miR-92a-3p靶向EZH2对IL-1β诱导软骨细胞合成基质降解酶的影响

目的研究miR-92a-3p靶向zeste基因增强子同源物2(EZH2)对白细胞介素-1β(IL-1β)诱导的软骨细胞合成基质降解酶的影响。方法分离培养人软骨细胞,分成Normal、IL-1β(IL-1β处理)、miR-NC+IL-1β(mimics control转染后IL-1β处理)、miR-92a-3p+IL-1β(miR-92a-3p mimics转染后IL-1β处理)组,RT-PCR方法测定miR-92a-3p表达变化,Western blot检测MMP-13、MMP-1、COLⅡ蛋白表达。靶基因预测软件发现EZH2可能为miR-92a-3p的靶基因,荧光素酶报告系统鉴定靶向关系。将p CDNA3.1-EZH2和miR-92a-3p mimics共同转染到软骨细胞中,检测MMP-13、MMP-1、COLⅡ蛋白表达情况。结果与Normal比较,IL-1β组细胞中miR-92a-3p表达减少,MMP-13、MMP-1表达增多,COLⅡ表达减少(P0.05)。与miR-NC+IL-1β比较,miR-92a-3p+IL-1β组细胞中miR-92a-3p表达增多,MMP-13、MMP-1表达减少,COLⅡ表达增多(P0.05)。miR-92a-3p靶向负调控EZH2表达。p CDNA3.1-EZH2可以逆转miR-92a-3p mimics对IL-1β条件下软骨细胞中MMP-13、MMP-1、COLⅡ蛋白表达影响。结论 miR-92a-3p靶向下调EZH2抑制IL-1β诱导的软骨细胞合成基质降解酶。     

LncRNA FGD5-AS1靶向miR-103a-3p对IL-1β诱导的关节软骨细胞凋亡的机制研究

目的探讨LncRNA FGD5-AS1靶向miR-103a-3p对IL-1β诱导的关节软骨细胞损伤及细胞凋亡的影响与分子机制。方法体外培养大鼠关节软骨细胞,分为NC组、IL-1β组(IL-1β浓度为10 ng/m L)。采用qRT-PCR检测细胞中FGD5-AS1、miR-103a-3p的表达水平。分别将pc DNA-FGD5-AS1、miR-103a-3p mimics转染至软骨细胞,随后使用IL-1β处理48 h。采用ELISA检测IL-6、TNF-α、IL-8水平;流式细胞术检测细胞凋亡率;双荧光素酶报告实验验证FGD5-AS1与miR-103a-3p的靶向关系; Western blot检测Bax、Cyt C、Cleaved Caspase-3、p-NF-κB p65、p-IκBα蛋白表达量。结果与NC组相比,IL-1β组软骨细胞中FGD5-AS1的表达水平显著降低(P0.05),miR-103a-3p、Bax、Cyt C、Cleaved Caspase-3的表达水平显著升高(P0.05),IL-6、TNF-α、IL-8水平显著升高(P0.05),细胞凋亡率显著升高(P0.05); FGD5-AS1过表达后可明显降低IL-6、TNF-α、IL-8、p-NF-κB p65、p-IκBα水平(P0.05),降低细胞凋亡率(P0.05),抑制Bax、Cyt C、Cleaved Caspase-3表达(P0.05);双荧光素酶报告实验证实FGD5-AS1靶向结合miR-103a-3p并可负向调控miR-103a-3p的表达(P0.05); miR-103a-3p过表达可明显逆转FGD5-AS1过表达对细胞凋亡及炎症反应的抑制作用(P0.05)。结论 LncRNA FGD5-AS1可通过靶向负调控miR-103a-3p的表达从而抑制IL-1β诱导的关节软骨细胞炎症反应及细胞凋亡,其作用机制可能通过抑制NF-κB信号通路激活有关。     

hsa_circ_0005105靶向miR-508-3p对关节炎软骨细胞的影响

目的 探讨hsa_circ_0005105对关节炎软骨细胞增殖、凋亡及炎症因子分泌的影响及机制。方法 实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测软骨细胞中hsa_circ_0005105和miR-508-3p的表达水平;将软骨细胞分为NC组、IL-1β组、IL-1β+si-NC组、IL-1β+si-hsa_circ_0005105组、IL-1β+miR-NC组、IL-1β+miR-508-3p组、IL-1β+si-hsa_circ_0005105+anti-miR-NC组、IL-1β+si-hsa_circ_0005105+anti-miR-508-3p组;蛋白质印迹法检测凋亡蛋白表达;流式细胞术检测凋亡;CCK-8与平板克隆形成能力检测细胞增殖能力;酶联免疫吸附法检测TNF-α、IL-6水平;双荧光素酶报告实验检测hsa_circ_0005105和miR-508-3p的靶向关系。结果 IL-1β诱导的软骨细胞中hsa_circ_0005105表达水平升高,miR-508-3p表达水平降低（P<0.05）。低表达hsa_circ_0005105或过表达miR-508-3p可降低IL-1β诱导的软骨细胞Bax、Cleaved-caspase-9、Cleaved-caspase-3相对表达水平、细胞凋亡率,升高Bcl-2蛋白水平、细胞活性,细胞克隆形成数增多,TNF-α和IL-6水平降低（P<0.05）。hsa_circ_0005105靶向调控miR-508-3p;低表达miR-508-3p可以逆转hsa_circ_0005105低表达对IL-1β诱导的软骨细胞损伤及炎症因子分泌的影响。结论 低表达hsa_circ_0005105通过靶向上调miR-508-3p抑制IL-1β诱导的软骨细胞凋亡及炎症因子分泌,促进细胞增殖。     

