结核杆菌抗原Rv0173的HLA-A*0201限制性CTL表位的预测及鉴定

目的 鉴定结核杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)抗原Rv0173中的HLA-A*0201限制性CTL表位.方法 应用数据库SYFPETTHI预测结核杆菌Rv0173中可能存在的HLA-A*0201限制性CTL表位,经流式细胞术分析各抗原肽与HLA-A*0201的亲合力,经时间分辨荧光法检测外周血单个核细胞(PBMCs)对各抗原肽产生的增殖反应,经细胞毒性实验研究各抗原肽诱导的特异性T细胞的细胞毒杀伤活性,逐步鉴定Rv0173的HLA-A*0201限制性CTL表位.结果 位于Rv0173氨基酸序列肽3(21-30aa)和抗原肽7(161-170aa)与HLA-A*0201分子具有较高的亲合力,并都能刺激HLA-A*0201阳性个体PBMCs增殖,并诱导产生特异性杀伤活性.结论 肽3(RLSQSADQYL)(21-30aa)和肽7(LLRGGGLVNL)(161-170aa)是抗原Rv0173上HLA-A*0201限制性CTL的优势表位,可作为结核疫苗设计的候选表位.     

隐球菌抗原MP98的HLA-A*0201限制性CD8+CTL表位的预测及鉴定

目的鉴定隐球菌抗原MP98中的HLA-A＊0201限制性CD8＋CTL表住。方法应用数据库SYFPEITHI预测隐球菌MP98中可能存在的HLA-A＊0201限制性CD8＋CTL表位，经流式细胞术分析各抗原肽与HLA-A＊0201的亲合力，经时间分辨荧光法检测外周血单个核细胞（PBMCs）对各抗原肽产生的增殖反应，经细胞毒性实验研究各抗原肽诱导的特异性T细胞的细胞毒杀伤活性，逐步鉴定MP98的HLA-A＊0201限制性CD8＋CTL表位。结果位于MP98氨基酸序列肽5（436-444aa）与HLA-A＊0201分子具有较高的亲合力，并都能刺激HLA-A＊0201阳性个体者PBMC增殖，并诱导产生具有特异性杀伤活性的CTL。结论肽5GMFDGLSGV（436-444aa）是MP98上HLA-A＊0201限制性CD8＋CTL的优势表位，可作为隐球菌疫苗设计的候选表位。     

组织相容性抗原-肽四聚体流式的细胞技术检测乙型肝炎患者特异性CD8+T细胞

目的　探讨组织相容性抗原 (HLA) 肽四聚体流式细胞技术检测乙型肝炎病毒特异性CD8 T细胞的临床应用价值。方法　采用HLA A2分子胞外段与乙型肝炎病毒 (HBV)核心表位肽core 18 2 7结合的HLA 肽四聚体 (Tetramer) ,设计流式细胞技术检测乙肝患者外周血中针对该肽段的特异性CD8 T细胞数量 ,以占总计数CD8 细胞数的百分比表示。结果　 11例HLA A2 的急性乙肝患者外周血特异性CD8 T细胞为 0 0 2 %～ 2 0 4 % ,中位数为 0 2 0 % ,16例HLA A2 的慢乙肝患者为<0 0 1%～ 0 6 5 % ,中位数为 0 0 5 % ,二组之间差有显著性 (P <0 0 1)。 15例HLA A2 正常对照组、13例HLA A2 -急性乙肝对照组和 19例HLA A2 -慢性乙肝对照组的特异性的CD8 T细胞均不超过0 0 2 %。结论　HLA 肽四聚体流式细胞技术能在体外直接检测HBV特异性的CD8 T细胞数量 ,其水平一定程度上反映了特异性CTL应答状况 ,且与乙肝的不同临床转归有关。     

