L-精氨酸对人凝血因子Ⅷ基因表达的影响

目的研究L-精氨酸对人凝血因子Ⅷ（FⅧ）基因转录及表达的影响。方法将B结构域（氨基酸760～1639）缺失的人FⅧcDNA（BDDhFⅧcDNA）插入至质粒载体pcDNA6／V5-HisA，构建重组载体pcDNA6／V5-HisA-BDDhFⅧ，转染人脐静脉内皮细胞（HUVEC），加入L-精氨酸（终浓度10mmol／L）培养72h后，用ELISA方法检测细胞上清液中的人FⅧ抗原（FⅧ：Ag），一期凝血酶法检测FⅧ的促凝活性（FⅧ：C）。用Northern blot检测HUVEC中人FⅧ基因的转录。用PCR扩增BDDhFⅧcDNA的A1、A2、A3、C1和C2结构域基因，分别插入至pcDNA6／V5-HisA，构建五种载体pcDNA6／V5-HisA-BDDhFⅧ-A1、pcDNA6／V5-BDDhF Ⅷ-A2、pcDNA6／V5-HisA-BDDhF Ⅷ-A3、pcDNA6／V5-HisA-BDDhF Ⅷ-C1和pcDNA6／V5-HisA-BDDhF Ⅷ-C2，分别转染HUVEC后，加入L-精氨酸（终浓度10mmol／L）培养72h。膨胀裂解法分离细胞核，进行细胞核连缀（Run-on）反应，狭线印迹杂交检测A1、A2、A3、C1和C2结构域基因的转录。结果经L-精氨酸诱导后，HUVEC中人FⅧ基因表达明显增强[FⅧ：Ag为（146．08±4．78）ng／ml，10^6细胞诱导24h后FⅧ：C为（0．752±0．009）U／ml]，约是未经L-精氨酸诱导[FⅧ：Ag为（34．66±3．98）ng／ml，10^6细胞诱导24h后FⅧ：C为（0．171±0．006）U／ml]的4倍（P〈0．01）。Northern blot检测显示，加L-精氨酸培养之后，HUVEC中人BDDFⅧ mRNA的转录也较未加L-精氨酸显著增强，而只转染pcDNA6／V5-HisA的HUVEC中无人BDDFⅧ mRNA的转录存在。Run-on及狭线印迹杂交显示，加L-精氨酸培养后，A1和A2结构域基因的转录均较未经L-精氨酸诱导者明显增强，也显著强于A3、C1和C2结构域基因的转录，而A3、C1和C2结构域基因的转录在L-精氨酸诱导前后均无明显变化。结论L-精氨酸通过促进人FⅧ的A1和A2结构域基因的转录进而增强FⅧ在体外的转录和表达，因而在血友病A的基因治疗研究中，L-精氨酸是一个很有前途的诱导FⅧ转录和表达的物质。     

非病毒载体介导的人凝血因子Ⅷ基因在小鼠32D细胞系中的表达

为了观察非病毒载体 pRC/RSV介导的人凝血因子Ⅷ基因在小鼠 32D细胞系中的表达 ,将B结构域缺失(△ 76 0aa - 16 39aa)的人FⅧcDNA(hFⅧBDcDNA)亚克隆至质粒载体pRC/RSV ,构建重组质粒载体 pRC/RSV hFⅧBDcDNA。经SuperFectTransfectionReagent转染小鼠 32D细胞系 ,分别采用一期法、ELISA法和RT PCR检测细胞培养上清液中人FⅧ的促凝活性 (hFⅧ∶C)和抗原含量 (hFⅧ∶Ag)以及细胞中hFⅧBDcDNA的转录。结果表明 :小鼠 32D细胞系培养上清液中的人FⅧ∶Ag最高达到了 4 5 0 .0 8毫微克 /(10 6细胞·2 4小时 ) ,hFⅧ∶C最高达到了 2 .0 1单位 /(10 6细胞·2 4小时 ) ,RT PCR可检测到 32D细胞中hFⅧBDcDNA转录的mRNA。结论 :非病毒质粒载体 pRC/RSV介导的人凝血因子Ⅷ基因能够在小鼠 32D细胞系中表达人FⅧ蛋白 ,所表达的FⅧ与正常人血浆中的野生型FⅧ具有相似的凝血活性。     

