重组腺病毒AdCat转染增加血管平滑肌细胞中过氧化氢酶表达

目的：制备含过氧化氢酶基因的重组腺病毒，转染血管平滑肌细胞，观察过氧化氢酶表达水平。方法：将过氧化氢酶cDNA亚克隆至pShuttle-CMV中，将其和pAdEasy-1在细菌内进行同源重组，构建重组腺病毒质粒pAdEasy-1-Cat，再转染Ad-293细胞，包装成重组腺病毒颗粒；经纯化获取重组腺病毒AdCat。转染血管平滑肌细胞，Westem blot鉴定细胞中过氧化氢酶表达。结果：正确构建了重组腺病毒载体，获得高滴度重组腺病毒，转染血管平滑肌细胞后过氧化氢酶高表达。结论：重组腺病毒AdCat转染增加血管平滑肌细胞中过氧化氢酶表达，为用过氧化氢酶基因进行再狭窄的防治打下了基础。     

腺病毒介导hRAMP1基因转染血管平滑肌细胞的增殖和凋亡

背景:外源性受体活性修饰蛋白1基因转染可能对血管平滑肌细胞增殖调控具有重要的作用。目的:探讨腺病毒载体介导人受体活性修饰蛋白1基因对体外培养的兔血管平滑肌细胞增殖和凋亡的影响。方法:分离培养获得兔主动脉血管平滑肌细胞,分别以携带人受体活性修饰蛋白1基因的腺病毒和空腺病毒转染后,分成人受体活性修饰蛋白1组、空病毒组和对照组。结果与结论:腺病毒转染细胞后随时间延长,报告基因绿色荧光蛋白表达逐渐增加,72h表达最强,感染率达80%,96h时仍有绿色荧光蛋白表达。人受体活性修饰蛋白1组的受体活性修饰蛋白1蛋白表达增加,血管平滑肌细胞凋亡率增加,细胞增殖明显抑制,与空病毒组和对照组比较差异有显著性意义(P<0.05)。提示人受体活性修饰蛋白1基因感染血管平滑肌细胞后明显抑制血管平滑肌细胞增殖,促进细胞凋亡。     

骨桥蛋白反义核苷酸对大鼠血管平滑肌细胞增殖的影响

背景:骨桥蛋白在血管损伤后新生内膜中的表达明显上调,而且能促进血管平滑肌细胞和外膜细胞的增殖、迁移.目的:探索骨桥蛋白反义核苷酸对大鼠血管平滑肌细胞增殖的影响.方法:培养大鼠A10主动脉血管平滑肌细胞,通过MTT比色法测定骨桥蛋白反义核苷酸对平滑肌细胞增殖的影响,流式细胞仪测定骨桥蛋白反义核苷酸对平滑肌细胞周期分布的影响;通过RT-PCR方法检测血管平滑肌细胞转染骨桥蛋白反义核苷酸对增殖细胞核抗原表达的影响.结果与结论:骨桥蛋白反义核苷酸对血管平滑肌细胞的增殖有明显的抑制作用,随时间延长对细胞增殖抑制率下降.骨桥蛋白反义核苷酸主要作用于G1/S限制点,能阻止血管平滑肌细胞由G0/G1期向S期推进,从而将血管平滑肌细胞阻滞于G0/G1期,抑制血管平滑肌细胞的增殖.血管平滑肌细胞转染骨桥蛋白反义核苷酸后,增殖细胞核抗原的表达水平均较对照组降低(P<0.05).因此,得出骨桥蛋白反义核苷酸通过阻止血管平滑肌细胞由G0/G1期向S期推进,从而抑制血管平滑肌细胞的增殖,进而抑制血管内膜增生.     

