一种定量PCR检测乙肝标记物假阴性的应对方法

【目的】了解定量PCR检测乙肝HBsAg(+)、HBeAg(+)及抗HBcAg(+)患者血清样本阴性结果中,采用不同厂家试剂盒对检测结果的影响。【方法】将定量PCR检测阴性患者血清样本用另一公司试剂进行检测。【结果】15例乙肝患者血清样本中有4例定量PCR检测结果小于1.0E+03copies/ml,被判为阴性结果;经换用其他试剂盒并重新检测后定量结果分别为2.8×103、1.9×104、1.1×105、1.2×106copies/ml,均为阳性结果。【结论】不同厂家检测试剂盒可能会对定量PCR的检测结果产生影响。     

超声引导经皮肾穿刺造瘘术（附47例报告）

【目的】观察经皮肾穿刺造瘘的可靠性及安全性,对比一步法及二步法肾盂造瘘的优劣。【方法】对47例恶性肿瘤导致梗阻性肾功能不全的患者,在超声引导下进行经皮肾穿刺造瘘,观察肾功恢复情况及并发症。【结果】45例首次置管造瘘成功,2例首次行二步法置管失败,再以一步法置管成功,2例引流过程中造瘘管脱落。所有病例术后肾功能均得到改善,未出现肾周血肿、大量血尿、感染等并发症。【结论】超声引导经皮肾穿刺造瘘术是解决恶性肿瘤导致的肾后性肾功能不全安全有效的方法,一步法较二步法更简便,成功率更高。     

基于高通量测序下低拷贝乙型肝炎病毒检测方法的应用分析

目的建立一种针对临床低拷贝乙型肝炎病毒(HBV)的检测方法。方法选取2017年1-10月该院收治的乙型肝炎患者30例作为研究对象。采集患者血清样本进行HBV病毒基因组提取,通过HBV DNA定量检测试剂盒[聚合酶链反应(PCR)荧光探针法]对HBV DNA样本进行定量检测。选择HBV4×103 copy/mL的病毒DNA 6例,分别进行全基因组一步法建库及巢式PCR扩增法建库。采用Illumina Miseq平台对构建好的文库进行测序。通过生物信息学方法对所得数据进行分析。结果与HBV B型参考基因组比对,全基因组一步法建库匹配率很低,且数据产量低。巢式PCR扩增法建库匹配率达75.61%,且样本覆盖率及测序深度较好。6例低拷贝HBV样本共发现29个宿主内iSNV,且存在15个低频突变。结论巢式PCR扩增HBV全基因组建库进行高通量测序可用于低拷贝HBV的检测,且能发现低频突变。     

两种方法检验腹泻粪便中小肠结肠炎耶尔森菌的结果比较

【目的】探讨两种不同方法检验腹泻患者粪便中小肠结肠炎耶尔森菌的价值。【方法】以本院收治的327例腹泻患者为研究对象，采集患者新鲜粪便样本，分别采用培养法和反转录‐聚合酶链反应法（RT‐PCR）检测患者粪便样本中小肠结肠炎耶尔森菌感染情况，对比两种方法对小肠结肠炎耶尔森菌的检出率。【结果】培养法对小肠结肠炎耶尔森菌的检出率为7．65％（25／327），RT‐PCR 法为11．01％（36／327），RT‐PCR法明显高于培养法，两者相比较差异具有显著性（ P ＜0．05）。【结论】与培养法比较，RT‐PCR 法对腹泻患者小肠结肠炎耶尔森菌的检出率更高，值得临床推广应用。     

多种一步法快速提取DNA对肺炎支原体PCR检测的影响

目的 对比不同一步法提取DNA在肺炎支原体PCR检测中的效果及应用范围,为临床标本中肺炎支原体的检测提供依据。方法 以两种经典的DNA提取一步法（ROSE和Chelex-100法）及其优化方案和商品化DNA提取试剂盒,提取肺炎支原体纯培养菌株及30份肺炎支原体阳性临床咽拭子标本DNA,分别进行普通PCR和荧光PCR检测,对比不同方法提取的DNA对PCR检测结果的影响。结果 ROSE法和Chelex-100一步法中的SDS严重影响Taq酶活性,提取物稀释100倍方可进行荧光PCR扩增,稀释10倍可用于普通PCR扩增。改良的Chelex-100一步法提取肺炎支原体纯菌DNA产量最高,且PCR扩增效果最好。对于30份临床标本来说,试剂盒法、改良Chelex-100法和水煮法的阳性率分别为100.00%（30/30）、80.00%（24/30）和43.33%（13/30）,且对相同肺炎支原体阳性标本提取的DNA,试剂盒法检测的循环阈值（Ct值）比上述两种方法分别小1.95和2.38。结论 经典一步法提取的DNA必须经稀释后方可作为扩增模板。改良的Chelex-100法操作简便,可用于纯菌培养的DNA提取。临床标本中肺炎支原体DNA提取以试剂盒法最优,改良的Chelex-100法提取的DNA也可用于临床标本中肺炎支原体的检测,但不可用于定量分析。     

