中国人Uroplakin Ⅱ基因的克隆及其真核表达载体构建

目的 克隆中国人UroplakinⅡ基因并构建其真核表达载体。方法 采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法从1例GⅢ/T_3N_0M_0膀胱移行上皮癌(TCC)标本中扩增UroplakinⅡ全长cDNA后进行核酸序列分析,并构建其真核表达载体;重组子瞬时转染UroplakinⅡ基因缺陷型TCC EJ细胞株72h后,RT-PCR法检测癌细胞UroplakinⅡ表达水平。结果 成功克隆了中国人UroplakinⅡ全长cDNA(555 bp),与国外报道的序列同源性高达100％。真核表达载体pcDNA-UPⅡ转染EJ细胞后,癌细胞UroplakinⅡmRNA水平显著增高(P<0.01)。结论 从中国人TCC组织中克隆出UroplakinⅡ基因,为深入研究UroplakinⅡ基因在TCC生物学行为中的作用及其靶向生物治疗策略奠定了基础。     

稳定转导反义增殖细胞核抗原基因对膀胱癌细胞体外增殖活性的调控作用

目的　探讨反义增殖细胞核抗原 (PCNA)基因对膀胱癌细胞增殖活性的影响。方法脂质体介导PCNA反义真核表达载体转染膀胱癌EJ细胞 72h后 ,G41 8筛选 4周获得亚克隆细胞株EJ/AP ,采用SABC免疫组织化学方法和逆转录 聚合酶链式反应 (RT PCR)法检测PCNA基因表达 ,噻唑蓝 (MTT)比色分析、3H 胸腺嘧啶核苷 (3H TdR)掺入法、流式细胞仪、克隆形成实验检测癌细胞体外增殖活性。结果　同EJ细胞比较 ,所获亚克隆EJ/AP中PCNA蛋白及mRNA表达完全抑制 ,癌细胞体外增殖活性抑制 49.38% (P <0 .0 5) ,DNA合成速率降低 47.71 % (P <0 .0 1 ) ,细胞周期阻滞于G0 /G1 期 ,克隆形成能力抑制 64 .73 % (P <0 .0 1 )。结论　稳定转染反义PCNA基因能有效抑制膀胱癌细胞体外增殖活性 ,有望成为膀胱癌基因治疗的有效策略     

稳定表达Angiopoietin-1基因肝癌细胞株的建立及其意义

目的 通过将Angipoietin-1基因转染培养人肝癌细胞SMMC－7721,建立长期表达Angipoietin-1基因的肝癌细胞模型。方法 基因重组构建Angipoietin-1真核表达质粒pcDNA3/Angipoietin-1,经脂质体将pcDNA3/Angipoietin-1质粒转染培养人肝癌细胞株SMMC－7721,G418筛选阳性细胞克隆,逆转录－聚合酶链反应（RT－PCR）检测转染后25-30d细胞Angipoietin-1基因mRNA表达水平。结果 （1）限制酶切和凝胶电泳证明成功构建表达质粒pcDNA3／Angipoietin-1;（2）通过脂质体Dosper将质粒pcDNA3／Angipoietin-1转染SMMC－7721,经G418筛选后获得阳性细胞克隆;（3）RT－PCR证明经脂质体转染的人肝 癌细胞株SMMC－7721可较稳定表达Angipoietin-1基因。结论 成功建立稳定表达Angipoietin-1基因的肝癌细胞株SMMC－7721／Angipoietin-1,为通过在体途径探讨Angipoietin-1对肿瘤血管生成的调节作用奠定了基础。     

Egr-1启动子序列调控hytk表达的实验研究

目的　探讨辐射诱导基因调控元件Egr 1调控的潮霉素磷酸转移酶和单纯疱疹病毒胸苷激酶 (HSV TK)融合基因 (hytk)对体外膀胱癌细胞的杀伤作用。 　方法　采用重组DNA技术构建携带Egr 1调控序列的hytk基因表达载体 ,应用FuGENETM6系统转染膀胱癌细胞株EJ并检测hytk基因在辐射作用下的表达及联合更昔洛韦 (GCV)对膀胱癌细胞的杀伤作用。 　结果　成功获得带Egr 1启动子的真核表达载体 pCIneo/Egr 1 hytk ,经FuGENETM6系统转染后经RT PCR、West ernBlot检测示hytk基因成功整合入EJ细胞中并在mRNA、蛋白质水平获得表达 ,辐射后 2 4h的转基因细胞hytk含量较照射前明显增高 (P <0 .0 5 ) ;辐射和GCV联合作用的转基因细胞杀伤率明显高于单纯GCV作用。　结论　含有Egr 1启动子的hytk真核表达载体是膀胱癌基因治疗中新型、理想的候选载体之一。     

