(10 ng/ml)干预原代人软骨细胞。利用原位杂交、转染及双荧光素酶报告技术确定miR-27b-3p与MMP13的靶向对应关系;结合运用核转录因子-κB(NF-κB)和丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路抑制剂评估其作用机制。两组资料比较采用独立样本t检验,多组资料比较采用单因素方差分析,LSD法多重比较检验。 结果WB、qRT-PCR和原位杂交检测结果显示,与正常软骨相比,OA软骨中miR-27b-3p表达降低(t＝5.07,P<0.01),MMP13表达升高(t＝－6.31,P<0.01)。IL-1β干扰后的结果显示miR-27b-3p表达降低(F＝129.54,P<0.05),MMP-13表达升高(F＝394.50,P<0.05)。通过TargetScan数据库和荧光素酶报告基因检测结果分析,野生型-MMP13组荧光素酶活性降低(F＝55.27,P<0.001),突变型-MMP-13荧光素酶活性变化没有统计学意义(P＝0.654)。利用特异性MAPK信号抑制剂和NF-kB抑制剂干预IL-1β诱导软骨细胞模型结果提示,与对照组相比,抑制剂组的MMP13表达水平降低(F＝28.43,P<0.001),miR-27b-3p表达水平增高(F＝35.04,P<0.001)。 结论miR-27b-3p在OA软骨细胞呈现低表达,并负向调控MMP13的表达,其作用机制可能是通过NF-κB和MAPK信号通路,这结果提示这miR-27b-3p可能作为OA诊断与治疗的潜在靶点。     

微小RNA-205-5p调控轴抑制蛋白2基因表达对结肠癌细胞增殖凋亡的影响及作用机制的临床研究

目的探讨微小RNA(microRNA,miR)-205-5p靶向调节轴抑制蛋白2(AXIN2)基因表达对结肠癌细胞增殖凋亡的影响及作用机制。方法收集2017年1月至2019年1月山西省人民医院手术切除结肠癌组织组织标本并购买结肠癌细胞系,分别以距肿瘤边缘5 cm的癌旁组织和人正常结肠黏膜上皮细胞系为对照。实时定量反转录聚合酶链反应(RT-qPCR)和蛋白质印迹法(Western blot)检测分别检测组织和细胞中miR-205-5p和AXIN2表达水平。荧光素酶报告实验验证miR-205-5p与AXIN2的靶向关系。细胞计数试剂盒(CCK-8)法和流式细胞术检测各组转染细胞增殖和凋亡变化,两组和多组间比较分别采用t检验和单因素方差分析。结果结肠癌组织及细胞系中miR-205-5p低表达(2.16±0.24比1.00±0.04,t=10.660,P<0.01),AXIN2高表达(mRNA,0.21±0.02比1.00±0.04,t=30.600,P<0.01;蛋白,0.64±0.03比1.44±0.06,t=26.670,P<0.05),差异均有统计学意义。AXIN2是miR-205-5p的靶基因。mimic组AXIN2蛋白表达量显著低于Blank组和NC组,差异有统计学意义(0.33±0.03,t=116.490,P<0.05);miR-205-5p抑制剂(inhibitor)组AXIN2蛋白表达量显著高于Blank组和NC组,差异有统计学意义(1.67±0.11,t=11.270,P<0.05)。miR-205-5p mimic组(增殖,48 h 0.82±0.09,t=5.375,P<0.05;72 h 1.46±0.13,t=3.333,P<0.05;凋亡,28.71±2.27,t=12.350,P<0.05)和AXIN2沉默表达(siRNA-AXIN2)组(增殖,48 h 1.11±0.11,t=2.814,P<0.05;72 h 1.68±0.06,t=4.959,P<0.05;凋亡,4.45±0.64,t=5.090,P<0.05)结肠癌细胞增殖率显著低于Blank组和NC组,细胞凋亡率显著高于Blank组和NC组,差异有统计学意义;而miR-205-5p inhibitor组(增殖,48 h 2.11±0.18,t=4.386,P<0.05;72 h 2.66±0.19,t=4.898,P<0.05;凋亡,4.71±0.26,t=5.155,P<0.05)和AXIN2过表达(OE-AXIN2)组(增殖,48 h 0.44±0.05,t=0.002,P<0.05;72 h 0.88±0.11,t=7.446,P<0.05;凋亡,25.65±2.12,t=10.900,P<0.05)结肠癌细胞增殖率显著高于Blank组和NC组,细胞凋亡率显著低于Blank组和NC组,差异有统计学意义。结论miR-205-5p在结肠癌中异常升表达,AXIN2呈低表达。miR-205-5p抑制表达靶向上调AXIN2表达可抑制结肠癌细胞增殖、促进细胞凋亡。     