一步法实时荧光RT-PCR在快速检测甲型流感病毒中的应用

目的建立一种能快速检测甲型流感病毒的一步法实时荧光PCR方法,对样本进行准确检测。方法以甲型流感病毒特异M基因的保守区为靶区域设计特异引物和TaqMan荧光探针,建立一步法实时荧光RT-PCR方法,并对乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒Long株、冠状病毒OC43及229E、副流感病毒1、2、3型以及季节性流感病毒H1、H3进行检测,验证该方法的特异性和灵敏度,并对临床样本进行检测应用。结果所建立的一步法实时荧光RT-PCR可对甲型流感病毒进行特异扩增,操作方便快速,对H1和H3亚型的最低检出限可达0.01TCID50/ml;对384例临床咽拭子样本的检测准确度达99.5%。结论本研究建立的一步法实时荧光RT-PCR方法可实现对甲型流感病毒快速准确的检测,有助于对临床流感病例的快速诊断。     

单细胞二重巢式PCR诊断β地中海贫血

【目的】探讨单细胞水平诊断β地中海贫血(β-thalassemia)的可靠性,为开展β地中海贫血的胚胎植入前遗传学诊断(preimplantationgeneticdiagnosis,PGD)打下基础。【方法】采用二重巢式PCR并结合扩增特异的突变系统检测技术(amplificationrefractorymutationsystem,ARMS)扩增含有CD41-42突变位点的β地中海贫血患者的单淋巴细胞及正常人单淋巴细胞和单卵裂球的β-珠蛋白基因的5个常见突变位点(CD41-42、IVS-Ⅱ-654、CD17、CD71-72和nt.-28位点),扩增产物经过2%的琼脂糖凝胶电泳检测。【结果】患者的88个单淋巴细胞的扩增成功率为95.5%,等位基因脱扣的发生率为4.8%,诊断准确率为95.2%;正常人的41个单淋巴细胞的扩增成功率均为95.1%,假阳性率为0;正常人的34个单卵裂球细胞的PCR扩增成功率为88.2%;35管细胞洗脱液空白对照组假阳性扩增率为0。【结论】单细胞二重巢式PCR并结合ARMS技术诊断β地中海贫血是稳定的、可靠的,适用于β地中海贫血的PGD。     

大容量样本病毒浓缩HCV核酸检测方案的研究

目的对大容量样本中丙型肝炎病毒(HCV)进行浓缩提取,采用自行设计引物进行实时HCV荧光定量检测,验证病毒浓缩的效率以及病毒浓缩对检测的影响。方法采用PEG法高速离心进行病毒浓缩,一步法逆转录荧光定量PCR验证病毒浓缩效果。结果该方案用于HCV RNA检测,能得到良好的扩增曲线,不同病毒载量样本病毒浓缩的效率均在70%以上。结论大容量样本HCV病毒浓缩可提高病毒荧光PCR检测的灵敏度。     

人IFN-λ1-3型mRNA实时荧光定量PCR检测方法的建立

【目的】建立人IFN‐λ1‐3型mRNA实时荧光定量聚合酶链式反应（qRT‐PCR）检测方法。【方法】根据人IFN‐λ1‐3型mRNA的基因序列合成特异性引物及探针，用体外转录方法制备IFN‐λ1‐3型的mRNA标准品，建立人IFN‐λ1‐3型mRNA qRT‐PCR检测方法。【结果】IFN‐λ1‐3型RNA标准品与对应的CT 值有良好的线性关系；扩增效率均在90％～100％之间；灵敏度分别是：1×100 co pies／μL、1×101 co pies／μL、1×101 co pies／μL ；变异系数均小于2％；各型间交叉反应不明显。【结论】本研究建立的IFN‐λ1‐3型mRNA qRT‐PCR检测方法灵敏度高，具有良好的重复性及特异性。     