腺病毒介导的B结构域缺失的人凝血因子Ⅷ在SD大鼠ADSC中的表达

目的:将一含B结构域缺失的人凝血因子Ⅷ的重组腺病毒载体体外转染SD大鼠脂肪干细胞(adipose tissue-derived stem cell, ADSC),为ADSC联合BDDhFⅧ基因治疗血友病A奠定实验基础。方法:取SD大鼠2侧腹股沟脂肪组织分离培养ADSC,传至第3代并进行鉴定;用重组腺病毒载体Ad-BDDhFⅧ-GFP体外感染第3代ADSC,实验分为Ad-BDDhFⅧ-GFP转染ADSC(A组)、Ad-GFP转染ADSC(B组)及未转染ADSC(C组)3组,采用CCK-8法检测3组感染后细胞增殖情况,ELISA法检测细胞上清中hFⅧ抗原表达水平,RT-PCR及Western blot分别检测感染后3组细胞内BDDhFⅧ基因和蛋白表达情况。结果:经鉴定分离培养的第3代细胞生长曲线呈倒"S"形;流式细胞术检测显示,第3代细胞CD29、CD90、CD44表达阳性、CD45表达阴性;经成脂及成骨诱导后可向成骨及成脂方向转化。CCK-8检测显示,转染后3组细胞的增殖未受影响。ELISA结果显示,转染后3组细胞在72 h A组hFⅧAg表达较B、C组明显升高(P 0.05)。RT-PCR结果显示,与A组相比,B、C组未见任何目的条带,无BDDhFⅧ目的基因表达;A组结果与扩增片段长度相符,有BDDhFⅧ目的基因表达。Western blot检测显示,A组hFⅧ蛋白表达水平较B、C组明显升高(P 0.05)。结论:重组腺病毒Ad-BDDhFⅧ-GFP在体外可高效转染大鼠ADSC,为血友病A的基因治疗奠定了实验基础。     

人结肠癌细胞中TGF-β1基因-509 C〉T单核苷酸多态性对启动转录活性的影响

目的探讨在人结肠癌细胞中转化生长因子β1（TGF-β1）基因上游启动子-509 C〉T位点多态性对其转录活性的影响。方法以特定-509 C〉T基因型患者DNA为模板,用聚合酶链反应（PCR）扩增得到1对长度为2.14 kb（-1 328~＋812）含有-509 C〉T变异的TGF-β1上游基因片段,并将其与不含启动子的pCAT3-enhancer报告基因载体重组,构建重组体phTGF 2.14C和phTGF 2.14T。用脂质体转染法将2种重组体分别转染至人结肠癌细胞（SW480和LoVo细胞）中,酶联免疫吸附试验（ELISA）测定转染细胞的报告基因CAT活性。结果在SW480和LoVo细胞中,转染重组体phTGF 2.14C细胞的CAT活性均明显高于转染重组体phTGF2.14T细胞的CAT活性（P〈0.05）。结论 -509位点C等位基因可明显增强TGF-β1基因上游调控序列的转录活性。     

血友病A基因治疗的初步实验研究

目的：制备血友病A的治疗基因，从in vivo途径观察人凝血因子Ⅷ（hFⅧ）在动物体内的表达。方法：将B区缺失（760－1639位氨基酸）的hFⅧcDNA克隆至真核细胞表达载体pRC/RSV，与传染试剂DOTAP－Cholesterol liposome混合，制备治疗基因pRC/RSV-hFⅧBD-DOTAP-Cholesterol。肌肉注射给BALB／c小鼠后，在第2，10，20，30，40，50天取小鼠的血液以及心、肝、脾、肺、肾、骨髂肌等组织。检测血浆中的hFⅧ抗原和抗体，用PCR和RT－PCR方法检测hFⅧBDcDNA在小鼠各组织基因组中的分布及其转录情况，免疫组织化学染色检测各组织中hFⅧ的表达。结果：在注射结束后的第48小时，小鼠血浆和组织中即有hFⅧ的表达，第10天血浆中的hFⅧ抗原水平最高。达17＝55ng/ml，以后逐渐下降，血浆中的hFⅧ抗体在注射结束后的第10天出现，以后缓慢升高，第50天时达37．06U/ml。PCR、RT－PCR检测和免疫组织化学染色显示小鼠各组中均有hFⅧBDcDNA的存在、转录和表达，但随着时间推移逐渐减少。脾、肺、肾脏中hFⅧBDcDNA的转录和表达时间均长于心脏、肝脏和骨骼肌。结论：由pRC/RSV-hFⅧBD与DOTAP－Cholesterol liposome结合而制备的治疗基因pRC/RSV-hFⅧBD-DOTAP-Cholesterol能够通过in vivo途径在动物体内很好地表达hFⅧ，这为临床基因治疗血友病A提供了实验依据。     