lncRNA XIST靶向miR-302a-3p对IL-1β诱导软骨细胞损伤的调控机制

目的 探讨lncRNA X染色体失活特异转录因子（XIST）靶向miR-302a-3p对白细胞介素-1β（IL-1β）诱导软骨细胞损伤的调控机制。方法 SW1353细胞分为Control组、IL-1β组、IL-1β+si-NC组、IL-1β+si-XIST组、IL-1β+si-PDK1组、IL-1β+si-XIST+miR-NC inhibitor组、IL-1β+si-XIST+miR-302a-3p inhibitor组。检测XIST、miR-302a-3p以及3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1（PDK1）mRNA表达;噻唑蓝（MTT）实验测定细胞活力;流式细胞术检测细胞凋亡;qRT-PCR检测炎症因子（TNF-α、IL-1β、IL-4、IL-6、IL-10）水平;双荧光素酶报告基因检测实验证实miR-302a-3p与XIST或PDK1的靶向关系;免疫印迹法检测凋亡蛋白（Bcl-2、Bax）及PDK1蛋白表达。结果 与IL-1β组相比,IL-1β+si-XIST组XIST表达下调,细胞活力升高,凋亡率降低,Bax表达及TNF-α、IL-1β、IL-6水平下降,Bcl-2表达及IL-4、IL-10水平升高（P<0.05）。XIST直接靶向下调miR-302a-3p表达,miR-302a-3p下调可恢复si-XIST介导的促增殖、抗凋亡和炎症反应作用（P<0.05）。PDK1是miR-302a-3p的靶基因,沉默PDK1可抑制细胞的炎症反应（P<0.05）。结论 敲低XIST可提高IL-1β诱导软骨细胞的细胞活力,减轻OA样软骨细胞损伤,其作用机制与靶向上调miR-302a-3p进而抑制PDK1表达有关。     

微小RNA-27b-3p靶向干扰素调节因子4调控结肠癌细胞B细胞淋巴瘤-6表达的研究

目的观察微小RNA(microRNA,miR)-27b-3p与干扰素调节因子4(IRF4)的靶向关系,分析其对结肠癌细胞B细胞淋巴瘤分子-6(bcl-6)表达的影响。方法2015年12月至2017年1月在南昌大学第二附属医院确诊为结肠癌患者共53例,以肿瘤组织作为研究组,以正常结肠黏膜组织作为对照组。应用实时荧光定量聚合酶链反应(qPCR)检测miR-27b-3p的表达。应用免疫组织化学法检测结肠癌中干扰素调节因子4(IRF4)和B细胞淋巴瘤-6(bcl-6)的表达。选择人结肠癌细胞系116,构建阴性对照组、miR-27b-3p转染组、miR-27b-3p和IRF4共转染组,应用免疫印迹实验检测各组中IRF4和bcl-6的表达。应用双荧光素酶报告基因实验观察miR-27b-3p与IRF4的结合情况。组间比较采用t检验、配对t检验及方差分析。结果结肠癌中miR-27b-3p的表达(2.67±0.40)明显低于对照组(3.68±0.45,t=6.180,P<0.01),miR-27b-3p的表达在不同肿瘤最大径(≥5 cm为2.49±0.39,<5 cm为2.87±0.36)、浸润深度(浆膜及以外为2.44±0.34,未及浆膜为2.88±0.36)、脉管癌栓(有癌栓为2.28±0.42,无癌栓为2.77±0.31)、片状坏死(有坏死为2.36±0.42,无坏死为2.79±0.39)和淋巴结转移(有转移为2.37±0.41,无转移为2.81±0.22)分组的表达中差异有统计学意义(t=4.250、5.180、5.690、5.110、5.190,P值均<0.05)。miR-27b-3p与生存时间有关(χ^2=5.080,P<0.05),差异有统计学意义。miR-27b-3p与IRF4(r=-0.600,P<0.05)、miR-27b-3p与bcl-6(r=-0.690,P<0.05)均呈负相关性。双荧光素酶报告基因实验显示miR-27b-3p与IRF4具有靶向关系。miR-27b-3p转染组中IRF4和bcl-6的表达低于阴性对照组(t=3.240、4.330,P<0.05),差异有统计学意义,共转染组能逆转上述改变。结论miR-27b-3p靶向负调控IRF4调节结肠癌细胞bcl-6的表达,miR-27b-3p低表达是肿瘤形成和进展的重要事件,检测miR-27b-3p的表达可能与生存时间有关。     