细菌性阴道病实验室诊断方法的比较

【目的】比较细菌性阴道病的4种实验室诊断方法。【方法】随机选择就诊病人100例分别用Amsel法,组织多胺试验．一步法唾液酸酶活性的检测试验,革兰染色细菌评分法检测细菌性阴道病。【结果】Amsel法阳性率28％,组织多胺试验阳性率24％,一步法唾液酸酶活性的检测试验阳性率34％,革兰染色细菌评分法阳性率30％;唾液酸酶活性检测法与Amsel法,革兰染色细菌评分法相比较差异无显著性;组织多胺试验与Amsel法,革兰染色细菌评分法相比较差异无显著性;以Amsel法为标准,一步法唾液酸酶活性检测法和组织多胺试验的灵敏度分别为92．9％和71．4％,特异性分别为88．9％和94．4％,阳性预期值分别为76．5％和83．3％,阴性预期值分别为97．0％和89．5％;以革兰染色细菌评分法为标准．一步法唾液酸酶活性检测法和组织多胺试验的灵敏度分别为93．8％和66．7％,特异性分别为92．1％和94．3％,阳性预期值都为83．3％,阴性预期值分别为97．2％和86．8％。【结论】一步法唾液酸酶活性的检测试验和组织多胺试验快速,简便,易于标准化,可以用于临床诊断细菌性阴道病。     

重组质粒pEGFP-N3-APC在结肠癌细胞株HT-29中的表达

【目的】构建含有APC蛋白功能区域的pEGFP-N3-APC重组质粒,转染结肠癌细胞HT-29,观察重组质粒的表达。【方法】设计引物分别扩增5条APC基因功能区域片段。将扩增片段与pEGFP-N3载体连接后挑取阳性克隆,行菌落PCR和测序鉴定。使用Lipofectamine 2000将重组质粒转染结肠癌细胞株HT-29,观察细胞中绿色荧光蛋白的表达。【结果】构建5条带有APC不同结构域重组真核表达载体pEGFP-N3-APC,重组真核表达载体转染HT-29细胞后,可观察到绿色荧光蛋白的表达。【结论】真核细胞表达载体pEGFP-N3-APC的成功构建,为进一步研究其在细胞内的功能提供了基础。     

扩增效率评价在荧光PCR外标法定量中的应用初探

[目的]了解扩增效率评价对现行定量PCR的外标定量法结果的影响。[方法]将两份HBV阳性血清样本梯度稀释4个梯度后PCR,建立血清样本的标准曲线。同时比较两份血清样本标准曲线以及与试剂盒标准品的标准曲线的差异,并利用E=10^-1slope公式计算不同样本及标准品的扩增效率。比较扩增效率评价前后外标法定量结果之间的差异。[结果]发现同一样本的扩增效率不同批次PCR扩增效率变化很小,然而不同样本之间扩增效率存在明显的差异。对扩增效率评价前后同一样本的定量分析的结果差异巨大,达到了93％。[结论]采用荧光PCR外标定量法对未知样本进行定量分析时应对其扩增效率进行评价。     

人EGFL7基因真核表达载体构建及鉴定

【目的】构建人类表皮生长因子域7（EGFL7）基因的真核表达载体。【方法】通过聚合酶链式反应（PCR）方法扩增EGFL7目的片段,利用基因重组技术构建pEGFPC1-EGFL7真核表达载体,并进行酶切和测序鉴定。鉴定正确的克隆瞬时转染293T细胞,通过Westernblot方法检测目的蛋白的表达。【结果】通过酶切和测序鉴定,pEGFBC1-EGFL7真核表达载体序列正确,编码框正确。转染后的293T细胞经Westernblot检测,能够表达目的蛋白。【结论】本方法成功构建了EGFL7真核过表达载体,为进一步研究其功能奠定了基础。     

快速筛选杂合性突变克隆

目的：建立一种快速、简便、可靠的筛选杂合性突变克隆的方法。方法：采用加热裂解，直接PCR扩增插入目的片段，并与常规酶切法相比较。结果：加热裂解，直接PCR扩增是一种快速、简便、行之有效的筛选鉴定方法，可节省时间和提高效率。     

两种肠道腺病毒基因型分型标本处理方法的比较

目的 通过对两种肠道腺病毒基因型分型方法进行比较,以寻找出简便快速的肠道腺病毒基因型分型方法.方法 采集114例非腹泻人群的粪便样本,方法一：在A549细胞中进行培养,提取病变细胞的DNA进行PCR扩增,然后克隆、测序,确定病毒基因型;方法二：直接提取粪便悬液过滤上清DNA进行巢式PCR扩增,对PCR阳性者进行克隆、测序以及基因型分型.结果 114份样本中,两种方法均有12份样本检出腺病毒,阳性率为10.5%（12/114）.序列分析显示,两种方法检出的腺病毒型别一致.这12份样本分别属于人腺病毒5型（3份）、7型（2份）、12型（3份）及48型（4份）.结论 虽然两种方法的敏感性、特异性一样,但方法二是直接提取粪便悬液过滤上清基因组DNA进行巢式.PCR扩增,而无需如方法一中所进行的3次体外病毒分离实验,节省了实验的时间及成本,因此值得推荐.     

