冷冻异体神经移植应用转化生长因子β1质粒的研究

目的探讨对经反复冻融处理的冷藏异体神经移植,局部使用转化生长因子β1(transforming growth factor β1,TGF-β1)质粒的效果. 方法健康成年不同窝Wistar大鼠40只随机分为两组,每组20只,将坐骨神经在梨状肌孔下5 mm处切除2.0 cm,神经缺损用预制反复冻融于-196℃冷冻的异体神经2.0 cm移植修复.实验组在局部肌肉及神经两断端注射TGF-β1质粒,对照组注射等量生理盐水.分别于6周和12周对每组10只大鼠取材,切片、染色并进行轴索计数和统计学分析. 结果 6周时实验组轴索间基本无水肿,再生神经数量接近正常;对照组神经移植段轴索间有轻度水肿,再生神经较少.12周时实验组整个神经移植段基本被再生轴突充满,有髓纤维排列整齐,轴突和髓鞘发育良好,再生轴突数为98.6±4.8/μm2;对照组神经纤维排列整齐,轴突和髓鞘发育较实验组差,轴突数为75.8± 5.1/μm2,差异有统计学意义(P<0.01). 结论反复冻融冷藏保存的异体神经其抗原性降低,具有修复神经缺损的可能性.局部使用TGF-β1质粒可发挥免疫抑制作用,降低宿主的免疫排斥反应.     

胸腺内注射异基因抗原诱导鼠神经移植免疫耐受的实验研究

目的探讨小鼠胸腺内注射异基因抗原在同种异体异基因坐骨神经移植免疫耐受中的作用。方法自供体小鼠C57BL／6的脾细胞中提取MHC抗原注人受体鼠Balb／c小鼠胸腺内，于2周后移植供体鼠坐骨神经。48只Balb／c小鼠随机分为4组，A组（胸腺内注射组）、B组（自体神经移植组）、C组（冷冻异体神经移植组）、D组（异体神经移植加用免疫抑制剂组）。于3周后进行电生理学、组织学、免疫学检测。结果A组运动神经传导速度（38．23m／s）与D组（36．39m／s）相比无显著性差异（P〉0．05），组织学、电镜、免疫学（混合淋巴细胞培养及迟发性超敏反应）检测结果均证实B组分别优于A组、D组和C组。结论胸腺内注射异基因MHC抗原可诱导大鼠对异体坐骨神经移植的特异性免疫耐受。     

体内注射白细胞介素10和转化生长因子质粒延长小鼠移植皮肤存活时间

目的 探讨体内注射白细胞介素10(IL-10)和转化生长因子β1(TGF-β1)质粒对小鼠移植皮肤存活时间的影响.方法 构建含IL-10和TGF-β1基因的质粒,以Balb/c小鼠为受者、Balb/c小鼠与C57BL/6小鼠杂交的F1代小鼠为供者,行皮片移植.移植当天,经尾静脉分别给受者快速注射不含基因的空白质粒(空白组)、含IL-10基因质粒(IL-10组)、含TGF-β1基因质粒(TGF-β1组)以及含IL-10和TGF-β1双基因的质粒(联合组),以后每2天注射1次,20 μg/次,共注射6次,观察移植皮肤存活时间.另取Balb/c小鼠,在输注C57BL/6小鼠脾细胞后,按前述分组及方法接受质粒快速注射,注射5次后,分离其脾细胞,以流式细胞仪检测脾细胞中CD4+ CD25+ T淋巴细胞含量.结果 移植皮片存活时间,空白组为(13.50±1.04)d,IL-10组为(13.83±1.16)d,TGF-β1组为(15.33±1.50)d,联合组为(21.33±3.20)d,联合组移植皮片存活时间明显长于其他3组(P<0.01).脾细胞中CD4+ CD25+ T淋巴细胞的含量,空白组为(6.58±1.86)%,IL-10组为(10.52±1.13)%,TGF-β1组为(14.44±0.42)%,联合组为(14.25±1.24)%,TGF-β1组和联合组的CD4+ CD25+ T淋巴细胞含量明显高于空白组和IL-10组(P<0.01).结论 体内注射IL-10和TGF-β1质粒可延长小鼠移植皮肤存活时间,并能提高CD4+ CD25+ T淋巴细胞含量.     