腺病毒介导hRAMP1基因转染血管平滑肌细胞的增殖和凋亡

背景：外源性受体活性修饰蛋白1基因转染可能对血管平滑肌细胞增殖调控具有重要的作用。目的：探讨腺病毒载体介导人受体活性修饰蛋白1基因对体外培养的兔血管平滑肌细胞增殖和凋亡的影响。方法：分离培养获得兔主动脉血管平滑肌细胞,分别以携带人受体活性修饰蛋白1基因的腺病毒和空腺病毒转染后,分成人受体活性修饰蛋白1组、空病毒组和对照组。结果与结论：腺病毒转染细胞后随时间延长,报告基因绿色荧光蛋白表达逐渐增加,72h表达最强,感染率达80%,96h时仍有绿色荧光蛋白表达。人受体活性修饰蛋白1组的受体活性修饰蛋白1蛋白表达增加,血管平滑肌细胞凋亡率增加,细胞增殖明显抑制,与空病毒组和对照组比较差异有显著性意义（P〈0.05）。提示人受体活性修饰蛋白1基因感染血管平滑肌细胞后明显抑制血管平滑肌细胞增殖,促进细胞凋亡。     

应用RNA干扰技术研究PPARδ基因对人大肠癌细胞增殖能力的影响

目的:探索PPARδ基因对大肠癌细胞增殖能力的影响。方法:构建表达短发夹结构RNA(short-hair-pinRNA,shRNA)的质粒载体,采用脂质体2000将质粒载体转染入大肠癌细胞株HCT-116,应用实时荧光定量逆转录PCR分析PPARδ基因沉默效果,采用噻唑蓝(MTT)比色实验、及流式细胞术观察HCT-116细胞株增殖及细胞周期的变化。结果:MTT试验显示,转染后24～96h,干扰组细胞在各时点的光吸收值均显著高于对照组(P<0.05)。转染后48h,干扰组的G1期细胞分布比对照组显著降低(26.8%VS38.6%,P=0.037),各组在S期与G2/M期的细胞分布比例(S期:G2/M期)无显著差异(P=0.782)。结论:PPARδ基因可增加G1期的大肠癌细胞分布,并抑制细胞增殖。     

信号转导分子smad4基因表达抑制体外培养人血管平滑肌细胞的增殖

目的:探讨细胞内转化生长因子β信号通路中信号转导分子Smad4与平滑肌细胞的增殖关系。方法:实验于2003-08/10在哈尔滨医科大学医学遗传学研究室完成。①取体质量200g左右的健康雄性SD大鼠,常规胶原酶消化法原代培养大鼠血管平滑肌细胞。用体积分数为0.2和0.05(去血清培养)胎牛血清和的Dulbecco改良的Eagle培养基,37℃,体积分数0.05CO2进行培养,2.5g/L胰酶消化传代。血管平滑肌细胞经锥虫蓝染色,存活细胞数在98%以上。形态学上出现典型的“峰和谷”样生长状态,抗平滑肌特异α-肌动蛋白免疫组织化学染色阳性。取3～8代细胞用于实验。②观察项目:转染前后细胞增殖能力和细胞凋亡能力的检测应用流式细胞分析仪和脱氧核糖核酸末端转移酶介导的缺口末端标记法凋亡检测试剂盒完成。smad4的表达及部分与细胞周期调控相关基因(p16、细胞周期调控激酶4和细胞周期因子E)和细胞凋亡基因(半胱天冬酶2和半胱天冬酶3)表达变化应用免疫印迹法和荧光免疫组化方法检测。结果:①转染前后细胞增殖能力和细胞凋亡能力流式细胞分析仪和脱氧核糖核酸末端转移酶介导的缺口末端标记法测定结果:smad4基因过表达调控人血管平滑肌细胞增殖能力下降DNA合成前期细胞明显增加[(72.33±4.35)%],正常培养细胞DNA合成前期细胞数相对较少[(45.88±1.58)%]。②smad4的表达及部分与细胞周期调控相关基因免疫印迹法和荧光免疫组化方法检测结果:转染后细胞凋亡能力增加;细胞周期抑制基因p16表达增加,细胞周期调控激酶4和细胞周期因子E表达下降,凋亡相关基因半胱天冬酶2和半胱天冬酶3表达增加。结论:smad4基因对血管平滑肌细胞增殖能力的抑制作用主要通过抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡的发生而实现。转化生长因子β信号传导通路对血管平滑肌细胞增殖的抑制作用除了能够有效阻滞细胞周期的演进外,还能够诱导细胞凋亡。     