HLA-A~*0201/WT1五聚体联合胞内IFNγ染色在检测白血病患者外周血WT1特异性T细胞中的应用

本研究探讨五聚体及胞内因子染色在定性定量检测抗原特异性T细胞中的应用价值。用RT-PCR方法检测受试者WT1表达水平;用HLA-A*0201/WT1五聚体及胞内IFNγ染色检测14例表达HLA-A*0201的白血病患者全相合移植前后及其供者外周血中的WT1特异性T细胞。结果表明:14例供者中2例有低水平WT1表达,白血病患者均有不同水平的WT1表达。14例供者均未检测到WT1+CD8+CTL和WT1+IFNγ+细胞;移植前14例患者中2例可检出WT1+CD8+CTL,3例检出WT1+IFNγ+细胞,二者间无明显差异(p=0.357),而移植后均可检出WT1+CD8+CTL和WT1+IFNγ+细胞,明显高于移植前(p值均0.01)。移植后大部分患者均在30天内检出WT1+CD8+CTL和WT1+IFNγ+细胞,但后者检出率高于前者(p=0.014)。14例患者中WT1+CD8+CTL峰值中位数为0.18%,而WT1+IFNγ+细胞峰值中位数为0.83%,明显高于前者(p=0.005);WT1+CD8+CTL峰值中位时间为移植后75天,WT1+IFNγ+细胞峰值中位时间为移植后105天,但二者间无明显差异(p=0.455)。结论:五聚体及胞内IFNγ染色能有效检测白血病患者外周血中白血病抗原特异性T细胞;两种方法联合检测有助于抗原特异性T细胞的准确定性定量检测。     

KLIANNTRV是结核抗原Ag85A的HLA-A*0201限制性CTL表位

目的鉴定结核杆菌抗原Ag85A的HLA-A*0201限制性CTL优势表位。方法采用数据库SYFPEITHI初步预测结核抗原Ag85A的HLA-A*0201限制性CTL表位;经流式细胞术分析抗原肽与HLA-A*0201的亲和力;经时间荧光分辨法检测患者外周血单个核细胞(PBMCs)对抗原肽的增殖反应;最后通过细胞毒实验逐步鉴定Ag85A的HLA-A*0201限制性CTL预测的表位。结果实验证明,预测的位于Ag85A氨基酸序列(242-250aa)的肽表位与HLA-A*0201具有较高的亲和力。结论筛选出的KLIANNTRV(242-250aa)是结核杆菌抗原Ag85A的HLA-A*0201限制性CTL优势表位。     

慢性HBV感染患者治疗前后外周血HBV特异CTL、HBV DNA、ALT比较

摘要：目的：比较慢性HBV感染患者抗病毒治疗前后外周血HBV特异性细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic lymphocyte,CTL）、HBV DNA、丙氨酸氨基转移酶（ALT)的变化,探讨其临床意义。 方法：收集118例慢性HBV感染患者、42例非病毒性肝病患者及100例体检健康者;用流式细胞法检测HLA-A2等位型及外周血特异性CTL,套式PCR法检测血清HBV DNA及ALT水平。 结果：治疗前慢性HBV感染者HLA-A2⁺细胞检出率为61.86%（73/118）,在个体化抗病毒治疗后,检出率降为30.51%（36/118）;与肝病对照组的14.29%（6/42）和健康人对照组的5.00%（5/100）比较,差异均有统计学意义（P均<0.05）。在慢性HBV感染者治疗后HBV特异CTL显著升高,HBV DNA及ALT显著降低（P均<0.05）。 结论：外周血HBV特异CTL、HBV DNA及ALT在慢性HBV感染患者抗病毒治疗前后有明显的变化,提示这些指标可用于判断治疗效果。     