微小RNA-143-3p靶向调控Kirsten鼠肉瘤病毒癌基因介导丝裂原活化蛋白激酶/细胞外调节蛋白激酶信号通路对胃癌细胞增殖侵袭及上皮间质转化的作用机制

目的探讨miR-143-3p靶向调控Kirsten鼠肉瘤病毒癌基因(KRAS)介导丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)/细胞外调节蛋白激酶(ERK)信号通路对胃癌细胞增殖和侵袭的作用机制。方法双荧光素酶报告基因实验验证miR-143-3p与KRAS基因的靶向关系。将购自上海中国科学院的胃癌细胞株转染分组,将筛选人胃癌细胞株按照不同转染构建分为6组,miR-143-3p mimic阴性对照(negative control,NC)组、miR-143-3p Inhibitor NC组、miR-143-3p mimic组、miR-143-3p Inhibitor组、si-KRAS NC组、si-KRAS组、miR-143-3p Inhibitor+si-KRAS组。实时定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)和蛋白质免疫印迹(Western blot)法检测转染后各组细胞相关因子的mRNA和蛋白的表达情况。细胞计数试剂盒-8(CCK-8)法及Transwell小室法检测胃癌细胞增殖及侵袭能力的变化。组间比较采用t检验。结果双荧光素酶报告基因实验证明KRAS是miR-143-3p靶基因。miR-143-3p mimic组的miR-143-3p表达量高于NC组(t=17.630,P<0.05),在miR-143-3p inhibitor组中表达量低于NC组(t=20.780,P<0.05),差异有统计学意义。在miR-143-3p mimic组(mRNA:KRAS为1.00±0.05比0.33±0.03,t=19.900;ERK为1.00±0.05比0.27±0.01,t=24.800;JNK为1.00±0.06比0.60±0.04,t=9.608;E-cadherin为1.00±0.04比1.69±0.06,t=16.570;N-cadherin为1.00±0.03比0.54±0.04,t=15.930;Snail为1.00±0.05比0.39±0.03,t=18.120;蛋白:KRAS为0.54±0.04比0.23±0.01,t=13.020;ERK为0.63±0.04比0.30±0.01,t=13.860;JNK为0.71±0.05比0.33±0.02,t=12.220;E-cadherin为0.85±0.05比1.20±0.06,t=7.762;N-cadherin为0.44±0.03比0.36±0.02,t=3.843;Snail为0.50±0.03比0.25±0.01,t=13.690)中KRAS、p-ERK/ERK、p-JNK/JNK、N-cadherin和Snail的mRNA和蛋白表达量低于NC组,而E-cadherin的mRNA和蛋白表达量高于NC组,细胞增殖(miR-143-3p mimic组:48 h为1.124±0.060比0.978±0.050,t=3.238;72 h为2.545±0.120比2.122±0.110,t=4.501;si-KRAS组:48 h为1.140±0.060比1.020±0.060,t=2.449;72 h为2.500±0.120比2.070±0.100,t=4.768)及侵袭能力(miR-143-3p mimic组:210.00±10.00比110.00±7.00,t=14.190;si-KRAS组:215.00±12.00比100.00±6.00,t=14.850)低于NC组,差异均有统计学意义(P值均<0.05);而miR-143-3p Inhibitor组前述趋势逆转(P值均<0.05),差异有统计学意义。结论miR-143-3p抑制靶向KRAS基因表达,阻断MAPK/ERK信号通路的激活,从而抑制人胃癌增殖侵袭,并调控上皮间质转化进程。     