腺病毒介导的NDRG2基因对前列腺癌细胞株DU145的影响

目的:探讨腺病毒介导的N-myc下游调节基因2(NDRG2)基因对前列腺癌细胞株DU145增殖抑制及诱导其凋亡的作用.方法:以携带人NDRG2基因的腺病毒载体转染体外培养的前列腺癌细胞株DU145.采用westernblot检测目的基因的表达,通过细胞生长实验、平板克隆实验检测NDRG2对DU145细胞增殖能力的影响.流式细胞仪检测转染前后细胞凋亡的情况:光镜观察细胞形态学的改变.结果:DU145细胞经腺病毒转染后westernblot检测有NDRG2蛋白(40 kD)特异表达.MTT比色及平板克隆实验结果显示NDRG2对DU145细胞生长有明显抑制作用(P<0.05).流式细胞检测结果显示Ad-NDRG2组凋亡率明显高于对照组及Ad-LacZ组,差异有显著性(P<0.05).与对照组及Ad-LacZ组比较,光镜下观察可见Ad-NDRG2转染的细胞生长状态明显变差,细胞变圆,边缘模糊.结论:通过腺病毒载体使细胞表达NDRG2基因,可以明显抑制DU145细胞的生长和增殖,并可诱导细胞凋亡.     

支架涂层材料对血管平滑肌的影响

[目的]探讨支架涂层材料对血管平滑肌的影响.[方法]以SD大鼠主动脉血管平滑肌细胞为载体,采用MTT试验检测苯乙烯丁烯共聚物及多聚乳酸涂层材料对血管平滑肌细胞的增殖能力的影响,流式细胞仪检测细胞周期.[结果]随着培养天数增加,苯乙烯丁烯共聚物组和多聚乳酸组平滑肌细胞数量都呈递增趋势;相同时间内苯乙烯丁烯共聚物组和多聚乳酸组细胞数量显著低于对照组(P<0.05),但苯乙烯丁烯共聚物组与多聚乳酸组差异无显著性(P>0.05);与对照组相比,苯乙烯丁烯共聚物及多聚乳酸组细胞周期均有不同程度变化,主要表现为G0/G1期细胞数显著高于对照组,S期、G2/M期细胞数显著低于对照组,差异具有统计学意义(P<0.05),苯乙烯丁烯共聚物组与多聚乳酸组比较差异无统计学意义(P>0.05).[结论]苯乙烯丁烯共聚物及多聚乳酸可能通过抑制细胞周期中的第1个调控点(G1→S限制点)抑制主动脉血管平滑肌细胞增殖,两种涂层材料之间无明显差异.     

鼠胎肝干细胞生物学特性与人端粒酶反转录酶基因介导的影响

背景:研究表明,感染人端粒酶反转录酶基因后的干细胞具有稳定表达高水平端粒酶活性,且能使细胞增殖旺盛,这为建立基因工程的永生化干细胞系奠定了基础。目的:探讨人端粒酶反转录酶基因感染对体外培养鼠胎肝干细胞增殖及细胞周期的影响。方法:体外培养鼠胎肝干细胞,经重组腺相关病毒作为载体介导人端粒酶反转录酶基因感染,用RT-PCR、Western blot检测鼠胎肝干细胞人端粒酶反转录酶基因和蛋白的表达,CCK-8法、细胞生长曲线检测细胞生长增殖情况,流式细胞仪测定细胞周期分布的变化。结果与结论:与对照组、空载病毒组相比,基因感染组人端粒酶反转录酶基因和蛋白水平均有表达,细胞的生长速度明显增快,G0/G1期细胞减少,S期细胞数增多。结果表明以重组腺相关病毒作为载体介导人端粒酶反转录酶基因感染能促进体外培养的鼠胎肝干细胞增殖,对其培养有优化作用。     