转化生长因子β1质粒对新鲜异体神经移植排斥反应的影响

自体神经移植是目前修复周围神经缺损的最佳方式,但存在增加手术创伤、造成供体神经支配区域的功能障碍及供体有限等缺点.同种异体神经移植可克服这一困难,但存在免疫排斥反应,移植后的免疫排斥反应是影响神经移植效果的重要因素[1].如何有效地抑制或减弱移植排斥反应是提高移植成功率,延长存活时间的根本问题.转化生长因子-1(TGF-β1)是一种强效细胞生长增殖调节蛋白,在移植免疫的抗排斥反应中扮演重要角色,已成为近年细胞,组织,器官移植的研究热点.我们通过局部注射TGF-β1质粒,观察其对大鼠异体神经移植后排斥反应的影响.     

优化法去细胞神经同种异体及异种移植的比较

目的 分别以优化法去细胞(OA)大鼠坐骨神经及兔臂丛分支移植修复大鼠坐骨神经缺损,观察免疫排斥情况、早期功能恢复及神经再生情况,以比较此优化法处理的同种异体及异种神经移植物修复周围神经缺损的能力. 方法 以新鲜新西兰大白兔臂丛分支、自体坐骨神经、OA处理过的新鲜取材的SD大鼠坐骨神经及新西兰大白兔臂丛分支,移植修复成年SD大鼠坐骨神经1.0 cm缺损,即新鲜异种神经移植组、自体神经移植组、OA异种神经移植和OA异体神经移植组,分别于术后1个月及3个月行功能评价(SFI)、电生理(CV)和组织学检查,观察免疫排斥、功能恢复及神经再生情况. 结果 术后1个月,OA异体和OA异种神经移植组的SFI、CV、轴突密度分别为:61.38±5.59、(32.23±0.91)m/s、(22.26±1.74)m/s和(0.782±0.081)(个/100 μm2),3个月分别为59.00±5.40、(31.80±0.99)m/s、(23.35±2.40)m/s和(0.778±0.046)(个/100μm2);术后1个月,异体和异种神经移植CD8+T细胞和巨噬细胞染色阳性百分比分别为0.17385±0.01805、0.09299±0.01565和0.30223±0.09449、0.19537±0.02010.同种异体神经移植组与异种神经移植组在免疫排斥、功能恢复及神经再生方面差异无统计学意义(P＞0.05),且都明显优于未处理新鲜神经移植组(P＜0.05).3个月时的神经再生及功能恢复情况优于1个月组(P＜0.05). 结论 优化去细胞法处理的同种异体及异种神经移植物在修复周围神经缺损时,均可以达到免疫耐受,移植动物早期功能恢复和神经再生情况良好.     

RNA干扰质粒沉默转化生长因子β_1对大鼠移植肾细胞外基质生成的影响

目的 探讨转化生长因子β_1(TGF-β_1)的RNA干扰质粒(shRNA-TGF-β_1)对大鼠移植肾细胞外基质生成的影响.方法 预先构建shRNA-TGF-β_1.取SD大鼠肾脏,置于4℃肝素生理盐水中以强化缺血再灌注损伤,用于移植.切除Wistar大鼠左肾后移植入供肾,术中采用以流体力学为基础的肾脏基因转染技术进行质粒转染.实验分为4组.T组为质粒组,受者注射shRNA-TGF-β_1质粒;H组为空质粒组,受者注射空质粒;Y组为单纯移植组,受者仅行肾移植,不注射任何质粒;J组为假手术组,只打开腹腔切除左肾,不进行肾移植.移植术后1、2和3个月时,切取各组受者的移植肾,检测TGF-β_1、Ⅰ型胶原及其mRNA的表达,检测Ⅰ型胶原组织定位,观察移植肾细胞外基质的沉积.结果 J组大鼠肾脏组织中仅有少量的TGF-β_1 mRNA表达.H组及Y组TGF-β_1 mRNA的表达较高.术后1个月时,T组TGF-β_1 mRNA的表达显著低于其他各组,随着时间的延长,其表达有所升高,但仍显著低于H组及Y组.各组TGF-β_1的表达与TGF-β_1 mRNA的表达有相同的变化趋势.T组Ⅰ型胶原mRNA的表达低于H组和Y组.各组Ⅰ型胶原的表达与其mRNA的表达有相同的变化趋势,Ⅰ型胶原主要位于H组和Y组的皮质小管区及髓质间质区,肾小球部位相对较少.T组移植肾纤维化程度低于H组和Y组.结论 转染shRNA-TGF-β_1能抑制移植肾TGF-β_1的表达,减少细胞外基质的生成,在一定程度上预防移植肾纤维化.     