血管内皮生长因子可溶性受体flt-1_(n3)对裸鼠人膀胱癌生长的影响

目的　研究血管内皮生长因子 (VEGF)受体flt 1胞外区基因抗肿瘤新生血管生成的作用。　方法　采用脂质体转染技术将含有flt 1胞外区前三个IgG样结构区域的真核表达质粒 pcD NA3.1/KDRn7转入人膀胱癌EJ细胞 ,用G418筛选得到稳定表达目的蛋白的细胞克隆 ,经固相结合实验筛选得到表达与VEGF特异结合的目的蛋白的细胞克隆 ,阳性细胞克隆进行PCR和RT PCR鉴定。对裸鼠人膀胱癌组织切片进行免疫组化染色 ,定量分析微血管密度。　结果　PCR和RT PCR结果显示重组质粒转入EJ细胞及在转录水平表达 ;免疫组化的微血管密度实验组明显低于阴性对照组。　结论　阻断VEGF/flt 1信号传导途径能够抑制肿瘤新生血管的形成 ,延缓肿瘤的生长速度     

膀胱移行细胞癌组织中黑色素瘤抗原基因及蛋白的表达

目的探讨膀胱移行细胞癌(TCC)中黑色素瘤抗原(MAGE)基因mRNA的表达及其临床意义。方法采用逆转录聚合酶链反应(RT PCR)技术检测3个膀胱TCC细胞株和20例膀胱TCC患者癌组织(新鲜标本,T1期7例,T2期5例,T3期6例,T4期2例;G11例,G211例,G38例)MAGE A1,A2,A3,A4mRNA表达,免疫组化法检测105例膀胱TCC患者癌组织(石蜡标本,T1期35例,T2期12例,T3期26例,T4期13例,另19例无法确定分期;G113例,G244例,G348例)MAGE A4蛋白的表达。结果3个膀胱TCC细胞株均有MAGE基因mRNA的表达;20例膀胱TCC新鲜标本组织MAGEmRNA阳性:A112例(60%),A216例(80%),A311例(55%),A418例(90%),A1～A4均阳性8例(40%)。105例膀胱TCC石蜡标本组织中MAGE A4蛋白阳性53例(50%),高分级膀胱TCC组织中强表达(++或+++)率为27%(13/48),显著高于低分级的4%(2/57)(F=12.00,P<0.01),高分期膀胱TCC组织中强表达率为27%(14/51),显著高于低分期的0%(0/35)(F=11.48,P<0.01)。结论MAGE基因在膀胱TCC中有较高表达,分级或分期高的膀胱TCC中MACE A4蛋白明显强表达。     

人IFN-γ cDNA逆转录病毒载体的构建及其在人膀肤癌细胞中的表达

用逆转录病毒载体介导转移人干扰素γ(hIFN-γ)基因在人膀胱癌细胞EJ中稳定表达。应用基因重组技术构建含hIFN-γ基因的逆转录病毒载体pZip-hIFN-γ,采用脂质体介导法转染包装细胞Ψ-2和PA 317,然后用高病毒滴度的PA 317细胞培养上清感染EJ细胞。经G 418筛选培养得到一株能稳定分泌hIFN-γ(210IU/ml)的EJ克隆,Southern印迹证实hIFN-γ基因已插入EJ基因组中。逆转录病毒载体pZip-hIFN-γ能有效地介导基因转移,并能使目的基因在靶细胞稳定表达,这为人膀胱癌转hIFN-γ基因瘤苗的应用研究打下了基础。     

血管内皮生长因子可溶性受体flt—1n3对裸鼠人膀胱癌生长的影响

目的；研究血管内皮生长因子（VEGF）受体flt-1脑外区基因抗肿瘤新生血管生成的作用。方法：采用脂质体转染技术将含有flt-1胞外区前三个IgG样结构区域的真核表达质粒pcDNA3.1/KDPn7转入人膀胱癌EJ细胞，用G418筛选得到稳定表达目的蛋白的细胞克隆，经固相结合实验筛先得到表达与VEGF特异结合的目的蛋白的细胞克隆，阳性细胞克隆进行PCR和RT－PCR鉴定。对裸鼠人膀胱癌组织切片进行免疫组化染色，定量分析微血管密度。结果：PCR和RT－PCR结果显示重组质粒转入EJ细胞及在转录水平表达；免疫组化的微血管密度实验组明显低于阴性对照组。结论：阻断VEGF／flt-1信号传导途径能够抑制肿瘤新生血管的形成，延缓肿瘤的生长速度。     