微小RNA-23a-5p/肿瘤蛋白53诱导的核蛋白1调控胰腺癌细胞吉西他滨耐药的实验研究

目的探讨微小RNA(microRNA,miR)调控胰腺癌吉西他滨耐药的分子作用机制。方法反转录聚合酶链反应(qPCR)检测来自桂林医学院附属医院2015年1月至2018年12月收治的胰腺癌患者的临床标本miR-23a-5p表达水平,细胞实验检测miR-23a-5p对吉西他滨处理下肿瘤蛋白53诱导的核蛋白1(TP53INP1)及细胞增殖和凋亡相关因子表达的影响,噻唑蓝(MTT)检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞凋亡情况。荧光素酶报告实验检测miR-23a-5p和TP53INP1是否直接作用。构建胰腺癌皮下成瘤小鼠模型,检测动物体内miR-23a-5p瘤体大小和吉西他滨耐药性的影响,组间比较采用多重比较检验或t检验。结果耐药组织中miR-23a-5p的表达量显著高于不耐药组(2.267±0.334,t=4.355,P<0.01),miR-23a-5p直接靶向调控TP53INP1降低其表达(0.423±0.095,t=5.649,P<0.01),miR-23a-5p过表达组(IC50=13.23)胰腺癌细胞增殖活性显著高于对照组(IC50=8.32,t=5.119,P<0.01),细胞凋亡比例[(15.080±0.838)%]显著低于对照组[(30.710±0.566)%,t=7.163,P<0.01],TP53INP1和miR-23a-5p共处理组(IC50=7.932)胰腺癌细胞增殖水平显著低于miR-23a-5p单独处理组(IC50=12.570,t=12.57,P<0.01),凋亡水平[(32.350±3.212)%]显著高于miR-23a-5p单独处理组[(15.680±1.358)%,t=6.764,P<0.01],动物实验结果表明敲低miR-23a-5p吉西他滨处理后显著抑制肿瘤生长[(169.090±25.889)cm^3,t=4.351,P<0.01;(0.097±0.031)g,t=3.776,P<0.01],差异均有统计学意义。结论miR-23a-5p介导TP53INP1调控胰腺癌细胞凋亡和吉西他滨耐药。     

特异性核基质结合区结合蛋白1和微小RNA-495-3P在甲状腺乳头状癌侵袭和转移中的作用

目的探讨特异性核基质结合区结合蛋白1(SATB1)和微小RNA(microRNA,miR)-495-3P在甲状腺乳头状癌(PTC)侵袭和转移中的作用。方法2019年9月至2020年4月,福建医科大学附属第二医院甲状腺乳腺外科采集肿瘤标本,将取得的40对PTC组织作为实验组,与之对应40对癌旁正常组织作为对照组。采用实时定量反转录聚合酶链反应(RT-qPCR)检测40对PTC组织及癌旁正常组织中SATB1和miR-495-3p的表达水平,用蛋白质印迹法(Western blot)检测16对PTC组织及癌旁正常组织中SATB1蛋白的表达水平。用si-SATB1转染人甲状腺乳头状癌细胞(TPC)-1后,用RT-qPCR、Western blot检测TPC-1中SATB1、miR-495-3p的表达水平,并用Pearson分析法进行相关性分析,转染si-NC的TPC-1为阴性对照组,转染si-SATB1的TPC-1为实验组。分别用细胞计数试剂盒(CCK-8)法、流式细胞计数、Trsnawell法检测敲低SATB1的表达对TPC-1增殖、凋亡、周期、侵袭、迁移能力的影响。两样本比较采用t检验。结果与癌旁正常组织比较,SATB1 mRNA和SATB1蛋白在PTC组织中呈高表达(1.27±0.14比0.86±0.23,t=8.484,P<0.01;0.94±0.10比0.37±0.15,t=11.890,P<0.01),差异有统计学意义,miR-495-3p呈低表达(0.78±0.11比1.37±0.64,t=5.741,P<0.01),差异有统计学意义。SATB1和miR-495-3p的异常表达均与PTC淋巴结转移明显相关(1.34±0.14,t=2.576,P<0.05;0.74±0.07,t=2.187,P<0.05)。PTC中SATB1和miR-495-3p的表达水平呈负相关(r=-0.497,P<0.01)。干扰TPC-1中SATB1的表达会导致miR-495-3p的表达水平高于阴性对照组(8.59±0.16比1.01±0.02,t=81.420,P<0.01),并且抑制细胞的增殖能力(0.39±0.01、0.52±0.01、0.58±0.03比0.43±0.01、0.60±0.01、0.72±0.01,t=4.899、9.798、7.668,P<0.01)、促进细胞凋亡[(42.8±2.1)%比(7.6±0.7)%,t=27.540,P<0.01]、减弱细胞侵袭(75.33±3.51比206.33±5.51,t=34.730,P<0.01)、迁移(202.00±7.81比528.33±5.03,t=60.840,P<0.01)能力并发生G2/M周期阻滞[(36.7±1.2)%比(15.6±0.9)%,t=24.360,P<0.01],差异均有统计学意义。结论miR-495-3p可能作为1种调节因子和SATB1共同参与了PTC侵袭、转移的过程。     