NycoCardReaderⅡ型金标仪测定HbAlc方法学评价

【目的】评价NycoCardReaderⅡ型多功能全定量金标检测仪及其配套试剂盒检测糖化血红蛋白（HbAlc）的价值。【方法】依据厂家提供的操作流程，分别测定不同组别的HbAlc浓度并与乳胶免疫聚集抑制法比较，观察本方法的准确性、重复性和抗干扰性。【结果】此种方法优于其他方法，HbAlc的测定范围在3％～18％，变异系数（CV）在测定范围内低于5％。HbAlc正常组及增高组的血样本中加入一定量的胆红素、脂类，结果显示均无干扰。【结论】此种方法操作简便、快速、灵敏度高、重复性好，可作为反映糖尿病人病情控制的辅助诊断指标之一。     

两种巢式PCR检测慢性粒细胞白血病患者骨髓移植后微小残留病的比较

目的　比较 2种巢式聚合酶链反应 (PCR)检测骨髓移植后慢性粒细胞白血病 (CML)患者微小残留病。方法　分别用一步法逆转录 PCR(RT PCR)和两步法RT PCR 2种巢式PCR检测骨髓移植后CML患者BCR ABL融合基因 ,并做 2种方法的灵敏度实验。结果　 2种巢式PCR灵敏度实验中 ,一步法RT PCR和两步法RT PCR的巢式PCR可分别检测出 0 .1和 1pgK5 6 2细胞总RNA中的BCR ABL融合基因 ;同时对 19份来自 12例骨髓移植后CML患者标本检测 ,一步法RT PCR的巢式PCR检测出阳性的最长移植时间为 6 90d ;两步法RT PCR的巢式PCR为 4 15d。结论　一步法RT PCR的巢式PCR检测骨髓移植后CML微小残留病具有较高灵敏度 ,操作简便快速 ,特别适用于临床检测。     

类风湿关节炎外周血PBMC中MIP-1α和RANTES的表达

【目的】研究巨噬细胞炎症蛋白 1α(MIP 1α)和依赖激活正常T细胞表达分泌的调节蛋白(RANTES)在类风湿关节炎 (RA)患者外周血单个核细胞 (PBMC)中的mRNA水平的表达。探讨它们在RA发病机制中可能起的作用和与RA的疾病活动程度相关性。【方法】分别分离 32例RA、6例骨关节炎 (OA)以及 10例健康成人 (HC)的PBMC ,提取细胞总RNA ,行逆转录PCR ,将目的基因与内参照基因GAPDH共扩增。统计扩增的目的基因片段与内参照基因片段比值 ,并与RA患者疾病活动指标行相关性分析。【结果】RA、OA、HC各组PBMC标本MIP 1α与GAPDHRT PCR共扩增产物光密度比值与OA组、HC组比较均有显著性差异 ,P <0 .0 5。RA组PBMC标本RANTES与GAPDHRT PCR共扩增产物光密度比值与OA组、HC组比较无显著差异 ,P >0 .0 5。RA患者PBMC中MIP 1α和RANTESmRNA表达水平均与疾病活动性指标如病程、ESR、CRP、肿胀关节数、疼痛关节数、关节X线分期、RF滴度等未发现有相关性。【结论】趋化因子MIP 1α在RA患者PBMC中的mRNA表达水平高于OA和健康成年人 ,提示很可能在介导淋巴细胞从外周血进入炎症关节部位的过程中起着重要作用。     

蓝色橡皮疱痣综合征与TIE2基因突变的关系

【目的】探讨蓝色橡皮疱痣综合征（BRBNS）TIE2基因突变的关系。【方法】收集散发性BRBNS患者,采用PCR扩增和直接测序法,对其第9号染色体TIE2基因外显子进行测序。【结果】3例散发性BRBNS的TIE2基因检测,其中l例发现其TIE2基因的3号外显子79bp处存在C591T的杂合性碱基改变,对照正常人的TIE2,提示C591T的杂合性碱基改变为单核苷酸多态（SNP）;除C591T之外,在3例患者中未发现其他TIE2编码区突变。【结论】散发性BRBNS可能与TIE2基因突变无关。