成软骨相关miR-4287调控人软骨细胞聚蛋白多糖酶-1表达的研究

目的探讨成软骨相关miR-4287对人软骨细胞聚蛋白多糖酶-1(a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motif 4,ADAMTS4)调控作用及其机制。方法取自愿捐赠的膝关节正常及骨关节炎软骨组织,采用实时荧光定量PCR检测miR-4287和ADAMTS4 mRNA表达量;然后分离培养软骨细胞,取第1代骨关节炎细胞,给予IL-1β处理,观察其对软骨细胞miR-4287和ADAMTS4 mRNA表达的影响;分别给予MAPK信号通路抑制剂SP600125以及NF-κB信号通路抑制剂SN50预处理后联合IL-1β刺激,观察IL-1β介导的信号通路对软骨细胞miR-4287和ADAMTS4 mRNA表达的影响;分别转染miR-4287模拟物及其阴性对照、miR-4287抑制物及其阴性对照,观察miR-4287调控软骨细胞ADAMTS4 mRNA及蛋白的表达。荧光素酶报告实验验证miR-4287与ADAMTS4 mRNA 3’非翻译区(untranslated region,UTR)的直接结合效应。结果与正常软骨组织比较,骨关节炎软骨组织miR-4287相对表达量下降,ADAMTS4 mRNA相对表达量上升,比较差异有统计学意义(P0.05)。IL-1β下调软骨细胞miR-4287表达、上调ADAMTS4 mRNA表达,与未经IL-1β处理的软骨细胞相比差异均有统计学意义(P0.05)。经IL-1β介导的信号通路抑制剂预处理后,软骨细胞miR-4287相对表达量上升,ADAMTS4 mRNA相对表达量降低,与未经信号通路抑制剂预处理细胞相比,差异均有统计学意义(P0.05)。转染miR-4287模拟物后,软骨细胞内ADAMTS4 mRNA及蛋白表达均降低(P0.05);而转染miR-4287抑制物后,软骨细胞内ADAMTS4 mRNA及蛋白表达均升高(P0.05)。无论结合位点为野生型或突变型,过表达miR-4287均不能改变报告载体的荧光素酶活性(P0.05)。结论成软骨相关miR-4287可能是一种与软骨退变相关的miRNA。miR-4287能调控人软骨细胞ADAMTS4表达,但不是通过靶向结合mRNA 3’UTR的方式发挥作用,其具体机制有待进一步研究。     

微小RNA-29b-3p对大鼠膝骨关节炎模型的保护作用及其机制

目的探讨微小RNA(miR)-29b-3p对大鼠膝骨关节炎模型的保护作用及其机制。方法 30只SD大鼠随机分为对照组、模型组和miR-29b-3p KD组, miR-29b-3p KD组大鼠经膝关节腔注射过表达miR-29b-3p沉默腺相关病毒, 对照组和模型组经膝关节腔给予对照腺相关病毒。3组大鼠表达30 d后, 模型组和miR-29b-3p KD组大鼠采用木瓜蛋白酶局部注射复制膝骨关节炎动物模型。建模4周后, 采用荧光定量聚合酶链反应(PCR)分析膝关节miR-29b-3p表达水平;Mankin组织学评分和Pelletier评分分析关节炎病变程度;分析3组大鼠膝关节最大活动度;采用酶联免疫吸附实验分析白细胞介素(IL)-1β、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和转化生长因子-β1(TGF-β1)水平;采用免疫组织化学分析基质金属蛋白酶(MMP)-13和Ⅱ型胶原的表达水平。组间比较采用单因素方差分析。结果 miR-29b-3p KD组大鼠膝关节组织miR-29b-3p表达水平(0.76±0.11)明显低于模型组(2.09±0.15), 差异有统计学意义(t=22.240, P<0....     