慢性 HBV 感染患者特异性细胞免疫功能与病毒载量的关系研究

目的：探讨慢性乙型肝炎病毒（HBV ）感染患者特异性细胞免疫功能与病毒载量的关系。方法选择51例慢性乙型肝炎患者（A组）、43例乙型肝炎肝硬化患者（B组）和40例体检健康者（C组）外,采用流式细胞术检测人类白细胞抗原A2（HLA-A2）,采用 HLA-A2限制的 HBVcore18-27抗原表位肽五聚体（Pro5MHC）法检测Pro5MHC、CD8双阳性细胞[HBV特异性细胞毒性 T 淋巴细胞（CTL）],并比较不同 HBV DNA水平患者各指标检测结果。结果 A组、B组HLA-A2阳性率均明显高于C组（P＜0．05）。随着 HBV DNA水平的升高,HBV特异性CTL水平逐渐减低（P＜0．05）,但CD8＋细胞水平无明显变化（P＞0．05）。 HBV DNA水平大于105 copies／mL的患者,Pro5M HC／CD8＋水平明显低于 HBV DNA水平为103～105 copies／mL的患者以及HBV DNA水平小于103 copies／mL的患者（P＜0．05）。结论 HLA-A2是乙型肝炎肝硬化的易感基因之一。 HBV感染患者体内HBV特异性CTL水平随着病毒复制程度的升高而减低。Pro5M HC／CD8＋可作为判断病毒复制程度的客观指标。     

HLA-A Bw4表位与HIV-1病毒载量和CD+4T淋巴细胞计数关系的研究

目的 研究含Bw4表位的HLA-A抗原在HIV-1感染者疾病进展中的作用.方法 应用高分辨率人类白细胞抗原(HLA)分型方法对340例HIV-1感染者进行HLA-A和HLA-B位点的等位基因分型,确定Bw4表位的携带情况,分析HLA-A和HLA-B携带Bw4表位与感染者CD4+4T淋巴细胞计数和血浆病毒载量的关系.结果 与不携带Bw4者(0Bw4)(CD+4T淋巴细胞计数:中位数294个/μ1,病毒载量:中位数6.29×104拷贝/m1)相比,1Bw4-A基因型者和2Bw4-AA基因型者的CD+4T淋巴细胞计数水平(分别为307和308个/μ1)基本相当,而病毒载量(分别为1.53×105和2.68×105拷贝/ml)有增高趋势.与不携带Bw4表位的感染者相比,仅在HLA-B抗原中含Bw4表位的HIV-1感染者的CD+4T淋巴细胞计数(417:个/μ1)显著增高(P=0.013),而病毒载量(2.10×104拷贝/ml)显著降低(P=0.007).结论 含有Bw4表位的HLA-B抗原在HIV-1感染中具有延缓疾病进展的作用,而含有Bw4表位的HLA-A抗原对HIV-1感染者未见保护性作用.     

肾移植患者外周血人巨细胞病毒特异性CD8+T淋巴细胞频率及其γ干扰素分泌功能的初步研究

目的 研究肾移植患者外周血人巨细胞病毒(HCMV)特异性细胞毒T淋巴细胞(CTL)的频率及其γ干扰素(IFN-γ)分泌功能,以期探讨HCMV活化感染的免疫学机制.方法 选取HCMV血清学阳性的HLA-A*0201肾移植患者和健康对照者,将其分为3组:存在HCMV活化感染的肾移植组(9例)、无HCMV活化感染的肾移植组(29例)和健康对照组(54名);运用HLA-A2-NLVPMVATV-五聚体检测外周血中总的HCMV NLVPMVATV特异性CTL,同时以NLVPMVATV体外刺激PBMC,检测IFN-γ分泌性CTL.结果 在健康对照组、元HCMV活化感染的肾移植组和存在HCMV活化感染组中,HCMV特异性CTL频率中位数分别为1.19%(0～19.42%)、1.20%(0～18.40%)和3.2%(0.51%～18.90%),差异无统计学意义(H=5.34,P＞0.05);IFN-γ分泌细胞频率中位数分别为0.72%(0～0.70%),0.47%(0～5.61%)和0.67%(0.07%～4.00%),差异无统计学意义(H=0.58,P＞0.05),但HCMV特异性CTL中IFN-γ分泌细胞的比例分别为(60.18±19.16)%,(39.19±17.22)%和(20.02±13.26)%,组间比较差异有统计学意义(P＜0.01).结论 肾移植组外周血中HCMV NLVPMVATV特异性CTL频率较健康对照组并无降低,但其分泌IFN-γ的比例降低,出现HCMV活化感染组IFN-γ分泌CTL比例降低更为明显.HCMV特异性CTL的IFN-γ分泌功能受损可能是造成肾移植患者HCMV活化感染的因素之一.     