肺癌肿瘤抑制物1转染HepG2肝癌细胞及作用

目的将已构建完成的携带增强绿色荧光蛋白基因的TSLC1真核表达载体转染到HepG2细胞中,同时观察其对HepG2肝癌细胞的作用。方法脂质体Lipofectamine2000介导重组载体转染到HepG2肝癌细胞中,经G418筛选建立稳定转染细胞株,分别采用RT-PCR、免疫组化法和westernblot法检测其表达;MaT检测细胞增殖活力,流式细胞仪分析细胞周期。结果与对照组比较,RT．PCR方法可见转染组细胞TSLC1mRNA表达明显增多,免疫组化和westernblot方法可见转染组细胞TSLC1蛋白表达明显增高;MTT检测发现转染组细胞生长缓慢,细胞周期检测发现转染组G0／G1期细胞显著增多,而S期及G2／M细胞明显降低。结论本研究成功建立了稳定转染TSLC1的HepG2细胞株,并证实喃LC1能够抑制细胞生长、阻滞细胞周期。     

Adenovirus-mediated over-expression of the cyclin/cyclin-dependent kinase inhibitor, p21 inhibits vascular smooth muscle cell proliferation and neointima formation in the rat carotid artery model of balloon angioplasty.

Vascular smooth muscle cell (VSMC) proliferation after arterial injury is important in the pathogenesis of a number of vascular proliferative disorders, including atherosclerosis and restenosis after balloon angioplasty. Thus, a better understanding of the molecular mechanisms underlying VSMC proliferation in response to arterial injury would have important therapeutic implications for patients with atherosclerotic vascular disease. The p21 protein is a negative regulator of mammalian cell cycle progression that functions both by inhibiting cyclin dependent kinases (CDKs) required for the initiation of S phase, and by binding to and inhibiting the DNA polymerase delta co-factor, proliferating cell nuclear antigen (PCNA). In this report, we show that adenovirus-mediated over-expression of human p21 inhibits growth factor-stimulated VSMC proliferation in vitro by efficiently arresting VSMCs in the G1 phase of the cell cycle. This p21-associated cell cycle arrest is associated both with significant inhibition of the phosphorylation of the retinoblastoma gene product (Rb) and with the formation of complexes between p21 and PCNA in VSMCs. In addition, we demonstrate that localized arterial infection with a p21-encoding adenovirus at the time of balloon angioplasty significantly reduced neointimal hyperplasia in the rat carotid artery model of restenosis. Taken together, these studies demonstrate the important role of p21 in regulating Rb phosphorylation and cell cycle progression in VSMC, and suggest a novel cytostatic gene therapy approach for restenosis and related vascular proliferative disorders.     

氧化低密度脂蛋白对血管平滑肌细胞早期凋亡的影响

目的：观察低密度脂蛋白(ox—LDL)对培养血管平滑肌细胞(VSMC)凋亡的影响，探讨ox—LDL致VSMC调亡的相关机制。方法：体外培养Wistar大鼠VSMC并确认细胞指数生长期，用苔盼蓝拒染计数方法观察ox—LDL刺激VSMC对增殖的影响，流式细胞分析检测ox—LDL刺激VSMC凋亡以及COx—2抑制剂NS—398对凋亡的影响。结果：体外培养的VSMC正常生长后，用35mg儿和50mg／Lox—LDL可使培养VSMC的生长期提前到12—24h，表现出明显细胞增殖；NS—398干预ox—LDL组VSMC增殖受到减弱。流式细胞分析ox—LDL组VSMC早期凋亡率较对照组明显增加，而NS—398、ox—LDL刺激VSMC凋亡阳性率亦较对照组明显增加。结论：ox—LDL刺激可使培养VSMC表现明显细胞增殖，虽NS—398可减弱VSMC的增殖，但却协同ox—LDL导致凋亡作用的增强。     