MiR-27b-3p靶向ID-3调控骨肉瘤细胞增殖的研究

目的观察微小RNA-27b-3p(microRNA-27b-3p, miR-27b-3p)与DNA结合/分化抑制蛋白-3(DNA binding/differentiation inhibitory protein-3,ID-3)的靶向关系,分析其对增殖的调控作用。方法应用前瞻性研究方法,选择人骨肉瘤细胞株U2OS,采用双荧光素酶报告基因实验验证miR-27b-3p与ID-3的靶向关系。建立空白对照组(NC组)、空载体转染组、miR-27b-3p mimic组、miR-27b-3p mimic和siRNA ID-3共转染组,每组纳入12个培养皿。采用细胞计数试剂盒-8(cell counting kit-8,CCK-8)法检测细胞的活性,采用集落形成实验观察细胞的克隆形成情况。应用Western Blot法检测ID-3和增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)的表达。选择骨肉瘤术后组织共40例,其中男22例,女18例;年龄4～88岁,平均年龄(16.3±4.3)岁。应用实时荧光定量聚合酶链式反应(real time quantitative polymerase chain reaction, RT-qPCR)检测miR-27b-3p的表达,应用免疫组化法检测ID-3和PCNA的表达。结果双荧光素酶报告基因实验发现miR-27b-3p能引起转染pGL_3-ID-3-WT的细胞中荧光素酶活性降低。与空白对照组和空载体转染组比较,miR-27b-3p mimic组细胞活性明显下降,克隆集落数量明显减少,PCNA的表达下降,miR-27b-3p mimic和siRNA ID-3共转染组能逆转上述表达水平。骨肉瘤组织中miR-27b-3p与ID-3、miR-27b-3p与PCNA均具有负相关性,ID-3与PCNA具有正相关性。miR-27b-3p的表达与生存时间相关。结论 miR-27b-3p靶向ID-3负调控骨肉瘤细胞的增殖,MiR-27b-3p低表达可能与不良预后有关。     

IL-1β对ATDC5成软骨分化细胞miR-455-3p的影响

目的：检测IL-1β对ATDC5成软骨分化细胞miR-455-3p表达的影响,探索miR-455-3p在骨关节炎中的作用。方法诱导ATDC5细胞成软骨分化后,予10 ng/ml的IL-1β刺激,在刺激4、12、24、48 h时应用实时荧光定量PCR检测miR-455-3p、C/EBPβ和软骨特征性标记物的表达情况;并利用抑制剂IKK-NBD阻断NF-κB通路后,应用实时荧光定量PCR检测IL-1β作用下miR-455-3p的表达水平。结果在IL-1β作用下的ATDC5成软骨分化细胞中miR-455-3p、C/EBPβ和软骨退变标记物（ MMP13、ADAMTS5）均上调,而软骨基质合成标记物（ ACAN、COL2A1、SOX9）则下调,且后期更为明显;而IKK-NBD可抑制IL-1β诱导的miR-455-3p表达。结论 IL-1β可上调ATDC5成软骨分化细胞miR-455-3p的表达水平,且受NF-κB通路的调节。     

狼疮肾炎患者循环miRNA表达谱研究及循环miR-130b-3p的临床意义

目的分析处于不同进展阶段的狼疮肾炎(LN)患者循环miRNA的表达变化并探讨其可能存在的临床意义。 方法本研究共94份血清标本,包括58例LN患者和36名健康体检者(作为对照组)。挑选出其中性别、年龄匹配的12份血清标本用于循环miRNA表达谱筛选,包括早期LN组4份(CKD 1～3期),晚期LN组4份(CKD分期4～5期)及对照组4份作为芯片组,使用miRNA PCR芯片检测血清miRNA变化;剩余50例LN患者(40例早期LN患者、10例晚期LN患者)及32名对照者血清样本作为验证组,用于验证miRNA表达谱筛选结果;以Nanodrop 2000检测血清总RNA抽提浓度;选择miR-130b-3p和miR-1233-3p作为验证对象;进行Spearman相关性分析。 结果芯片组结果显示,与对照组相比,早期LN组中7个表达上升的miRNA差异具有统计学意义,分别是：miR-1233-3p (P＝0.019)、miR-130b-3p (P＝0.021)、miR-18a-3p (P＝0.021)、miR-628-3p (P＝0.023)、miR-1260b (P＝0.030)、miR-1539 (P＝0.041)和miR-378e (P＝0.047);晚期LN组分别与对照组及早期LN组比较,未发现表达上调大于2倍或者上调差异具有统计学意义的miRNA。验证组结果显示：晚期LN组患者分别与对照组、早期LN组比较,血清总RNA浓度下降(U＝4.5,P<0.001;U＝18.0,P<0.001);早期LN组与对照组比较,血清中miR-130b-3p表达升高[IQR 16.2(8.7,42.7)与9.6(4.8,17.4), U＝405.5,P＝0.008];晚期LN组分别与对照组及早期LN组比较,MiR-130b-3p和miR-1233-3p表达均下降(U＝69.0、P＝0.008,U＝46.0、P<0.001;U＝80.0、P＝0.019,U＝70.0、P＝0.002);相关性分析显示循环miR-130b-3p的相对表达量与24 h尿蛋白(r＝0.404,P＝0.010)、肾脏慢性活动指数(r＝0.389,P＝0.013)、甘油三酯(r＝0.376,P＝0.017)呈正相关。 结论严重肾功能衰竭患者可能存在循环miRNA广泛表达下调,循环miRNA-130b-3p在早期LN患者中表达升高并与肾脏损伤和血脂调节异常相关,在LN发生发展中可能起作用。     