腺相关病毒包装条件优化及重组AAV8/hFⅧ基因治疗血友病A小鼠的实验研究

目的评价携带人凝血因子FⅧ(hFⅧ)的重组腺相关病毒(AAV)血清型8(AAV8/hFⅧ)病毒治疗血友病A(HA)小鼠效果。方法应用pAAV-CB-EGFP,pH22(AAV2血清型)和pfΔ6(腺病毒辅助质粒)摸索在HEK-293细胞中AAV的包装条件,pH22、pfΔ6及pAAV-CB-EGFP质粒按照1∶1∶1的比例进行转染,免疫荧光显微镜观察四个条件(包括10 cm培养皿转10μg质粒,20 cm培养皿分别转20、30和40μg质粒)的病毒包装效果。应用最佳包装条件在HEK-293细胞中包装AAV2-EGFP,通过冻融法获得AAV2粗提液,感染HEK-293细胞和16095细胞,应用荧光显微镜观察包装效果。应用最佳转染条件将pAAV-TTR-hFⅧ、pH28、pfΔ6按1∶1∶1的比例转染HEK-293细胞获得AAV8/hFⅧ,两轮的氯化铯梯度离心法纯化病毒,以8×10^12 vg/kg剂量经尾静脉注射HA小鼠进行基因治疗,活化部分凝血活酶时间(APTT)测定分析FⅧ的活性。结果20 cm培养皿转染20μg质粒的条件能够在24、48和72 h都达到最佳的转染效果,且该条件包装的AAV2粗提液在16095细胞中具有较高的感染率。HA小鼠体内AAV8/hFⅧ能够在注射后12周仍有维持在治疗水平的FⅧ活性。结论利用优化包装条件制备的AAV8/hFⅧ能够在HA小鼠体内有效维持治疗水平的FⅧ活性达12周。     

异丙酚对脂多糖诱导肺泡巨噬细胞高迁移率族蛋白B1启动子转录活性的影响

目的 探讨异丙酚对脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导肺泡巨噬细胞(alveolar maerophages,AM)高迁移率族蛋白B1(high mobility group box l protein,HMGB1)启动子转录激活的影响.方法 以基因重组技术将HMGB1启动子克隆入荧光素酶报告基因表达载体pGl3-Basic,得到重组质粒pGL3-HMGB1P,采用脂质体介导的转染技术将质粒转染AM细胞.根据转染质粒和施加刺激的不同分为以下各组:未转染组;转染pGL3-Basic组;转染pGL3-HMGB1P组;转染pGL3-HMGB1P+LPS(100 mg/L)刺激组;转染pGL3-HMGB1P+LPS(100 mg/L)+异丙酚(5 mg/L)处理组.通过检测荧光素酶活性米观察启动子活性变化,分别采用Western blot和RT-PCR方法检测细胞HMGB1蛋白和mRNA的表达.应用单因素方差分析进行不同组别问的比较.结果 酶切和测序结果证实重组体pGL3-HMGB1P构建止确,荧光素酶活性检测显永pGL3-HMGB1P在AM细胞中有效表达.与转染pGL3-HMGB1P组比较,转染pGL3-HMGB1P+LPS刺激组HMGB1启动子的转录活性(423±27),HMGB1蛋白(0.49±0.03)和mRNA(0.48±0.04)的表达均显著增加(P＜0.05);与转染pGL3-HMGB1P+LPS刺激组比较,转染pGL3-HMGB1P+LPS+异丙酚处理组HMGB1启动子的转录活性(207±13),HMGB1蛋白(0.17±0.02)和mRNA(0.13±0.02)的表达均显著降低(P＜0.05).结论 异丙酚在转录水平通过抑制LPS诱导HMGB1启动子的转录激活而影响HMGB1的表达.     