微小RNA-138-5p在前列腺癌细胞中的表达及对其侵袭能力的影响

目的探讨微小RNA(miR)-138-5p在前列腺癌(PCa)中的表达及对前列腺癌侵袭、迁移、凋亡等能力的影响。方法miR-138-5p模拟物转染正常前列腺上皮细胞(RWPE)-1、DU145细胞,实时定量反转录聚合酶链反应(RT-qPCR)用于检测转染前后细胞miR-138-5p的表达。细胞计数试剂盒(CCK-8)实验、Transwell实验、划痕实验和凋亡实验分析miR-138-5p对PCa侵袭、迁移等能力的影响。GraphPad Prism 6 V6.01用于数据分析,组间比较采用Student’s t检验。结果RT-qPCR结果表明miR-138-5p在DU145细胞中的表达量(0.470±0.111)低于RWPE-1细胞(5.120±0.824);转染后,RWPE-1 mimic中miR-138-5p的表达量(18.150±2.742)明显高于RWPE-1 NC(4.930±0.586,t=6.670,P<0.01),DU145 mimic中miR-138-5p的表达量(9.865±1.006)高于DU145 NC(0.526±0.145,t=12.990,P<0.01),差异均有统计学意义;提高miR-138-5p表达水平后,PCa细胞活力下降;DU145 mimic的迁移面积抑制率[(1.50±0.08)%]高于NC组[(1.00±0.03)%,t=8.382,P<0.01],差异有统计学意义;DU145 mimic的侵袭细胞数[(102.00±5.96)个]低于NC组[(198.00±15.09)个,t=8.392,P<0.01],差异有统计学意义;DU145细胞mimic组的凋亡率[(17.660±1.312)%]高于NC组[(4.990±0.674)%,t=12.150,P<0.01],差异有统计学意义,PCa细胞的凋亡增加。结论miR-138-5p可以负向调节PCa细胞的活力、迁移和侵袭,促进PCa细胞凋亡.     