腺病毒载体介导肝细胞生长因子基因对血管平滑肌细胞的作用

目的：研究腺病毒载体介导肝细胞生长因子（HGF）基因感染血管平滑肌细胞后在缺氧和正常供氧时的细胞凋亡和迁移情况。方法：以肝细胞中抽提的总RNA为模板，反转录cDNA，采用逆转录-聚合酶链反应技术（RT-PCR）获得HGF基因，并引入酶切位点，转染大肠杆菌，筛选阳性菌落，经酶切及测序，转染腺病毒，经三轮扩增，制备高效表达HGF基因腺病毒载体（Ad-HGF），再感染人血管平滑肌细胞（VSMC）为观察组（Ad-HGF组）；未感染为阴性对照组（DMEM组）；以含人工合成HGF为阳性对照组（HGF组），分别在正常供氧和缺氧情况下观察细胞的凋亡和迁移情况。结果：与DMEM组及HGF组比较，Ad-HGF组在缺氧和正常供氧时VSMC的迁移率及凋亡细胞数差异均无显著性意义。结论：HGF基因感染VSMC后，在缺氧情况下并不促进VSMC的迁移。亦不抑制其凋亡。     

血管内皮损伤后血管平滑肌细胞增殖的机制

目的 探讨血管内皮损伤后血管平滑肌细胞增殖的机制。方法 建立颈动脉血管内皮损伤的大鼠模型，行光镜和电镜观察；采用免疫组织化学法检测增殖细胞核抗原（PCNA）、Ⅰ型胶原和Ⅳ型胶原；采用原位杂交法检测成纤维细胞生长因子（FGF）、血小板源生长因子（PDGF）、Bcl-2、Bax和c-myc的表达并行TUNEL染色。结果 内皮损伤后血管管腔面积减少，平滑肌细胞（VSMC）增殖并呈激活状态细胞凋亡减少。PCNA、Ⅰ型胶原、Ⅳ胶原、PDGF、FGF、Bcl-2和c-myc的表达增高。而Bax表达降低。结论 血管内皮损伤后血管平滑肌细胞的迁移、增殖、凋亡及细胞外基质的分泌和堆积，受到多种细胞因子、生长因子和基因调控的介导，参与了局部血管重建和再塑过程。     

Overexpression of CD39/nucleoside triphosphate diphosphohydrolase‐1 decreases smooth muscle cell proliferation and prevents neointima formation after angioplasty1

Summary. Background: Growing evidence implicates the involvement of extracellular nucleotides in the regulation of platelet, leukocyte, endothelial cell (EC) and vascular smooth muscle cell (VSMC) phenotype and function. Within the quiescent vasculature, extracellular nucleotides are rapidly hydrolyzed by CD39, the dominant endothelial nucleoside triphosphate diphosphohydrolase (NTPDase‐1). However, vascular CD39/NTPDase‐1 activity is lost in EC activated by oxidative stress or proinflammatory mediators, and upon denudation of the endothelium following balloon injury. The consequent increase in extracellular nucleotide concentrations triggers signaling events leading to prothrombotic responses and increased VSMC proliferation. Objectives: To investigate the effect of overexpressed CD39/NTPDase‐1 in injured aorta. Methods: Using adenoviral‐mediated gene transfer we expressed CD39/NTPDase‐1 in mechanically denudated rat aortas. We measured intima formation by morphometry and VSMC proliferation by the [³H]‐thymidine incorporation assay. Results: Targeted expression of CD39 in injured vessels increased NTPDase activity (from 2.91 ± 0.31 to 22.07 ± 6.7 nmols Pi mg^?1 protein, 4 days after exposure to the adenovirus) and prevented the formation of neointima. The thickness of the intimal layer in injured aortas exposed to Ad‐CD39 was 26.2 ± 3.9 μm vs. 51.8 ± 6.1 μm and 64.4 ± 22.2 μm (P < 0.001) in vessels treated with Ad‐β‐gal and saline, respectively. Moreover, targeted expression of CD39/NTPDase‐1 caused a 70% (P < 0.01) decrease in proliferation of VSMC isolated from transduced rat aortas as compared with VSMC derived from control vessels. Conclusions: The presented data suggest that increasing CD39/NTPDase‐1 activity in VSMC could represent a novel therapeutic approach for the prevention of stenosis associated with angioplasty and other occlusive vascular diseases.     