微小RNA-214-3p介导神经营养酪氨酸激酶受体2型通路调节血管内皮生长因子旁分泌在骨关节炎发展中的作用

目的探讨微小RNA(miR)-214-3p在骨关节炎(OA)软骨细胞中的表达及其调节内皮细胞迁移和血管生成的机制。方法选取2020年6月至2020年12月在郑州大学第一附属医院接受全膝关节置换的16例OA患者及12例无膝关节疾病但因创伤导致下肢截肢的患者分别作为OA组和健康组,获取软骨标本,提取软骨细胞。采用蛋白印迹分析和实时定量反转录聚合酶链反应(RT-qPCR)检测miR-214-3p在软骨细胞中的表达水平。通过创面愈合实验、小管形成实验、酶联免疫吸附法(ELISA)检测细胞的迁移率、血管生成率、血管内皮生长因子(VEGF)分泌情况。采用生物信息学分析、双荧光素酶分析等方法分析miR-214-3p与神经营养酪氨酸激酶受体2型(TrkB)的关系。采用方差分析(ANOVA)和t检验。结果TrkB在OA组中的表达水平明显高于健康组(2.13±0.41比0.92±0.21,t=9.318,P<0.01)。miR-214-3p在OA组中的表达明显低于健康组(0.26±0.12比1.12±0.31,t=-10.177,P<0.01),差异均有统计学意义。OA组miR-214-3p表达水平与TrkB表达水平呈负相关(r=-0.730,P<0.05),健康组中miR-214-3p表达水平与TrkB表达水平呈负相关(r=-0.705,P<0.05)。TargetScan数据库预测了miR-214-3p和TrkB的靶向结合位点,双荧光素酶实验验证了TrkB与miR-214-3p的靶向结合。TrkB过表达组VEGF水平高于空载体组[(221.3±5.2)ng/L比(137.2±4.8)ng/L,t=43.742,P<0.01]、内皮细胞迁移率高于空载体组(1.71±0.22比0.98±0.11,t=10.516,P<0.05)、血管生成率高于空载体组(1.41±0.12比0.99±0.10,t=9.822,P<0.05),差异均有统计学意义。下调OA组的miR-214-3p表达后,VEGF表达水平升高0.95倍(t=5.245,P<0.01),内皮细胞迁移率增加1.12倍(t=3.283,P<0.01),血管生成率增加0.52倍(t=1.174,P<0.01),差异均有统计学意义。结论软骨细胞中TrkB信号通路旁分泌VEGF的激活是由miR-214-3p介导的,在OA发展过程中调控内皮细胞迁移和血管生成。     

Hyaluronan inhibits matrix metalloproteinase‐13 in human arthritic chondrocytes via CD44 and P38

We investigated the effects of hyaluronan (HA) on interleukin‐1β (IL‐1β)‐stimulated matrix metalloproteinase (MMP)‐13 production in human chondrocytes from patients with osteoarthritis (OA) or rheumatoid arthritis (RA). Secreted levels of MMP‐13 in conditioned media were detected by immunoblotting, while intracellular MMP‐13 synthesis in articular cartilage was evaluated by immunofluorescence microscopic analysis. Mitogen‐activated protein kinases (MAPKs), p38, extracellular signal‐regulated kinases (ERK), and c‐jun NH2‐terminal kinase (JNK) were assessed by Western blotting. IL‐1β (2 ng/ml) stimulates the secretion of MMP‐13 in both OA and RA chondrocytes. Inhibition studies using specific MAPK inhibitors revealed that IL‐1β induced MMP‐13 via p38 in both OA and RA chondrocytes. HA down‐regulates IL‐1β‐stimulated MMP‐13 and phosphorylated p38 (p‐p38) in a dose‐dependent manner (0.1, 1, 2, and 4 mg/ml). When used at 4 mg/ml, HA inhibits p‐p38 phosphorylation by more than 60%. In response to IL‐1β, RA chondrocytes express a higher level of p‐p38 than that of OA chondrocytes. Inhibition of CD44, using a blocking antibody, significantly reversed the inhibitory effect of HA on both MMP‐13 and p‐p38. Our study clearly shows that HA inhibits IL‐1β‐induced MMP‐13 via its principal receptor, CD44, and subsequent intracellular p38 MAPK signaling in OA and RA chondrocytes. © 2010 Orthopaedic Research Society. Published by Wiley Periodicals, Inc. J Orthop Res 29:258–264, 2011     

miR-31-5p靶向Notch1调节骨关节炎软骨细胞增殖和凋亡的作用

目的明确miR-31-5p在骨关节炎软骨细胞中的作用。方法采用Hulth法进行大鼠骨关节炎造模,并分离原代软骨细胞,白细胞介素(interleukin,IL)-1β诱导体外模型,检测miR-31-5p的表达变化;进一步通过在线数据库预测miR-31-5p靶点并验证,细胞增殖检测试剂盒(cell counting kit-8,CCK-8)和流式细胞术检测miR-31-5p对原代软骨细胞增殖和凋亡的影响。结果骨关节炎大鼠中miR-31-5p表达下调;miR-31-5p mimics促进软骨细胞增殖,而miR-31-5p inhibitor诱导软骨细胞凋亡增加;此外,miR-31-5p inhibitor促进IL-6和基质金属蛋白酶13(matrix metalloprotein,MMP-13)表达增加;荧光素酶报告基因实验证实Notch1是miR-31-5p的直接靶点,Notch1过表达质粒会部分抵消miR-31-5p mimics对软骨细胞的增殖保护作用。结论miR-31-5p下调表达介导骨关节炎软骨细胞增殖受限和凋亡发生,可能参与骨关节炎的发病。     