野生型和突变型RASSF1A基因对人肝癌细胞生长的影响

目的　探讨野生型 /突变型RASSF1A基因的表达对人肝癌细胞株QGY 770 3在体内外生长的影响。方法　构建突变型RASSF1A基因的真核表达载体 ,通过脂质体介导的基因转染法将野生型 /突变型RASSF1A基因的真核表达载体及空载体转染肝癌细胞株QGY 770 3 ,G418筛选稳定表达株 ,并以逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR)和Westernblot进行鉴定。通过细胞生长曲线、软琼脂集落形成试验和裸鼠致瘤性试验对各稳定表达株的生物学行为进行检测。结果　成功建立稳定表达野生型和突变型RASSF1A基因的肝癌细胞株。以转染空载体的QGY 770 3细胞为对照 ,野生型RASSF1A基因的表达可明显抑制肝癌细胞在体外的生长 ,显著降低肝癌细胞在软琼脂中形成的克隆数目 (P <0 .0 1)和大小 ,显著减慢裸鼠皮下瘤的生长速度和重量 (P <0 .0 1)。突变型RASSF1A基因的表达对肝癌细胞的生长影响不大。结论　野生型RASSF1A的重表达有助于QGY 770 3恶性表型的逆转 ;野生型RASSF1A基因是一个肝癌相关的抑癌基因。     

多药耐药真核表达载体的构建及其生物学特性

目的 构建携带多药耐药相关蛋白（MRP）全长基因的真核表达载体，并研究其在人肝癌细胞株HepG2中的表达特性。方法 双酶切克隆质粒pGEM-mrp1，获得含mrp1全长的cDNA片段，再将此片段定向克隆到哺乳动物真核表达载体pCI-neo的多克隆位点，经脂质体法转染HepG2细胞，G418筛选获得稳定表达的转基因细胞系HepG2／mrp1。RT—PCR检测HepG2／mrp1细胞mrp1 mRNA表达，流式细胞仪检测HepG2／mrp1细胞MRP的含量。结果 本实验所构建的携带mrp1全长基因的表达载体pCI-mrp1能在HepG2细胞中表达，形成稳定的多药耐药细胞系HepG2／mrp1，其多药耐药性、MRP含量及mrp1mRNA表达均较未转染该载体的HepG2细胞显著增加。结论 将携带全长人多药耐药相关蛋白基因mrp1的载体导人人肝癌细胞株能够建立高效、稳定的多药耐药细胞株，为进一步研究多药耐药的机理及逆转多药耐药提供理想的细胞模型。     

IRX1真核表达载体的构建及在胃癌细胞SGC-7901中的定位

目的 构建pEGFP-IRX1真核表达载体,体外转导至SGC-7901胃癌细胞株,观察IRX1基因转染后蛋白表达与细胞内定位.方法 PCR扩增IRX1全长1443 bp编码序列,将PCR扩增产物连接人pGEM-Teasy载体,经测序确认序列无误后,亚克隆入pEGFP-N1载体,构建pEG-FP-IRX1真核表达载体.采用Lipofectamine 2000转染SGC-7901胃癌细胞株,在荧光显微镜下观察外源性IRX1基因导入后在胃癌细胞内的表达与亚细胞定位.结果 成功构建有绿色荧光蛋白融合的IRX1真核表达载体,外源性IRX1基因在胃癌SGC-7901细胞中表达成功,在荧光显微镜下IRX1表达蛋白定位于细胞核内.结论 pEGFP-IRX1真核表达载体构建成功,并可在细胞内表达,这将为IRX1在胃癌内的功能研究奠定基础.     

IRX1真核表达载体的构建及在胃癌细胞SGC-7901中的定位

目的 构建pEGFP-IRX1真核表达载体,体外转导至SGC-7901胃癌细胞株,观察IRX1基因转染后蛋白表达与细胞内定位.方法 PCR扩增IRX1全长1443 bp编码序列,将PCR扩增产物连接人pGEM-Teasy载体,经测序确认序列无误后,亚克隆入pEGFP-N1载体,构建pEG-FP-IRX1真核表达载体.采用Lipofectamine 2000转染SGC-7901胃癌细胞株,在荧光显微镜下观察外源性IRX1基因导入后在胃癌细胞内的表达与亚细胞定位.结果 成功构建有绿色荧光蛋白融合的IRX1真核表达载体,外源性IRX1基因在胃癌SGC-7901细胞中表达成功,在荧光显微镜下IRX1表达蛋白定位于细胞核内.结论 pEGFP-IRX1真核表达载体构建成功,并可在细胞内表达,这将为IRX1在胃癌内的功能研究奠定基础.     