精子载体介导的人凝血因子Ⅷ基因在转基因小鼠体内的表达

利用精子载体技术通过人工授精观察人凝血因子Ⅷ基因在转基因小鼠体内的表达，将含有人FⅧBD（B-domain deleted)cDNA的质粒pRC/RSV-hFⅧBDl转染至小鼠精子，通过人工授精使母鼠受孕，新生小鼠出生后第4周，应用PCR筛查hFⅧBDcDNA阳性转基因幼鼠，取转有人FⅧBDcDNA幼鼠的血液检测血浆中的人FⅧ抗原和抗体，分别用Northern印迹和Western印迹检测脾，肝，肺和肾组织中人FⅧBDcDNA的转录和表达。结果发现，人工授精后20只受体母鼠7只受孕，共产下11只仔鼠，存活9只，PCR筛检出3只转有人FⅧBDcDNA的阳性鼠，3只阳性鼠血浆中的人FⅧ抗原量分别为8.65ng/ml,7.84ng/ml和8.44ng/ml，人FⅧ的抗体均为阴性。Northern印迹和Western印迹检测显示3只F1代阳性幼鼠的脾，肝，肺和肾组织中均有人FⅧBDcDNA的转录和表达。结论提示，利用精子载体法可以制备转有人凝血因子Ⅷ基因的转基因小鼠，并表达人FⅧ蛋白，这为用精子载体技术生产转基因动物并将之作为生物反应器生产人凝血因子Ⅷ提供了实验依据。     

人源载体pHrnF9介导的凝血因子Ⅸ基因在肠上皮sw480细胞中的表达

本研究探索肠上皮细胞和人源载体pHrnFⅨ用于血友病B基因治疗的可能性。用含人凝血因子Ⅸ（human coagulation factorⅨ，hFⅨ）基因的人源载体质粒pHrnF9转染肠上皮细胞sw480，用RT-PCR检测mRNA的转录，荧光显微镜观察转染效率，ELISA和一期法检测蛋白表达及凝血活性。结果表明：转染后的细胞中有hFⅨmRNA的转录；荧光显微镜观察到48小时转染效率最高；ELISA法测得转染后24小时细胞上清中的hFⅨ蛋白量为（11．34±0．23）ng／（10^6cells·24h），第48小时hFⅨ蛋白量最高，达（29．34±1．00）ng／（10^6cells·24h），转染后72小时降为（12．45±0．15）ng）／（10^6cells·24h）。一期法结果显示转染pHrnF9的sw480细胞分泌的FⅨ有凝血活性，48小时达峰值（6．07±0、17）％／10^6cells，第72小时降至（1．81±0．06）％／10^6cells。结论：肠上皮细胞sw480转染pHrnF9质粒后可表达有凝血活性的hFⅨ，肠上皮细胞有望成为血友病B基因治疗的靶细胞。     

维生素D受体多态性与肠道CYP3A4表达:维生素D受体基因突变在人群中分布有差异吗?

背景:研究表明,维生素D受体可以诱导肠道中CYP3A4的转录表达,维生素D受体基因的突变将涉及到它自身所翻译的蛋白改变,而其相应的下游靶基因的转录表达或功能亦可能会发生改变.目的:确定HT-29肠细胞中维生素D受体Fokl突变在对其下游靶基因CYP3A4转录的影响.方法:取肝胆管结石患者术中切除的肝脏组织,构建重组真核表达载体pcDNA3.1(-)B-myc/his h维生素D受体(野生型和Fok1突变型),利用瞬时转染技术和双荧光素酶报告基因分析系统在体外HT-29细胞中检测转染不同载体后的细胞在给予不同浓度(1,10,100 nmol/L)的药物1,25(OH)2VD3(维生素D受体的天然配体)处理后,CYP3A4的转录表达情况.结果与结论:将野生型和突变型维生素D受体质粒共转染于HT-29细胞中,在1,25(OH)2VD3孵育24 h后,3个浓度代表CYP3A4mRNA转录水平的荧光素酶活性数值分别与溶煤对照组和空载体对照组相比差异具有显著性意义(P<0.05),且转染Fok1突变型的细胞荧光素酶活性数值稍大于转染野生型的细胞荧光素酶活性数值,但两者间差异无显著性意义(P>0.05).维生素D受体Fok Ⅰ突变体对其下游靶基因的转录表达与维生素D受体野生型没有差异.提示在肠细胞中,维生素D通过维生素D受体诱导CYP3A4转录表达,但是维生素D受体Fokl突变体对CYP3A4的转录与野生型相比差异无显著性意义.     