负载人恶性黑素瘤相关抗原gp100抗原肽HLA-A*2402四聚体制备及鉴定

目的:构建负载人恶性黑素瘤相关抗原gp100抗原肽的HLA-A*2402四聚体并进行鉴定,为分析gp100抗原肽诱发的特异性细胞免疫应答创造条件。方法:以羧基端融合生物素化酶BirA底物肽的HLA-A*2402重链胞外域融合蛋白、人β2-微球蛋白、gp100 VYFFLPDHL抗原肽、PE-链亲和素为材料,制备HLA-A*2402/VYF四聚体;非还原SDS-PAGE鉴定四聚体四聚化程度;三色免疫荧光标记流式细胞术分析HLA-A*2402+健康志愿者外周血gp100特异性CD8+T细胞的频率。结果:HLA-A*2402/VYF四聚体形成率为83%,所制备的四聚体具有与HLA-A*2402+供者抗原特异性CD8+T细胞的结合活性,特异性CD8+T细胞的频率为外周血总CD8+T细胞的0.02%～0.06%。结论:成功制备HLA-A*2402/VYF四聚体并用于检测gp100特异性CD8+T细胞,为研究HLA-A*2402+黑素瘤患者免疫治疗的机制及疗效监测创造了条件。     

负载人恶性黑素瘤相关抗原gp100抗原肽HLA-A~*2402四聚体制备及鉴定

目的:构建负载人恶性黑素瘤相关抗原gp100抗原肽的HLA-A*2402四聚体并进行鉴定,为分析gp100抗原肽诱发的特异性细胞免疫应答创造条件。方法:以羧基端融合生物素化酶BirA底物肽的HLA-A*2402重链胞外域融合蛋白、人β2-微球蛋白、gp100 VYFFLPDHL抗原肽、PE-链亲和素为材料,制备HLA-A*2402/VYF四聚体;非还原SDS-PAGE鉴定四聚体四聚化程度;三色免疫荧光标记流式细胞术分析HLA-A*2402+健康志愿者外周血gp100特异性CD8+T细胞的频率。结果:HLA-A*2402/VYF四聚体形成率为83%,所制备的四聚体具有与HLA-A*2402+供者抗原特异性CD8+T细胞的结合活性,特异性CD8+T细胞的频率为外周血总CD8+T细胞的0.02%～0.06%。结论:成功制备HLA-A*2402/VYF四聚体并用于检测gp100特异性CD8+T细胞,为研究HLA-A*2402+黑素瘤患者免疫治疗的机制及疗效监测创造了条件。     

应用免疫球蛋白重链可变区上框架区来源的抗原九肽获得的细胞毒T细胞功能分析

目的明确存B淋巴细胞肿瘤表面的免疫球蛋白重链可变区(IgHV)的框架区(FR)上是否存在可以激发细胞毒T淋巴细胞(CTL)的抗原表位，这些来源于FR的抗原肽是否能够激发家族特异性的免疫反应，探讨按照B淋巴细胞肿瘤的IgHV基因分型进行家族性的免疫治疗的可能性，方法利用生物信息学系统预测了40例B淋巴细胞肿瘤表面的免疫球蛋白序列的抗原表位，人工合成不同基因家族的抗原几肽，利用1、2细胞结合实验检测预测的抗原肽和HLA分子的亲合力利用体外CTL刺激扩增体系。诱导特异性的CTL细胞增殖，用肽／HLA四聚体检测特异性CTL的数目，应用LDH释放实验检测CTL的细胞毒活性并验证其家族特异性。结果在B淋巴细胞肿瘤的7个IgHV基因家族中找到了12个高亲和力的抗原九肽，其中10个(83％)位于FR，以HLA-A*0201正常供的外周血单个核细胞(PBMNC)负荷该九肽作为抗原呈递细胞去刺激自身PBMNC，经过4轮刺激，CD8和肽／HLA四聚体双阳性细胞从0．38％上升到49．38％LDH释放实验证明对HLA—A*0201( )、IgHV1( )靶细胞有明显的杀伤作用，并且被IgHV1肽刺激出的CTL不能识别负荷IgHV3肽的靶细胞：结论IgHV基因FR抗原儿肽可以刺激产生具有HLA限制性的并且肽特异性的CTL，同时这样的杀伤作用具有家族特异性，以此为靶位有望对B淋巴细胞肿瘤进行家族特异性的免疫治疗。     