IRX1真核表达载体的构建及在胃癌细胞SGC-7901中的定位

目的 构建pEGFP-IRX1真核表达载体,体外转导至SGC-7901胃癌细胞株,观察IRX1基因转染后蛋白表达与细胞内定位.方法 PCR扩增IRX1全长1443 bp编码序列,将PCR扩增产物连接人pGEM-Teasy载体,经测序确认序列无误后,亚克隆入pEGFP-N1载体,构建pEG-FP-IRX1真核表达载体.采用Lipofectamine 2000转染SGC-7901胃癌细胞株,在荧光显微镜下观察外源性IRX1基因导入后在胃癌细胞内的表达与亚细胞定位.结果 成功构建有绿色荧光蛋白融合的IRX1真核表达载体,外源性IRX1基因在胃癌SGC-7901细胞中表达成功,在荧光显微镜下IRX1表达蛋白定位于细胞核内.结论 pEGFP-IRX1真核表达载体构建成功,并可在细胞内表达,这将为IRX1在胃癌内的功能研究奠定基础.     

IRX1真核表达载体的构建及在胃癌细胞SGC-7901中的定位

目的 构建pEGFP-IRX1真核表达载体,体外转导至SGC-7901胃癌细胞株,观察IRX1基因转染后蛋白表达与细胞内定位.方法 PCR扩增IRX1全长1443 bp编码序列,将PCR扩增产物连接人pGEM-Teasy载体,经测序确认序列无误后,亚克隆入pEGFP-N1载体,构建pEG-FP-IRX1真核表达载体.采用Lipofectamine 2000转染SGC-7901胃癌细胞株,在荧光显微镜下观察外源性IRX1基因导入后在胃癌细胞内的表达与亚细胞定位.结果 成功构建有绿色荧光蛋白融合的IRX1真核表达载体,外源性IRX1基因在胃癌SGC-7901细胞中表达成功,在荧光显微镜下IRX1表达蛋白定位于细胞核内.结论 pEGFP-IRX1真核表达载体构建成功,并可在细胞内表达,这将为IRX1在胃癌内的功能研究奠定基础.     

IRX1真核表达载体的构建及在胃癌细胞SGC-7901中的定位

目的 构建pEGFP-IRX1真核表达载体,体外转导至SGC-7901胃癌细胞株,观察IRX1基因转染后蛋白表达与细胞内定位.方法 PCR扩增IRX1全长1443 bp编码序列,将PCR扩增产物连接人pGEM-Teasy载体,经测序确认序列无误后,亚克隆入pEGFP-N1载体,构建pEG-FP-IRX1真核表达载体.采用Lipofectamine 2000转染SGC-7901胃癌细胞株,在荧光显微镜下观察外源性IRX1基因导入后在胃癌细胞内的表达与亚细胞定位.结果 成功构建有绿色荧光蛋白融合的IRX1真核表达载体,外源性IRX1基因在胃癌SGC-7901细胞中表达成功,在荧光显微镜下IRX1表达蛋白定位于细胞核内.结论 pEGFP-IRX1真核表达载体构建成功,并可在细胞内表达,这将为IRX1在胃癌内的功能研究奠定基础.     

IRX1真核表达载体的构建及在胃癌细胞SGC-7901中的定位

目的 构建pEGFP-IRX1真核表达载体,体外转导至SGC-7901胃癌细胞株,观察IRX1基因转染后蛋白表达与细胞内定位.方法 PCR扩增IRX1全长1443 bp编码序列,将PCR扩增产物连接人pGEM-Teasy载体,经测序确认序列无误后,亚克隆入pEGFP-N1载体,构建pEG-FP-IRX1真核表达载体.采用Lipofectamine 2000转染SGC-7901胃癌细胞株,在荧光显微镜下观察外源性IRX1基因导入后在胃癌细胞内的表达与亚细胞定位.结果 成功构建有绿色荧光蛋白融合的IRX1真核表达载体,外源性IRX1基因在胃癌SGC-7901细胞中表达成功,在荧光显微镜下IRX1表达蛋白定位于细胞核内.结论 pEGFP-IRX1真核表达载体构建成功,并可在细胞内表达,这将为IRX1在胃癌内的功能研究奠定基础.     