丹皮酚对血管平滑肌细胞增殖和迁移的影响及作用机制

目的 检测丹皮酚对于血管平滑肌细胞(VSMC)增殖和迁移的影响并探究其作用机制。方法 通过氧化修饰的低密度脂蛋白(ox-LDL)处理人VSMC在体外建立动脉粥样硬化的细胞模型。使用Western blot检测高迁移率族蛋白B1(HMGB1)的表达水平,HMGB1 mRNA的表达水平则由实时定量PCR法测定。应用酶联免疫吸附法测定细胞上清液中炎性因子肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-1β(IL-1β)和白介素-6(IL-6)的含量;应用CCK-8实验检测VSMC的增殖活性;应用Transwell细胞迁移实验检测VSMC的迁移能力。结果 丹皮酚显著降低ox-LDL导致的VSMC上清液中炎性因子TNF-α、IL-1β和IL-6的含量;丹皮酚显著减弱VSMC的增殖活性和迁移能力;丹皮酚下调HMGB1在蛋白质和mRNA上的表达水平,补充HMGB1可减弱丹皮酚对抗VSMC功能紊乱的作用。结论 丹皮酚通过下调HMGB1减轻ox-LDL导致的VSMC炎症反应,并因此抑制了VSMC的增殖和迁移,对动脉粥样硬化的发生、发展具有抑制作用。     

The Expression of Murine Double Minute 2 (MDM2) on Helicobacter pylori-Infected Intestinal Metaplasia and Gastric Cancer

The overexpression of murine double minute 2 (MDM2) is found in several human tumors, and increased expression of MDM2 inactivates the apoptotic and cell cycle arrest function of p53. Interleukin-16 (IL-16) is a pleiotrophic cytokine and the properties of IL-16 suggest that it involve in the pathophysiological process of chronic inflammatory diseases. In this study, we investigated the expression of MDM2 in intestinal metaplasia and gastric cancer as well as the effect of H. pylori infection and IL-16 on epithelial cell proliferation and MDM2 expression in gastric cells in vitro. The expression of MDM2 on gastric biopsies was studied immunohistochemistry. AGS cells were incubated with a combination of IL-16 and Helicobacter pylori (H. pylori). Gastric epithelial cell proliferation was studied by BrdU uptake and the expressions of MDM2 were studied by ELISA. There was no significant difference on the expression of MDM2 between with and without H. pylori infected chronic gastritis. In H. pylori infected gastric mucosa; the MDM2 expression was higher on intestinal metaplasia and gastric cancer than chronic gastritis. IL-16 administration was increased MDM2 expression and cell proliferation on AGS cells, which was decreased by H. pylori infection. In conclusion, the expression of MDM2 in long-term H. pylori infected gastric mucosa may indicate a risk for carcinogenesis. IL-16 secretion in H. pylori infected mucosa is one of the factors for gastric cancer. The expression of MDM2 on mucosa can be a mediator for gastric cancer.     

腺病毒介导白细胞介素-10基因转染抑制血管平滑肌细胞的增殖及机制

目的：观察白细胞介素（interleukin，IL-10基因转染对血管平滑肌细胞增殖的影响，初步研究其相关机制。方法：不同感染复数（multiplicity of infection，MOI）的IL-10重组腺病毒（Ad／IL-10）转染原代培养的人脐带动脉平滑肌细胞（HUASMcs），用酶联免疫吸附试验检测培养上清中IL-10的表达，噻唑蓝法测定吸光度值（OD570值），绘制细胞生长曲线，流式细胞术分析细胞周期、细胞凋亡，实时荧光定量聚合酶链反应检测p21的表达。结果：MOI=100时培养上清中IL-10含量最高，为5．746ng／ml；转染72h、96h，MOI为100、150、200组与MOI为10、20组及空白对照组比较，显著抑制HUASMCs的增殖（P〈0．01）；与空白及空载体转染对照组比较，MOI100的Ad／IL-10转染组的Gn-1期细胞数、凋亡细胞的平均百分数均显著增加（P〈0．01），p21基因表达的拷贝数较低。结论：MOI为100的Ad／IL-10可有效抑制HUASMCs的增殖，此作用与细胞周期阻滞和凋亡有关，为ID-10基因转染治疗血管内膜增生提供了理论依据。