miR-3126-5p靶向 LASP1抑制结直肠癌细胞的增殖和迁移的机制探讨

目的探讨微小RNA(miRNA)-3126-5p抑制靶基因LIM和SH3蛋白1(LIM and SH3 protein 1.LASP1)对结直肠癌细胞增殖和迁移能力的影响。方法采用实时定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)法检测结直肠癌细胞株(HT-29、HCT116、LoVo、SW480)和正常肠黏膜上皮细胞(HIEC)中miR-3126-5p的表达水平。选择表达水平最低的细胞株作为实验对象,实验分为2组:阴性对照组(转染miR-NC)和miR-3126-5p组(转染miR-3126-5p),转染48 h后收集各组细胞。qRT-PCR法检测各组细胞miR-3126-5p的表达水平。采用MTS法和划痕愈合实验分别检测各组细胞的增殖水平和迁移能力。采用生物信息学软件microRNA.org和双荧光素酶报告基因实验分别预测和验证miR-3126-5p的靶基因。采用qRT-PCR和Western blot检测各组细胞靶基因的表达水平。计量资料以均数土标准差(Mean±SO)表示,两两组间比较采用t检验,多组间比较采用单因素方差分析结果与正常肠黏膜上皮细胞(HIEC)相比,结直肠癌细胞株miR-3126-5p的表达水平显著降低(P<0.05),表达水平最低的细胞株是HCT116细胞(P<0.01)。阴性对照组和miR-3126-5P组HCT116细胞中miR-3126-5p的表达分别为(1.05±0.16)和(7.91±1.26),差异具有统计学意义(t=5.40,P<0.01)。与阴性对照组相比,miR-3126-5p组HCT116细胞的增殖能力显著降低(P<0.05),迁移能力显著下降(t=4.52,F<0.01)。microRNA.org显示miR-3126-5p与LIM和SH3蛋白1(LASP1)基因mRNA存在互补结合位点。miR-3126-5p和L4SP/mRNA能够靶向结合(P<0.01)。与阴性对照组相比,miR-3126-5p组H CT116细胞中L4SP/基因表达显著降低(t=4.56,P<0.01)。结论结直肠癌细胞株中miR-3126-5p呈低表达,miR-3126-5p能够通过抑制靶基因LASP1降低结直肠癌HCT116细胞的增殖和迁移能力。     

长链非编码RNA同源异形盒转录反义RNA通过微小RNA-520g-3p调控胰腺癌细胞增殖、迁移的实验研究

目的探讨长链非编码RNA同源异形盒转录反义RNA(lncRNA HOTAIR)通过靶向微小RNA-520g-3p(miR-520g-3p)对胰腺癌细胞增殖、迁移能力的影响。方法实时定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)检测胰腺癌细胞中miR-520g-3p、HOTAIR表达水平;转染HOTAIR小干扰RNA至SW1990胰腺癌细胞中,并分为NC组、siHOTAIR-1组、siHOTAIR-2组。细胞计数试剂盒(CCK-8)实验检测细胞增殖能力,划痕愈合实验检测细胞迁移能力;双荧光素酶报告基因实验验证miR-520g-3p与HOTAIR靶向调控关系,两组之间的定量资料比较采用t检验。结果qRT-PCR结果表明SW1990中HOTAIR mRNA水平明显高于人正常胰腺导管上皮细胞(HPDE,3.08±0.33比1.57±0.17,t=29.830,P<0.01);miR-520g-3p在SW1990中的表达水平明显低于人正常胰腺导管上皮细胞(HPDE,0.93±0.11比2.63±0.24,t=22.410,P<0.01);HOTAIR小干扰RNA转染至SW1990中,72 h后NC组细胞吸光度(A)值明显高于siHOTAIR-1组、siHOTAIR-2组(3.52±0.99比1.92±0.23、2.36±0.58,t=6.340、5.150,P<0.01);降低HOTAIR表达48 h后,NC组细胞划痕愈合面积百分比为显著高于siHOTAIR-1组、siHOTAIR-2组[(85.37±9.82)%比(50.56±5.82)%、(35.28±6.86)%,t=7.760,14.750,P<0.01],差异均有统计学意义。双荧光素酶报告基因表明miR-520g-3p可明显降低野生型HOTAIR载体荧光素酶活性。下调miR-520g-3p表达水平后,SW1990细胞增殖及迁移能力高于对照组(t=13.190、12.480,P<0.01),差异有统计学意义。结论HOTAIR可通过靶向负调控miR-520g-3p影响胰腺癌细胞增殖、迁移能力。     