慢性乙型肝炎患者外周血抗原特异性CD8~+T细胞功能的初步分析

目的评价慢性乙型肝炎(CHB)患者外周血抗原特异性CD8+T细胞的功能及与临床相关指标的关系。方法采用主要组织相容性复合物(MHC)-抗原肽四聚体标记技术检测CHB患者外周血乙型肝炎病毒(HBV)抗原特异性CD8+T细胞,并对其细胞因子分泌能力进行检测,分析其与临床生化和病毒学指标的关系。结果 35例人类白细胞相关抗原(HLA)-A基因型为A02或A24的患者中有9例患者至少检出1种被四聚体识别的HBV抗原特异性CD8+T细胞,其白细胞介素2(IL-2)和γ干扰素(IFN-γ)的分泌能力明显低于其自身的外周血总CD8+T细胞。检出抗原特异性CD8+T细胞患者的血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)水平明显高于阴性患者,而HBV DNA水平低于阴性患者。结论 CHB患者外周血抗原特异性CD8+T细胞存在明显的功能缺陷,可能因病毒抗原持续刺激造成功能耗竭,但外周血出现抗原特异性CD8+T细胞仍表明患者体内出现较强抗病毒免疫反应。     

免疫球蛋白重链框架区九肽诱导抗急性B淋巴细胞白血病的细胞毒T细胞应答

目的 用免疫球蛋白(Ig)重链框架区几肽体外诱导抗急性B淋巴细胞白血病(B-ALL)的细胞毒T细胞应答。方法 合成Ig重链可变区第1家族框架区3～11位置上的九肽QLVQSGAEV(IgHV13-11)，进行T2细胞结合实验。IgHV13-11负荷抗原呈递细胞(APC)，体外刺激HLA-A*0201正常外周血单个核细胞(PBMNC)，每周1次，共3次：HLA-A*0201／IgHV13-11四聚体监测培养细胞中IgHV1-311特异性CD8^ T细胞的增殖。对B-ALL初治患儿的7个IgHV基凶家族进行PCR扩增及PCR产物的测序，选IgHV1和IgHV3家族单等位基冈功能性重排克隆，并鉴定其HLA-A*0201位点。MTT比色法分析IgHV13-11，特异性CD8^ T细胞对HLA-A*0201^ IgHV1和IgHV3家族B-ALL细胞克隆的杀伤活性。结果 IgHV13-11可上调HLA-A*0201分子在T2细胞表面的表达1．63倍、HLA-A*0201*正常PBMNC中IgHV13-11特异性CD8^ T细胞的频率由2轮刺激后1．64％增至3轮刺激后82．57％。IgHV13-11特异性CD8^ T细胞在效靶细胞比(E：T)20：1时对IgHV1家族B-ALL细胞的杀伤率为18．24％，是IgHV3家族B-ALL细胞的1．8倍(P=0．01)。结论 体外诱导的Ig重链框架区九肽特异性CD8*T细胞可杀伤表达该肽的B-ALL细胞。     

非小细胞肺癌患者癌胚抗原特异性细胞毒T细胞与临床疗效的研究

目的 通过对HLA-A0201限制性的特异性细胞毒T细胞(CTL)分析,研究晚期非小细胞肺癌患者化疗不同疗效与T淋巴细胞对特异性抗原表位免疫应答的差异.方法 鉴定HLA-A0201阳性的晚期非小细胞肺癌患者13例(Ⅲb期6例,Ⅳ期7例);给予吉西他滨+顺铂方案化疗,收集化疗前患者的外周血单个核细胞,采用酶联免疫斑点试验测定针对癌胚抗原表位肽的特异性CTL的数量和功能.结果 晚期非小细胞肺癌化疗有效患者外周血癌胚抗原(CEA)多肽特异性CTL数量和功能明显高于晚期非小细胞肺癌化疗无效患者.结论 肺癌特异性表位的CTL应答,在不同化疗疗效患者的应答特征不同.化疗有效的患者特异性CTL应答水平显著高于疗效无效者,肺癌特异性CTL应答与临床疗效有密切关系.肺癌特异性CTL在抑制肿瘤的过程中发挥着重要作用,这将有助于预测肺癌患者的临床转归和开拓肺癌的免疫治疗的新策略.     