新鲜同种异体神经移植基因治疗的实验研究

目的探讨新鲜同种异体神经移植的可能性及经基因治疗后的疗效。方法取健康成年不同窝的Wistar大鼠60只,按手术先后随机分为3组,每组各2 0只。将3组大鼠右侧的坐骨神经在梨状肌孔下0 .5cm处整齐切除2 .0cm ,切除的神经段互换移植修复神经缺损处。术中A组于局部肌肉及神经两断端注射转化生长因子β1(TGF β1)质粒,B、C组注射等量的生理盐水。术后仅C组给予环孢霉素A( 15mg/kg )喂养。于术后6周和12周进行形态学观测及再生轴突计数。结果A、C组的神经生长明显优于B组,水肿明显减轻。A、C组再生轴突数明显多于B组[A组为( 78.3±4.6)个, x±s ,下同] ;B组为( 15 .0±3 .5 )个,C组为( 76.1±4.2 )个。A、C组明显优于B组(P <0 .0 1)。A、C两组的差异无统计学意义(P >0 .0 5 ) ,两组再生轴突均已通过移植体。结论局部使用TGF β1质粒可在局部发挥免疫抑制作用,降低宿主的免疫排斥反应。     

小鼠胸腺内注射异基因抗原对异体神经移植免疫反应的影响

目的　探讨胸腺内注射异基因抗原对异体鼠坐骨神经移植存活的影响。　方法　 70只Balb/c小鼠随机分为 5组 :自体神经移植组 (A组 )、异体神经移植组 (B组 )、冷冻后异体神经移植组 (C组 )、应用免疫抑制剂异体神经移植组 (D组 )和胸腺内注射供体组织相容性 (MHC)抗原后移植组 (E组 )。 3周后进行神经电生理检查、组织学检查、混合淋巴细胞培养及迟发性超敏反应的检测。　结果　运动神经传导速度E组为 3 8 2 3 (m /s) ,与D组相比差异无显著性 (P >0 0 5 ) ,且E组优于C组、B组。混合淋巴细胞培养E组为 2 668 3 7(cpm ) ,迟发性超敏反应E组为 0 5 10 (cpm ) ,组织学及电镜检查均证实A组优于E组、E组分别优于C组、D组、B组。　结论　胸腺内注射异基因抗原可诱导对异体坐骨神经移植的特异性免疫耐受。     

狗神经异体移植实验

文献报道异体神经用降低抗原性的方法处理后移植，轴突可以再生，所用方法有酒精浸泡、冻融、冷冻等［１３］，但这类实验中移植段不超过３ｃｍ，更长的移植段是否行尚不清楚。本实验研究狗５ｃｍ坐骨神经异体移植的效果，神经处理方法是冻融或加免疫抑制剂浸泡。材料和方法选用２１只成年杂种狗分５组，每只狗一侧坐骨神经进行移植，另一侧做正常对照。（１）自体移植，３只狗，把切除的５ｃｍ坐骨神经原位缝合；（２）异体未处理神经移植，３只狗，移植则仅从只１只狗取下的坐骨神经；（３）异体冻融处理神经移植，５只狗，神经取下浸入…     

绿茶多酚保存同种异体神经移植体的实验研究

[目的]研究绿茶多酚溶液保存的同种异体神经修复大鼠坐骨神经缺损的效果.[方法] 48只成年雄性Wista大鼠,随机分为4组,每组12只,将坐骨神经在梨状肌孔下5 mm 处切除1.0 cm, 神经缺损分别用4种移植物桥接.A组:自体神经移植;B组:新鲜异体神经移植;C组:经冷冻处理的异体神经移植;D组:用绿茶多酚保存的异体神经移植.术后6、12周通过大体观察、电生理学检查、组织学观察、透射电镜观察、图像分析与定量学检测评价各组修复神经缺损的效果.[结果]A、D组间差异无统计学意义(P＞0.05),A组、D组的各项指标均优于B组、C组(P＜0.05或P＜0.01).[结论]绿茶多酚溶液保存的同种异体神经是良好的神经移植替代材料.     