miR-1249-5p对前列腺癌PC-3细胞增殖、转移和细胞周期的影响

目的探讨miR-1249-5p对前列腺癌PC-3细胞增殖、转移和细胞周期的影响。方法采用OncoMir肿瘤数据库(OMCD)分析miR-1249-5p表达水平与前列腺癌患者总生存期的关系。将人前列腺癌细胞株PC-3分为两组:miR-1249-5p组和阴性对照组。以Lipofectamine 2000为介导,将miR-1249-5p拟似物脂质体复合物或阴性miRNA脂质体复合物转染入对数生长期的PC-3细胞。采用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测两组PC-3细胞miR-1249-5p的表达水平,采用集落形成实验检测两组PC-3细胞增殖能力的变化,采用Transwell实验检测两组PC-3细胞侵袭变化,采用流式细胞仪检测两组PC-3细胞周期变化。通过miRNA预测软件miRGator预测miR-1249-5p的靶基因。RT-qPCR和Western blotting法分别检测miR-1249-5p的靶基因表达。计量资料以均数±标准差(x±s)表示,两组间比较采用t检验。结果与miR-1249-5p低表达的前列腺癌患者相比,miR-1249-5p表达水平较高的前列腺癌患者总生存期较长,差异具有统计学意义(P<0.01)。miR-1249-5p组miR-1249-5p表达水平(10.74±1.19)明显高于阴性对照组(1.56±0.27),差异具有统计学意义(P<0.01)。miR-1249-5p组集落形成数[(35.86±6.94)个/孔]明显少于阴性对照组[(88.94±11.66)个/孔],差异具有统计学意义(P<0.01)。miR-1249-5p组穿膜细胞数[(25.01±6.83)个/高倍视野]明显少于阴性对照组[(82.76±8.35)个/高倍视野],差异具有统计学意义(P<0.01)。miR-1249-5p组处于G_(0)~G_(1)期的细胞比例[(50.79±6.61)%]明显高于阴性对照组[(27.09±2.30)%],差异具有统计学意义(P<0.01),PC-3细胞被抑制在G_(0)~G_(1)期。神经前体细胞表达发育调控蛋白9(NEDD9)可能是miR-1249-5p的靶基因。与阴性对照组比较,miR-1249-5p组NEDD9基因表达水平显著低于阴性对照组,差异具有统计学意义(P<0.01)。结论miR-1249-5p可以抑制前列腺癌PC-3细胞增殖、转移和细胞周期,其可能通过负调控原癌基因NEDD9表达实现。     

长链非编码RNA氧化应激反应丝氨酸丰富1反义RNA 1对肾癌细胞增殖、迁移及侵袭的影响

目的探讨长链非编码RNA氧化应激反应丝氨酸丰富1反义RNA 1(lncRNA OSER1-AS1)对肾癌ACHN细胞的增殖、迁移、侵袭的影响及其对微小RNA(microRNA,miR)-612的调控作用。方法2017年1月至2020年3月,采用实时定量反转录聚合酶链反应(RT-qPCR)法检测肾癌组织、癌旁组织中OSER1-AS1、miR-612的表达量;体外培养肾癌细胞ACHN,分别将OSER1-AS1小分子干扰RNA(si-OSER1-AS1)及其阴性对照(si-NC)、miR-612寡核苷酸模拟物(miR-612 mimics)及阴性对照mimic NC序列(miR-NC)、si-OSER1-AS1与miR-612特异性寡核苷酸抑制剂的阴性对照(anti-miR-NC)、si-OSER1-AS1与miR-612特异性寡核苷酸抑制剂(anti-miR-612)转染至ACHN细胞;采用RT-qPCR法检测细胞中OSER1-AS1、miR-612的表达量;采用噻唑蓝(MTT)、Transwell小室实验分别检测细胞增殖、迁移及侵袭能力;双荧光素酶报告实验检测OSER1-AS1、miR-612的靶向关系;蛋白质印迹法(Western blot)检测细胞周期蛋白1(Cyclin D1)、基质金属蛋白酶(MMP)-2、MMP-9、p21蛋白表达量。两组间比较采用独立样本t检验,多组间比较采用单因素方差分析。结果肾癌组织OSER1-AS1的表达水平(1.00±0.08比3.37±0.28)高于癌旁组织(t=52.113,P<0.05),miR-612的表达水平(1.00±0.06比0.47±0.04)低于癌旁组织(t=47.062,P<0.05);si-OSER1-AS1组细胞活力(0.66±0.05比0.31±0.03)与Cyclin D1(0.63±0.05比0.25±0.02)、MMP-2(0.82±0.07比0.35±0.03)、MMP-9(0.76±0.06比0.28±0.03)蛋白水平低于si-NC组(t=18.007、21.169、18.514、21.466,P<0.05),si-OSER1-AS1组迁移细胞数[(115.56±9.52)个比(55.99±5.59)个]、侵袭细胞数[(93.41±6.09)个比(46.05±4.35)个]低于si-NC组(t=16.188、18.984,P<0.05),si-OSER1-AS1组p21蛋白水平(0.15±0.02比0.57±0.05)高于si-NC组(t=23.398,P<0.05);miR-612组细胞活力(0.68±0.05比0.39±0.03)与Cyclin D1(0.66±0.05比0.28±0.03)、MMP-2(0.85±0.06比0.46±0.03)、MMP-9(0.78±0.05比0.34±0.02)蛋白水平低于miR-NC组(t=14.920、19.551、17.441、24.512,P<0.05),miR-612组迁移细胞数[(118.76±9.87)个比(64.39±4.65)个]、侵袭细胞数[(99.65±9.12)个比(53.57±3.67)个]低于miR-NC组(t=14.950、14.062,P<0.05),miR-612组p21蛋白水平(0.14±0.02比0.51±0.04)高于miR-NC组(t=24.820,P<0.05);双荧光素酶报告实验证实OSER1-AS1可靶向结合miR-612;抑制miR-612表达可明显逆转干扰OSER1-AS1对细胞增殖、迁移及侵袭的作用。结论干扰OSER1-AS1可通过上调miR-612的表达从而抑制肾癌ACHN细胞增殖、迁移及侵袭。     