MAGE-12的HLA-A2限制性CTL表位肽预测及其三维结构构建

目的从理论上分析、预测黑色素瘤抗原(MAGE)-12的人类白细胞抗原(HLA)-A2限制性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)表位肽,并构建其三维结构。方法以肿瘤特异性抗原MAGE-12为研究目标,采用超基序法、量化基序法、多项式法、延展基序法与三维结构构建相结合的CTL表位预测方法。结果预测出的MAGE-12的表位中有4个符合HLA-A2限制性CTL表位要求。结论预测出的4个HLA-A2限制性CTL表位为MAGE-12的表位的可能性较大,经后续实验筛选、鉴定后,可用于基于MAGE-12的肿瘤治疗性多肽疫苗的设计研究。     

阿德福韦酯治疗慢性乙型肝炎HBeAg血清学转换与HBV特异性细胞免疫的关系

目的探讨阿德福韦酯治疗慢性乙型肝炎(CHB)患者发生HBeAg血清学转换与HBV特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的关系。方法 80例CHB患者HBV DNA阳性(HBV DNA≥1×104拷贝/ml),HBeAg阳性50例(62.5%)、丙氨酸转氨酶(ALT)>2×正常值上限(ULN)、人白细胞抗原(HLA)-A2阳性,用阿德福韦酯10mg,口服,每日1次。观察治疗12个月后HBeAg血清学转换与HBV特异性CTL的关系。结果阿德福韦酯治疗12个月后,HBV特异性CTL[(0.68±0.11)%]高于治疗前[(0.34±0.10)%,t=8.58,P<0.01],HBV DNA(3.01±0.25)log10拷贝/ml低于治疗前[(6.25±0.70)log10拷贝/ml,t=12.62,P<0.01],HBV DNA转阴(<500拷贝/ml)48例(60%)。HBeAg阳性50例中发生HBeAg转阴14例(28%),HBeAg血清学转换9例(18%),HBeAg血清学转换者HBV特异性CTL[(0.86±0.05)%]高于无HBeAg血清学转换者(41例,82%)的HBV特异性CTL[(0.60±0.07)%,t=8.63,P<0.01]。结论阿德福韦酯能提高CHB患者的HBV特异性细胞免疫功能,治疗后HBeAg血清学转换的发生与HBV特异性CTL水平升高有关。     

慢性HBV感染者外周血T细胞CD127的表达与IL-7及HBV载量的相关性

目的通过检测HBV感染者外周血T淋巴细胞表面CD127(IL-7受体)的表达,探讨其与HBV载量及疾病进程的相关性。方法选取125名HBV感染者及40名健康人对照,用流式细胞术检测外周血T细胞表面CD127的表达,ELISA法检测血浆IL-7浓度,实时荧光定量PCR法检测HBV DNA并进行分析。结果HBV感染者外周血CD4+、CD8+T淋巴细胞表面CD127的表达分别为(84.59±5.69)%和(38.45±3.03)%,其中CD8+T淋巴细胞表面CD127的表达明显低于健康对照组(P<0.01);慢性乙肝组外周血CD8+T淋巴细胞表面CD127的表达明显高于慢性重型乙肝组(P<0.05);HBV感染者血浆中IL-7水平明显高于健康对照组,且与CD8+T淋巴细胞表面CD127的表达呈负相关(r=-0.341,P<0.05);HBV病毒载量的对数值与外周血T淋巴细胞表面CD127的表达之间存在负相关(r=-0.432,P<0.01)。结论HBV感染者外周血T淋巴细胞表面CD127的表达水平与疾病进展明显相关。     