SARA低表达对Activin A/Smads环路活性的影响

目的探讨下调Smad锚捉蛋白(SARA)表达对Activin A/Smads环路活性的影响。方法利用RNA干扰技术,设计靶向大鼠SARA基因的短发卡RNA(shRNA),瞬时转染激活素A(ActA)高表达的大鼠嗜铬细胞瘤PC12细胞。转染48h后倒置荧光显微镜观察转染效率,实时定量PCR、Western blot检测SARA基因的表达情况。对阳性转染组及阴性转染组细胞换液3h后,Western blot检测Smad3总蛋白及磷酸化蛋白的表达。结果靶向SARA基因的SARA-shRNA及对照NC-shRNA质粒的转染效率均超过70%。转染48h后,SARA基因转录及蛋白水平的表达显著降低。细胞换液3h后,与NC-shRNA组比较SARA-shRNA组Smad3总蛋白及磷酸化蛋白下调44%和57%。结论 SARA基因低表达下调ActA/Smads环路活性。     

pGL3-Claudin-1 promoter荧光素酶报告基因质粒的构建及其功能鉴定

背景:Claudin-1是一种多功能蛋白,除了组成紧密连接封闭细胞间隙,它在转录水平的表达失调可能作为一种分子标志反映到恶性肿瘤的侵袭转移和预后中。目的:构建重组大鼠重组Claudin-1萤光素酶报告基因质粒。方法:设计和合成包含5’非转录区的约2000bp的脱氧核糖核酸链,经过限制性内切酶KpnⅠ和MluⅠ酶切后插入到pGL3-Basic载体中,并用感受态E.coliDH5α和Pmd18-T-simple载体筛选阳性样品。阳性克隆通过测序和PCR证实。实验分为4组:对照组,阳性对照组(pGL3-promoter质粒转染),阴性对照组(转染pGL3-Basic质粒),实验组(转染pGL3-Claudin-1promoter质粒)。将质粒转染293T细胞检测Claudin-1启动子活性。结果与结论:重组质粒DNA测序结果采用NCBIblast比对与GenBank(gi|62750811)中大鼠Claudin-1基因启动子序列完全匹配。重组萤光素酶报告基因转录活性检测与pGL3-Basic质粒相比,重组pGL3质粒转录活性明显增强(P<0.001)。经过测序和转染结果证实有效的pGL3-Claudin-1启动子质粒构建成功。     

大鼠SERCA2a启动子虫荧光素酶质粒的构建、鉴定和转染

目的构建大鼠SERCA2a启动子-虫荧光素酶质粒,并进行鉴定和转染检测。方法PCR法扩增出含SER-CA2a启动子基因的DNA大片段,经pGEM-T esay载体连接后酶切获得目的基因,亚克隆到pGL3-Basic载体中;酶切及测序鉴定;用Lipofectin Reagent转染到心肌细胞中,细胞培养后裂解并作荧光检测。结果构建出了含虫荧光素酶基因的质粒,酶切及测序鉴定插入子为大鼠SERCA2a启动子,转染细胞后检测到荧光。结论成功构建了大鼠SERCA2a启动子-虫荧光素酶质粒,为SERCA2a基因调控等研究提供了工具和基础。     

人PNPLA3基因启动子转录调控的初步分析

目的构建人PNPLA3基因不同长度的上游启动子荧光素酶报告基因裁体,在LO2细胞中比较不同长度启动子片段的活性,为研究PNPLA3基因的转录调控机制提供初步依据。方法对PNPLA3基因5’侧翼区约1 400个碱基进行生物信息学分析,预测其转录调控区域;利用PCR及酶切方法,以人外周血中全基因组DNA为模版扩增不同长度的PNPLA3基因上游启动子区序列,分别构建荧光素酶基因报告载体。瞬时转染LO2细胞,利用双荧光素酶报告基因分析系统检测各启动子的转录活性。利用在线分析软件预测PNPLA3基因主要转录调控区的潜在转录因子结合位点。结果成功构建5段不同长度的PNPLA3基因上游启动子区的报告载体;在LO2细胞内启动子活性随片段长度变化,表现为当PNPLA3启动子片段从-1015截短到-647,从-647截短至-553,从-553截短至-333时活性变化不大,而从-333截短至-8时活性显著下降(P<0.05);Match分析显示-333～-8片段具有多个转录因子结合位点。结论初步判断-333～-8区是PNPLA3基因的主要转录调控区。     