IRX1真核表达载体的构建及在胃癌细胞SGC-7901中的定位

目的 构建pEGFP-IRX1真核表达载体,体外转导至SGC-7901胃癌细胞株,观察IRX1基因转染后蛋白表达与细胞内定位.方法 PCR扩增IRX1全长1443 bp编码序列,将PCR扩增产物连接人pGEM-Teasy载体,经测序确认序列无误后,亚克隆入pEGFP-N1载体,构建pEG-FP-IRX1真核表达载体.采用Lipofectamine 2000转染SGC-7901胃癌细胞株,在荧光显微镜下观察外源性IRX1基因导入后在胃癌细胞内的表达与亚细胞定位.结果 成功构建有绿色荧光蛋白融合的IRX1真核表达载体,外源性IRX1基因在胃癌SGC-7901细胞中表达成功,在荧光显微镜下IRX1表达蛋白定位于细胞核内.结论 pEGFP-IRX1真核表达载体构建成功,并可在细胞内表达,这将为IRX1在胃癌内的功能研究奠定基础.     

IRX1真核表达载体的构建及在胃癌细胞SGC-7901中的定位

目的 构建pEGFP-IRX1真核表达载体,体外转导至SGC-7901胃癌细胞株,观察IRX1基因转染后蛋白表达与细胞内定位.方法 PCR扩增IRX1全长1443 bp编码序列,将PCR扩增产物连接人pGEM-Teasy载体,经测序确认序列无误后,亚克隆入pEGFP-N1载体,构建pEG-FP-IRX1真核表达载体.采用Lipofectamine 2000转染SGC-7901胃癌细胞株,在荧光显微镜下观察外源性IRX1基因导入后在胃癌细胞内的表达与亚细胞定位.结果 成功构建有绿色荧光蛋白融合的IRX1真核表达载体,外源性IRX1基因在胃癌SGC-7901细胞中表达成功,在荧光显微镜下IRX1表达蛋白定位于细胞核内.结论 pEGFP-IRX1真核表达载体构建成功,并可在细胞内表达,这将为IRX1在胃癌内的功能研究奠定基础.     

IRX1真核表达载体的构建及在胃癌细胞SGC-7901中的定位

目的 构建pEGFP-IRX1真核表达载体,体外转导至SGC-7901胃癌细胞株,观察IRX1基因转染后蛋白表达与细胞内定位.方法 PCR扩增IRX1全长1443 bp编码序列,将PCR扩增产物连接人pGEM-Teasy载体,经测序确认序列无误后,亚克隆入pEGFP-N1载体,构建pEG-FP-IRX1真核表达载体.采用Lipofectamine 2000转染SGC-7901胃癌细胞株,在荧光显微镜下观察外源性IRX1基因导入后在胃癌细胞内的表达与亚细胞定位.结果 成功构建有绿色荧光蛋白融合的IRX1真核表达载体,外源性IRX1基因在胃癌SGC-7901细胞中表达成功,在荧光显微镜下IRX1表达蛋白定位于细胞核内.结论 pEGFP-IRX1真核表达载体构建成功,并可在细胞内表达,这将为IRX1在胃癌内的功能研究奠定基础.     

IRX1真核表达载体的构建及在胃癌细胞SGC-7901中的定位

目的 构建pEGFP-IRX1真核表达载体,体外转导至SGC-7901胃癌细胞株,观察IRX1基因转染后蛋白表达与细胞内定位.方法 PCR扩增IRX1全长1443 bp编码序列,将PCR扩增产物连接人pGEM-Teasy载体,经测序确认序列无误后,亚克隆入pEGFP-N1载体,构建pEG-FP-IRX1真核表达载体.采用Lipofectamine 2000转染SGC-7901胃癌细胞株,在荧光显微镜下观察外源性IRX1基因导入后在胃癌细胞内的表达与亚细胞定位.结果 成功构建有绿色荧光蛋白融合的IRX1真核表达载体,外源性IRX1基因在胃癌SGC-7901细胞中表达成功,在荧光显微镜下IRX1表达蛋白定位于细胞核内.结论 pEGFP-IRX1真核表达载体构建成功,并可在细胞内表达,这将为IRX1在胃癌内的功能研究奠定基础.