Eps8抗原HLA-A* 0201限制性CTL表位的预测和鉴定

目的:寻找并鉴定肿瘤相关抗原Eps8来源的HLA-A*0201限制性CTL表位,为临床开展基于Eps8表位的特异性免疫治疗奠定基础。方法:通过在线生物学软件从C-末端酶切位点、MHC-I类分子结合力及TAP转运效率3个方面初步预测Eps8抗原的HLA-A*0201限制性CTL表位,通过肽/MHC分子结合力及肽/MHC分子复合物稳定性实验初步验证预测结果,利用酶联免疫斑点检测(enzyme-linked immuospot assay,ELISPOT)方法检测候选表位刺激健康志愿者外周血单个核细胞(PBMNC)分泌IFN-γ的能力,以及LDH细胞毒实验验证其体外杀伤肿瘤细胞的功能,最后在HLA-A*0201/Kb转基因小鼠中检测候选表位的体内免疫功能。结果:通过在线生物学软件筛选得到4个候选表位。结合力实验结果显示,p360-368具有高结合力,p101-109、p276-284具有中等结合力。稳定性实验结果显示,该3个表位的DC50均大于8 h。LDH细胞毒实验中p101-109、p276-284、p360-368都能诱导产生特异性CTL,对靶细胞具有显著的杀伤效应,还能提高效应细胞分泌IFN-γ的水平。在HLA-A*0201/Kb转基因小鼠体内免疫功能检测中同样证实该Eps8抗原表位能产生强烈的免疫应答。结论:天然表位p101-109、p276-284、p360-368可能是Eps8抗原HLA-A*0201限制性CTL表位。     

汉滩病毒核蛋白HLA-A*02限制性CTL表位的预测及实验鉴定

目的:采用人工神经网络模型及在线软件BIMAS和SYFPEITHI共同预测汉滩病毒核蛋白HLA-A)02限制的CTL表位,并对CTL表位进行实验鉴定。方法:①选取2004-11解放军第四军医大学唐都医院住院的肾综合征出血热患者1例,汉滩病毒特异性IgM抗体为阳性。无菌抽取肾综合征出血热患者外周血,分离外周血单个核细胞,液氮冻存备用。②采用JavaNNS软件模拟神经系统对信息的处理过程,建立人工神经网络模型。训练人工神经网络的9肽包括584种HLA-A)02结合肽和130种HLA-A)02非结合肽,随机数字表法分为3部分:80%为训练肽(用来训练模型,使其学习其中隐含的规律),10%为确认肽(防止训练过度,使训练在适当的时候终止),10%为试验肽(对训练好的模型进行初步的评价)。无、低、中、高亲和力9肽训练人工神经网络的输出值分别为0.1,0.4,0.6,0.8。因此,人工神经网络模型的默认阈值为0.4。此外,还应用在线软件BIMAS和SYFPEITHI,共同预测汉滩病毒核蛋白的CTL表位。③采用ELISPOT鉴定汉滩病毒核蛋白特异的HLA-A)02限制的CTL表位。结果:①人工神经网络、BIMAS和SYFPEITHI预测的准确度:3种方法预测的灵敏度分别达到0.89,0.78,0.97,特异性分别为0.90,0.87,0.20。三者共同预测到23个汉滩病毒核蛋白特异的CTL表位。②HLA-A)02限制的CTL表位的实验鉴定:在可刺激肾综合征出血热患者外周血单个核细胞产生阳性反应的3条15肽中,预测到了4个HLA-A)02限制的CTL表位。经ELISPOT实验证实,其中的2种9肽可刺激HLA-A)02阳性的肾综合征出血热患者外周血单个核细胞分泌γ干扰素。结论:肾综合征出血热患者中存在着汉滩病毒特异的CTL应答。汉滩病毒核蛋白CTL表位的有效预测,大幅度减少了合成候选9肽的数量,降低了成本。为肾综合征出血热细胞免疫应答的研究以及多肽疫苗的设计,奠定了重要基础。