LINC01534/miR-135b-5p/PTPRT axis regulates inflammatory response in loosening total hip replacement via modulating NF-κB signaling pathway

Aseptic loosening after total hip replacement brings adverse health outcomes and increased risk for complications. The resorptive activity of inflammatory cells activated by the presence of wear-generated debris plays a critical role in debris-induced osteolysis. Previous studies indicate that the abnormally expressed LINC01534 plays a critical role in inflammatory responses. In this study, we aimed to elucidate the functional role and underlying mechanism of LINC01534 in debris-induced osteolysis. We first confirmed that LINC01534 was highly expressed in hip cartilage tissues from aseptic loosening patients. By using an IL-1β-induced inflammation model mimicking debris-induced osteolysis, we demonstrated that LINC01534 promoted IL-1β-induced inflammatory response in hip chondrocytes. Knockdown of LINC01534 inhibited the expression of inflammatory IL-6, IL-8, and TNF-α in hip chondrocytes. Our results showed that LINC01534 functioned as a competing endogenous RNA (ceRNA) by sponging miR-135b-5p in hip chondrocytes. Moreover, bioinformatics analysis and luciferase reporter assay demonstrated that CCHC-Type Zinc Finger Nucleic Acid Binding Protein (PTPRT) is a downstream target of miR-135b-5p. Knockdown of PTPRT attenuated the IL-1β-induced inflammatory responses in hip chondrocytes. In addition, we revealed that inhibition of miR-135b-5p or overexpression of PTPRT could antagonize the effects of LINC01534 knockdown on inflammation attenuation in hip chondrocytes. Mechanistically, we demonstrated that LINC01534/miR-135b-5p/PTPRT axis regulated the NF-κB signaling pathway in hip chondrocytes. Taken together, our findings suggest that LINC01534/miR-135b-5p/PTPRT axis might be a valuable therapeutic target for the treatment of debris-induced osteolysis.     

Circular RNA circ_0114876 regulates osteoarthritis through upregulating ADAM10 via targeting miR-1227-3p

BackgroundOsteoarthritis (OA) was a chronic degenerative joint disease. The dysregulation of circular RNAs (circRNAs) has been identified in OA progression. However, the function and regulation mechanism of circ_0114876 in OA remains largely unknown.MethodFirstly, we used LPS-treated C28/I2 cells as a cellular model of OA. Quantificational real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR) was used to determine the expression levels of circ_0114876, miRNA-1227-3p, and ADAM10 in OA chondrocytes. Cell Counting Kit-8 (CCK8), 5-ethynyl-20-deoxyuridine (EdU) incorporation assays, flow cytometry, Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) kit, and western blot were applied to confirm cell proliferation, apoptosis, inflammation, and extracellular matrix.of circ_0114876 in vitro. The interaction between circ_0114876 and its downstream target (miR-1227-3p) and mRNA target ADAM metallopeptidase domain 10 (ADAM10), was evaluated by luciferase assay and RNA immunoprecipitation (RIP) assay.ResultCirc_0114876 and ADAM10 were upregulated and miR-1227-3p was decreased in OA tissues and LPS-treated chondrocytes. Low expression of circ_0114876 promoted proliferation and inhibited apoptosis, inflammation, and extracellular matrix of the LPS-treated chondrocytes. Mechanistically, circ_0114876 functioned in human chondrocytes through targeting miR-1227-3p and ADAM10. Furthermore, miRNA-1227-3p inhibitor reversed the effect of circ_0114876 knockdown on the OA chondrocytes, and ADAM10 overexpression reversed the effect of miR-1227-3p mimic on the OA chondrocytes.ConclusionCirc_0114876 was increased in OA tissues and cells. Circ_0114876 facilitated the progression in the LPS-induced OA cell model via regulating the miR-1227-3p/ADAM10 axis. This study would provide a potentially effective therapeutic strategy for OA progression.     