辐照和绿茶多酚处理同种异体神经移植体的实验研究

[目的]比较经绿茶多酚溶液及辐照预处理的同种异体神经修复大鼠坐骨神经缺损的效果.[方法] 48只成年雄性Wista大鼠,将坐骨神经在梨状肌孔下5 mm处切除1.0 cm,随机分为4组,每组12只,神经缺损分别用4种移植物桥接.A组:自体神经移植;B组:新鲜异体神经移植;C组:经辐照处理的异体神经移植;D组:绿茶多酚溶液保存的异体神经移植.术后6、12周通过大体、电生理学、组织学、透射电镜观察评价各组修复神经缺损的效果.[结果]A、D组间差异无统计学意义,A、D组的各项指标均优于B、C组.[结论]大鼠坐骨神经缺损模型中,绿茶多酚溶液保存的同种异体神经是良好的神经移植替代材料,移植后神经再生情况优于辐照预处理的异体神经.     

优化法去细胞大鼠神经同种异体移植修复坐骨神经缺损

[目的]以优化法去细胞大鼠神经移植,修复同种异体坐骨神经缺损,观察术后动物的免疫排斥、早期功能恢复及神经再生情况。[方法]以优化去细胞方法处理新鲜取材的成年SD大鼠坐骨神经,移植修复同种异体1.0cm坐骨神经缺损,以自体神经和新鲜异体神经移植为对照,术后1个月行坐骨神经功能指数评价、神经电生理和组织学检查,观察动物在功能恢复、免疫排斥及神经再生方面的情况。[结果]自体神经和去细胞异体神经移植组动物的坐骨神经功能指数无显著差异(P>0.05),大体观察均可见神经连续性良好。电生理检测表明2组动物移植神经均已恢复电传导能力,在传导速度(CV)上无显著差异(P>0.05),但均未达到正常神经水平(P<0.05)。组织学观察则显示2组再生神经纤维均已长入移植段远端。S-100免疫组化显示两者在雪旺氏细胞数、形态和排列等方面无明显差异。2组在CD8 T细胞和巨噬细胞免疫组化染色阳性面积百分比上差异无统计学意义(P>0.05)。计算移植神经中段轴突密度后表明两者无显著差异(P>0.05),但都比正常神经小(P<0.05),比新鲜异体神经移植组大(P<0.05)。[结论]优化去细胞神经移植组与自体神经移植组在免疫排斥、功能恢复及神经再生方面无显著差异。优化法去细胞神经在移植修复同种异体神经缺损时,可以达到免疫耐受,其早期功能恢复和神经再生情况良好,在修复周围神经缺损时可以作为自体神经移植的一种替代疗法。     

冷冻异体骨加TGF-β1和bFGF复合移植修复骨缺损的研究

目的 观察重组TGF-β1 和bFGF在经冷冻处理的同种异体骨移植修复骨缺损过程中促进骨愈合的作用.方法 以杂兔作为实验动物,修复兔桡骨1.2cm缺损.冷冻处理后的异体骨加纤维蛋白载体携带bFGF和TCF-β1移植作为实验组(A组),自体桡骨移植(B组)和单纯异体骨移植(C组)作为对照组.术后不同时间拍摄X线片,同位素骨扫描计数分析和HE染色组织切片观察和扫描电镜观察.结果 X线检查自体移植较异体移植提前愈合,同位素扫描计数分析2周后A和B组明显优于C组,并有显著差异(P<0.01).组织学观察异体移植骨切片可见明显的髓腔内诱导成骨相.结论TGF-β1 和bFGF能明显促进异体移植修复骨缺损中的骨愈合过程.     