长链非编码RNA ST8SIA6-AS1通过调节微小RNA-142-3p促进肝细胞癌的增殖和侵袭

目的探讨ST8SIA6-AS1靶向结合微小RNA(microRNA,miR)-142-3p,影响肝细胞癌的增殖和侵袭能力。方法用基因表达谱数据动态分析(GEPIA)验证ST8SIA6-AS1在肝细胞肝癌(HCC)和邻近正常组织中的差异表达。采用实时定量反转录聚合酶链反应(RT-qPCR)检测ST8SIA6-AS1和miR-142-3p在组织水平和细胞水平的表达量。采用细胞计数试剂盒(CCK-8)和集落形成实验检测人肝癌细胞Hep3B的增殖情况;采用迁移侵袭实验(Transwell法)检测肝癌Hep3B细胞迁移和侵袭情况。生物信息学、双荧光素酶报告实验验证ST8SIA6-AS1与miR-142-3P的靶向关系。组间采用t检验,多组间采用单因素方差分析进行比较,相关性分析采用Spearman秩检验。结果GEPIA结果显示ST8SIA6-AS1在肝癌组织中的表达明显高于正常组织。RT-qPCR结果显示ST8SIA6-AS1在HCC中的表达明显高于癌旁组织(0.778±0.363比1.951±0.575,t=11.370,P<0.05),差异有统计学意义。miR-142-3p在肝癌组织的表达量显著低于癌旁组织(0.881±0.374比0.371±0.164,t=9.395,P<0.05),差异有统计学意义。ST8SIA6-AS1在4种人HCC细胞株(HepG2、SMMC-7721、HCCLM3和Hep3B)的表达(3.84±0.27、5.81±0.60、4.47±0.55、5.94±0.69)明显高于正常肝细胞株L02(1.00±0.09,t=17.280,t=13.730,t=10.780,t=12.300,P<0.05),差异有统计学意义,ST8SIA6-AS1在敲低ST8SIA6-AS1的Hep3B细胞中的相对表达量低于对照组(0.26±0.04比1.00±0.01,t=9.423,P<0.05),差异有统计学意义。集落形成实验结果显示,敲低ST8SIA6-AS1的Hep3B细胞集落个数显著低于对照组[(32.60±6.70)个比(100.00±10.00)个,t=10.040,P<0.05],差异有统计学意义;CCK-8实验中敲低ST8SIA6-AS1的Hep3B细胞72 h吸光度(A)值低于对照组[(0.71±0.06)%比(1.14±0.09)%,t=6.886,P<0.05],差异有统计学意义。Transwell实验结果显示敲低ST8SIA6-AS1的Hep3B细胞垂直迁移率明显低于对照组[(53.38±6.49)%比(100.00±13.00)%,t=5.641,P<0.05],差异有统计学意义。敲低ST8SIA6-AS1的Hep3B细胞的侵袭率低于对照组[(44.98±8.42)%比(100.00±10.00)%,t=7.485,P<0.05],差异有统计学意义。双荧光素酶报告实验证实miR-142-3p过表达组明显低于对照组ST8SIA6-AS1-野生型(WT)细胞的荧光活性,ST8SIA6-AS1负向调控miR-142-3p的表达(0.42±0.05比1.00±0.09,t=9.757,P<0.05)。干扰ST8SIA6-AS1的表达可对肝癌细胞增殖、迁移、侵袭产生抑制作用,这种作用可通过沉默miR-142-3p发生逆转。结论ST8SIA6-AS1可通过竞争性结合miR-142-3p在肝癌中发挥致癌作用。     