微小RNA-15b-5p靶向犰狳重复X连锁蛋白2抑制膀胱尿路上皮癌细胞增殖的实验研究

目的检测膀胱尿路上皮癌中微小RNA-15b-5p(miR-15b-5p)的表达,探讨其靶向犰狳重复X连锁蛋白2(ARMCX2)对细胞增殖的调控作用。方法选择69例2014年6月至2015年5月在海南医学院第二附属医院确诊并行手术治疗膀胱尿路上皮癌的患者,留取肿瘤组织。实时荧光定量PCR(qPCR)检测miR-15b-5p、免疫组织化学法检测ARMCX2和细胞核增殖抗原(Ki-67)的表达。选择尿路上皮癌T24细胞系,应用双荧光素酶报告基因实验验证miR-15b-5p和ARMCX2的靶向关系。建立无关序列组(NC组)、miR-15b-5p mimic组、miR-15b-5p inhibitor组、miR-15b-5p inhibitor和小干扰RNA(siRNA)-ARMCX2共转染组,应用蛋白质印迹法(Western blot)检测ARMCX2和Ki-67的表达,应用细胞计数试剂盒(CCK-8)检测细胞活性。两组间比较行独立样本的t检验,多组间比较行方差分析(SNK法行两两比较)。结果膀胱尿路上皮癌中miR-15b-5p的表达量范围为1.2~4.5,miR-15b-5p的表达量和ARMCX2的阳性率在不同病变级别(1.51±0.26比2.04±0.43,t=4.560,P<0.05;78.95%比19.35%,χ^2=24.290,P<0.05)、是否为浸润性生长(1.60±0.40比1.86±0.44,t=2.360,P<0.05;73.33%比35.90%,χ^2=9.520,P<0.05)的分组中差异有统计学意义。相关分析显示miR-15b-5p和ARMCX2(r=-0.620,P<0.05)、miR-15b-5p和Ki-67(r=-0.600,P<0.05)呈负相关,ARMCX2和Ki-67(r=0.660,P<0.05)呈正相关。生存分析显示miR-15b-5p和ARMCX2与生存时间有关(χ^2=5.010,P<0.05)。双荧光素酶报告基因实验显示miR-15b-5p和ARMCX2具有靶向关系。MiR-15b-5p mimic组中ARMCX2(1.15±0.40比1.82±0.28,t=3.430,P<0.05)和Ki-67(1.34±0.37比0.99±0.21,t=2.780,P<0.05)的表达高于NC组,细胞活性低于NC组,miR-15b-5p inhibitor组中ARMCX2(2.24±0.35比1.82±0.28,t=2.630,P<0.05)和Ki-67(1.65±0.26比0.99±0.21,t=5.760,P<0.05)的表达高于NC组,细胞活性高于NC组,miR-15b-5p inhibitor和siRNA-ARMCX2共转染组ARMCX2(1.66±0.25比1.82±0.28,t=1.130,P>0.05)、Ki-67(1.24±0.29比0.99±0.21,t=1.710,P>0.05)的表达差异无统计学意义。结论MiR-15b-5p在膀胱尿路上皮癌中低表达,与肿瘤细胞的增殖及生长相关。MiR-15b-5p靶向ARMCX2抑制尿路上皮癌细胞的增殖。     

Osteoblasts from the sclerotic subchondral bone downregulate aggrecan but upregulate metalloproteinases expression by chondrocytes. This effect is mimicked by interleukin-6, -1beta and oncostatin M pre-treated non-sclerotic osteoblasts

OBJECTIVE: To determine the effects of osteoarthritic (OA) subchondral osteoblasts on the metabolism of human OA chondrocytes in alginate beads. METHODS: Human chondrocytes were isolated from OA cartilage and cultured in alginate beads for 4 days in the absence or in the presence of osteoblasts isolated from non-sclerotic (N) or sclerotic (SC) zones of human OA subchondral bone in monolayer (co-culture system). Before co-culture, osteoblasts were incubated for 72 h with or without 1.7ng/ml interleukin (IL)-1beta, 100 ng/ml IL-6 with its soluble receptor (50 ng/ml) or 10 ng/ml oncostatin M (OSM). Aggrecan (AGG) and matrix metalloproteases (MMP)-3 and -13 mRNA levels in chondrocytes were quantified by real-time polymerase chain reaction. AGG production was assayed by a specific enzyme amplified sensitivity immunoassay. RESULTS: SC, but not N, osteoblasts induced a significant inhibition of AGG production and AGG gene expression by human OA chondrocytes in alginate beads, and significantly increased MMP-3 and MMP-13 gene expression by chondrocytes. When they were pre-incubated with IL-1beta, IL-6 or OSM, N osteoblasts inhibited AGG synthesis and increased MMP-3 and -13 gene expression by chondrocytes in alginate beads in a same order of magnitude as SC osteoblasts. CONCLUSIONS: These results demonstrate that SC OA subchondral osteoblasts could contribute to cartilage degradation by stimulating chondrocytes to produce more MMP and also by inhibiting AGG synthesis.     