超低温冷冻保存后同种异体神经移植的实验研究

目的　探索大鼠同种异体神经移植的可行性。方法　取Wistar大鼠坐骨神经 ,经超低温冷冻保存后移植于SD大鼠坐骨神经缺损处。分成超低温冷冻同种神经移植组 (A)、新鲜同种神经移植组(B)、及自体神经移植组 (C)。 3组均在术后 3、8、12、16周行大体观察 ,检测形态学、电生理变化及血清IL 2、TNF水平。结果　A、C组的腓肠肌萎缩 ;足无明显畸形 ,趾无缺损、无溃疡。B组的腓肠肌萎缩 ;足部溃疡伴趾部分缺损。A、C组在术后 8周刺激神经移植段近端有动作电位出现 ,B组在术后 12周出现。A组动作电位的波幅较B组高。血清IL 2 ,C组与B组差别有显著性 (P <0 .0 5 ) ,A组与C组比较差别无显著性 (P >0 .0 5 )。光镜下A组空泡变性、炎性细胞浸润少。电镜下见髓鞘厚薄基本相同 ,轴突密度高 ,雪旺细胞发育较完善 ,明显优于B组。结论　超低温冷冻保存能降低同种异体神经的抗原性 ,在不用免疫抑制剂情况下 ,动物用同种异体神经移植是可行的     

C7神经根移位重建截瘫大鼠股四头肌功能的实验研究

目的 比较应用C7神经根移位加自体、异体神经移植修复重建截瘫大鼠股四头肌功能的疗效.方法取16周龄SPF级雄性Wistar大鼠20只制备冷冻坐骨神经.取14周龄SPF级Wistar雄性大鼠36只,于手术显微镜下,显微剪半横断左侧脊髓造成左侧截瘫模型.建模成功后,随机分A、B组(n=18).A组通过C7神经根移位将自体同侧坐骨神经桥接股神经根,B组通过C7神经根移位将同种异体冷冻坐骨神经桥接股神经根.两组分别于术后16、24周各取9只行神经电生理检测、大体观察及组织学观察,计算股四头肌湿重恢复率. 结果 术后16周,A组诱发动作电位幅值(nerve action-evoked potential,NAP)为(1.14±0.07)mV,B组为(0.87±0.06)mV;A组移位神经传导速度(nerve conduction velocity,NCV)为(17.34±2.15)m/s,B组为(11.23±1.45)m/s.术后24周,A组NAP为(1.21±0.07)mV,B组为(0.99±0.05)mV;A组NCV为(19.00 ±3.02)m/s,B组为(12.54 ±1.59)m/s.两组各时间点比较差异均有统计学意义(P＜0.05).术后16、24周,HE染色、Bielschowsky嗜银染色均显示A组再生神经纤维数目较多、轴突排列较整齐规则;B组再生神经纤维数目较少,轴突排列分布较零散.术后24周透射电镜观察示两组移植神经内均有大量再牛有髓神经纤维及少量无髓神经纤维通过.术后16周,A、B组有髓神经纤维数目分别为(438±79)、(196±31)个/视野,有髓神经纤维面积分别为(5 596.00 ±583.94)、(4 022.63 ±615.75)μm2视野;术后24周,A、B组有髓神经纤维数目分别为(642±64)、(321±75)个/视野,有髓神经纤维面积分别为(6 689.50±1142.10)、(4 733.00±982.22)μm2/视野;两组比较差异均有统计学意义(P＜0.05).术后16周,A、B组股四头肌湿重恢复率分别为87.96%±4.93%和86.47%±7.47%;术后24周,A、B组分别为90.10%±4.22%和87.66%±3.14%,两组各时间点比较差异均无统计学意义(P＞0.05). 结论 C7神经根移位加自体、异体坐骨神经移植均能重建截瘫大鼠股四头肌部分功能,自体坐骨神经移植组效果明显优于异体坐骨神经移植组.     

冻干去细胞同种异体神经种植类许旺细胞修复坐骨神经缺损的实验研究

目的研究冻干去细胞异体神经修复大鼠坐骨神经缺损的效果。方法50只成年雌性DA大鼠随机分为5组，每组10只，分别用5种移植物桥接大鼠1．5cm坐骨神经缺损。A组：冻干去细胞异体神经种植类许旺细胞移植组；B组：冻干去细胞异体神经移植组；C组：去细胞异体神经移植组；D组：新鲜异体神经移植组；E组：自体神经移植组。术后4、24周通过大体观察、神经电生理、肌肉湿重及组织学指标评价各组修复神经缺损的效果。结果术后24周A、E组间差异无统计学意义（P〉0．05），A、E组的各项指标均优于B、C、D组（P〈0．05或P〈0．01）。结论冻干化学去细胞神经是良好的神经移植替代材料。     