微小RNA-15b-5p靶向犰狳重复X连锁蛋白2抑制膀胱尿路上皮癌细胞增殖的实验研究

目的检测膀胱尿路上皮癌中微小RNA-15b-5p(miR-15b-5p)的表达,探讨其靶向犰狳重复X连锁蛋白2(ARMCX2)对细胞增殖的调控作用。方法选择69例2014年6月至2015年5月在海南医学院第二附属医院确诊并行手术治疗膀胱尿路上皮癌的患者,留取肿瘤组织。实时荧光定量PCR(qPCR)检测miR-15b-5p、免疫组织化学法检测ARMCX2和细胞核增殖抗原(Ki-67)的表达。选择尿路上皮癌T24细胞系,应用双荧光素酶报告基因实验验证miR-15b-5p和ARMCX2的靶向关系。建立无关序列组(NC组)、miR-15b-5p mimic组、miR-15b-5p inhibitor组、miR-15b-5p inhibitor和小干扰RNA(siRNA)-ARMCX2共转染组,应用蛋白质印迹法(Western blot)检测ARMCX2和Ki-67的表达,应用细胞计数试剂盒(CCK-8)检测细胞活性。两组间比较行独立样本的t检验,多组间比较行方差分析(SNK法行两两比较)。结果膀胱尿路上皮癌中miR-15b-5p的表达量范围为1.2~4.5,miR-15b-5p的表达量和ARMCX2的阳性率在不同病变级别(1.51±0.26比2.04±0.43,t=4.560,P<0.05;78.95%比19.35%,χ^2=24.290,P<0.05)、是否为浸润性生长(1.60±0.40比1.86±0.44,t=2.360,P<0.05;73.33%比35.90%,χ^2=9.520,P<0.05)的分组中差异有统计学意义。相关分析显示miR-15b-5p和ARMCX2(r=-0.620,P<0.05)、miR-15b-5p和Ki-67(r=-0.600,P<0.05)呈负相关,ARMCX2和Ki-67(r=0.660,P<0.05)呈正相关。生存分析显示miR-15b-5p和ARMCX2与生存时间有关(χ^2=5.010,P<0.05)。双荧光素酶报告基因实验显示miR-15b-5p和ARMCX2具有靶向关系。MiR-15b-5p mimic组中ARMCX2(1.15±0.40比1.82±0.28,t=3.430,P<0.05)和Ki-67(1.34±0.37比0.99±0.21,t=2.780,P<0.05)的表达高于NC组,细胞活性低于NC组,miR-15b-5p inhibitor组中ARMCX2(2.24±0.35比1.82±0.28,t=2.630,P<0.05)和Ki-67(1.65±0.26比0.99±0.21,t=5.760,P<0.05)的表达高于NC组,细胞活性高于NC组,miR-15b-5p inhibitor和siRNA-ARMCX2共转染组ARMCX2(1.66±0.25比1.82±0.28,t=1.130,P>0.05)、Ki-67(1.24±0.29比0.99±0.21,t=1.710,P>0.05)的表达差异无统计学意义。结论MiR-15b-5p在膀胱尿路上皮癌中低表达,与肿瘤细胞的增殖及生长相关。MiR-15b-5p靶向ARMCX2抑制尿路上皮癌细胞的增殖。