长链非编码核糖核酸LINC00261通过miR-148b-3p/PTEN途径对高糖环境中HK-2细胞的保护作用

目的探讨长链非编码RNA(lncRNA)LINC00261在糖尿病肾病中的表达,及其可能通过微小核糖核酸miR-148b-3p/PTEN途径对高糖环境中HK-2细胞的保护作用。 方法选择2016年3月至2018年5月本院的19例糖尿病肾病患者和23例健康对照者,采集血样,通过实时定量PCR(qRT-PCR)测定LINC00261和miR-148b-3p的表达。在细胞实验中,将HK-2肾小管上皮细胞分为7组：正常葡萄糖组(5.5 mmol/L培养,NG组)、高葡萄糖糖组(30.0 mmol/L培养,HG组)、其余5组也均为高葡萄糖培养：空质粒转染pcDNA(HG+pcDNA组)、转染LINC00261(HG+pcDNA-LINC00261组)、转染阴性对照anti-miR-NC(HG+anti-miR-NC组)、转染抑制剂anti-miR-148b-3p(HG+anti-miR-148b-3p组)、LncRNA和miRNA同时转染(HG+pcDNA-LINC0026+miR-148b-3p组)。应用Western印迹、细胞计数试剂盒8和流式细胞术分别检测PTEN蛋白表达、细胞增殖与凋亡。测超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒和丙二醛(MDA)试剂盒分别检测SOD活性和MDA含量。双荧光素酶报告实验用于LINC00261、miR-148b-3p、PTEN的相互关系鉴定。 结果与健康对照者比较,糖尿病肾病患者的LINC00261表达明显降低,而miR-148b-3p表达则明显增高(P<0.05)。过表达LINC00261或抑制miR-148b-3p后,高糖环境中HK-2细胞的miR-148b-3p表达、细胞凋亡及MDA含量均下降,而PTEN蛋白表达、细胞增殖及SOD活性均增高(P<0.05)。 结论LINC00261可能通过调控miR-148b-3p/PTEN途径,促进高糖环境中HK-2肾小管上皮细胞增殖、降低氧化应激、减少细胞凋亡。     

微小RNA-142-3p靶向CD133对肝癌细胞增殖、侵袭和干细胞特性的影响

目的观察微小RNA(miR)-142-3p靶向CD133对肝癌细胞增殖、侵袭和干细胞特性的影响。方法选取郑州大学第二附属医院2017年6月至2019年12月手术切除的肝癌组织和对应的癌旁组织作为研究对象。采用荧光定量聚合酶链反应(PCR)分析癌旁组织和肿瘤组织miR-142-3p表达水平。采用慢病毒在MHCC97H肝癌细胞建立miR-142-3p过表达和对照细胞系(miR-142-3p组和对照组),采用细胞计数试剂盒(CCK-8)和EdU染色分析两组细胞增殖;采用Transwell分析两组细胞侵袭;采用软琼脂克隆形成实验分析两组细胞干细胞特性;生物信息学和双荧光素酶报告基因分析miR-142-3p靶基因;采用蛋白质印迹法(Western blot)分析两组增殖、侵袭和干细胞标志物细胞核增殖抗原(Ki-67)、基质金属蛋白酶(MMP)-9、CD133和Nanog蛋白表达水平,组间比较采用t检验。结果miR-142-3p组细胞miR-142-3p表达水平(0.41±0.12)显著低于癌旁组织miR-142-3p表达水平(1.06±0.25),差异有统计学意义(t=3.081,P<0.05)。miR-142-3p组细胞吸光度(A)值(1.63±0.20)低于对照组细胞A值(2.13±0.22),差异有统计学意义(t=2.918,P<0.05)。miR-142-3p组细胞EdU染色阳性率[(30.48±5.12)%]低于对照组细胞EdU染色阳性率[(87.89±7.28)%],差异有统计学意义(t=3.409,P<0.05)。miR-142-3p组细胞Ki-67蛋白表达水平(0.50±0.13)低于对照组细胞Ki-67表达水平(1.15±0.14),差异有统计学意义(t=2.319,P<0.05)。miR-142-3p组细胞侵袭数量[(67.59±6.01)个]低于对照组细胞侵袭数量[(121.35±6.12)个],差异有统计学意义(t=3.409,P<0.05)。miR-142-3p组细胞MMP-9蛋白表达水平(0.48±0.18)低于对照组细胞MMP-9蛋白表达水平(1.57±0.15),差异有统计学意义(t=2.917,P<0.05)。miR-142-3p组细胞克隆形成率[(31.44±4.51)%]低于对照组细胞克隆形成率[(57.68±7.19)%],差异有统计学意义(t=5.103,P<0.05)。miR-142-3p组细胞Nanog蛋白表达水平(0.51±0.14)低于对照组细胞Nanog蛋白表达水平(1.36±0.17),差异有统计学意义(t=2.514,P<0.05)。生物信息学和双荧光素酶报告基因显示CD133是miR-142-3p的靶基因。miR-142-3p组细胞CD133蛋白表达水平(0.43±0.11)低于对照组细胞CD133蛋白表达水平(1.15±0.13),差异有统计学意义(t=2.514,P<0.05)。结论miR-142-3p通过靶向调控CD133表达水平调节着肝癌细胞增殖、迁移和干细胞特性。