反义TGF-β1对周围神经生长影响的实验研究

目的 观察反义TGF-β1对大鼠坐骨神经损伤后神经纤维再生及神经功能恢复的影响. 方法 将50只成年SD大鼠随机分成3组:NS组(神经吻合术后局部注射生理盐水,20只)、反义TGF-β1组(神经吻合术后局部注射反义TGF-β1,20只)和正常对照组(不做任何处理,10只).术后6周、12周分别用免疫组化检测胶原Ⅰ、Ⅲ的表达量;显微镜下对新生神经纤维数量进行计数;应用足印分析和电生理检查技术,从功能角度判定反义TGF-β1的生物效应.结果 在6周、12周两个时相点,免疫组化结果证实,反义TGF-β1组胶原Ⅰ、Ⅲ表达低于NS组(分别为P＜0.05,P＜0.05);神经纤维计数证实,新生神经纤维数目明显优于NS组(P＜0.05);在坐骨神经功能指数测定、神经传导速度等神经功能恢复指标上,TGF-β1组优于对照组(P＜ 0.05). 结论 反义TGF-β1通过抑制胶原Ⅰ、Ⅲ的过量表达,预防神经损伤后创伤性神经瘤的形成,有利于损伤神经纤维轴索再生,使大鼠的神经功能得到了明显改善.     

经雷公藤预处理大鼠异体神经移植后早期组织形态及免疫学观察

目的 观察经雷公藤预处理大鼠异体神经移植后髓鞘损伤程度及急性期免疫排斥反应,探讨雷公藤早期免疫抑制作用及合适用药浓度. 方法取60只3月龄雄性SD大鼠制备右侧坐骨神经干缺损模型,随机分为A、B、C、D、E组5组(n=12).取18只3月龄雄性Wistar大鼠,切取双侧坐骨神经干约15 mm,置入含200、400、800 mg/L雷公藤多甙细胞保存液(各浓度组浸泡12条神经),4℃下浸泡24 h,作为A、B、C组神经修复供体,修复神经缺损;另取6只3月龄Wistar大鼠,切取12条新鲜坐骨神经桥接于D组神经缺损处;E组将切下的自体坐骨神经立即行原位缝合.术后不同时间对移植神经行大体、光镜、电镜观察,检测髓鞘碱性蛋白(myelin basic protein,MBP)含量变化及免疫组织化学分析移植物CD4 、CD8 T细胞入侵情况. 结果 术后1周,A、B、C组神经纤维形态及结构较完整,炎性细胞浸润程度较D组轻;术后1、2、4周,A、B、C组组织形态学观察结果 相似,移植神经片段外形及结构清晰,与周围结缔组织粘连均较D组轻;术后48h及1、2、4周,各组均有不同程度髓鞘损伤,各时间点坐骨神经MBP含量B组最接近E组,两组差异无统计学意义(P＞0.05).术后1、4周,A、B、C组CD4 ,CD8 分子的IA值与D组比较,差异均有统计学意义(p＜0.05). 结论 雷公藤能有效降低异体神经移植术后早期急性排斥反应,对髓鞘发挥一定的保护作用.     

FK506缓释膜应用于同种异体神经移植的实验研究

目的研究普乐可复(prograf,FK506)缓释膜在同种异体神经移植中的作用。方法应用异体神经桥接大鼠坐骨神经缺损,术中局部应用FK506缓释膜,分别于术后4、8、12周对移植物行大体和光镜观察,及轴突图像分析、移植神经电镜检查、小腿三头肌肌湿重比较、患肢坐骨神经电生理检查。结果C组(应用FK506缓释膜)的神经生长最好,基本与D组(自体神经移植)相同,B组(经预处理异体神经移植)次之,A组(新鲜异体神经移植)最差。经过对肌电图、轴突计数、肌湿重的统计学分析,C、B、A组的差异有统计学意义(P<0.05),C、D组之间差异无统计学意义。结论应用FK506缓释膜有助于减轻同种异体神经的免疫排斥反应,为神经再生创造良好条件;在同种异体神经移植中应用FK506缓释膜有助于促进神经再生。