转染鼠脂肪干细胞用于血友病A基因治疗的可能性实验

目的:探索表达载体含有B结构域缺失的人凝血因子ⅧcDNA的重组质粒能够成功转染脂肪干细胞作为血友病A基因治疗靶细胞的可能性。方法:实验于2004-01/06在武汉大学医学院病理生理学实验室完成。先将重组质粒表达载体含有B结构域缺失的人凝血因子ⅧcDNA的重组质粒扩增、纯化和鉴定。取大鼠的腹腔和肾后脂肪组织,分离出脂肪干细胞。当培养细胞生长至80%融合时,将重组质粒表达载体和阳离子脂质体Lipofectamine转染试剂以0.5∶1,1∶1,1.5∶13种不同的质量比混合后转染大鼠的脂肪干细胞。培养36h后分别采用比色法和半定量多聚酶链式反应方法检测培养细胞上清中人凝血因子Ⅷ的凝血活性和脂肪干细胞的外源基因转化效率。结果:①转化效率结果:质量比为1.5∶1时转染效率比质量比为0.5∶1时约高5%,质量比为1∶1时转染效率最高,约比质量比为0.5∶1时高50%。②转化36h后检测脂肪干细胞上清中的人凝血因子Ⅷ活性的结果显示:表达载体与阳离子脂质体质量比为0.5∶1时,人凝血因子Ⅷ活性为0.2%;表达载体与阳离子脂质体质量比为1∶1时,人凝血因子Ⅷ活性为1.6%;表达载体与阳离子脂质体质量比为1.5∶1时,人凝血因子Ⅷ活性为0.4%。没有表达载体转染的脂肪干细胞上清中人凝血因子Ⅷ活性为0;正常人凝血因子Ⅷ活性为50%～180%。结论:外源基因含有B结构域缺失的人凝血因子ⅧcDNA的重组质粒能成功转染鼠脂肪干细胞,而且转化后的细胞能够表达人凝血因子Ⅷ,但表达的人凝血因子Ⅷ活性不高,这可能与本次实验中质粒的纯度不高、转染效率不高和其他原因有关。     

C3H10T 1/2小鼠胚胎成纤维细胞Dlxin 1基因表达及骨形态发生蛋白2的调控机制

背景:Dlxin 1可与成骨相关转录因子Dlx、Msx家族成员相互作用调节其转录活性,骨形态发生蛋白2可诱导小鼠胚胎成纤维细胞(C3H10T 1/2)向成骨细胞分化.目的:对C3H10T 1/2小鼠胚胎成纤维细胞中Dlxin 1基因的表达及骨形态发生蛋白2调控机制进行初探.设计、时间及地点:细胞分子水平实验,于2007-03/10在暨南大学生物工程研究所实验室完成.材料:C3H10T 1/2细胞为ATCC产品,骨形态发生蛋白2为自产,DH5α为自备.方法:用荧光定量PCR(qRT-PCR)检测骨形态发生蛋白2对基因表达的影响,用双荧光报告载体系统搜寻Dlxin 1的上游启动子元件,用凝胶迁移实验(EMSA)对其精确定位.主要观察指标:①细胞中Dlxin 1基因mRNA的表达情况.②pGL3-Dlxin 1系列缺失突变报告载体荧光活性及启动子片段与C3H10T 1/2细胞核蛋白的结合能力检测.结果:在转录水平上骨形态发生蛋白2可以诱导Dlxin 1基因表达上调;Dlxin 1启动子基础活性和骨形态发生蛋白2诱导活性调控区域均位于转录起始位点上游-943～-728 bp之间;EMSA证实,-758～-748 bp这一片段是调控核心区域.结论:转录因子通过与Dlxin 1启动子上游TATA box结合来调控Dlxin 1基因的转录.     

靶向mdr-1基因shRNA真核表达载体的构建与鉴定

本研究构建并鉴定靶向mdr-1基因的短发夹RNA(shRNA)真核表达载体。根据Genbank数据库提供的mRNA序列,选择设计3个能转录短发夹RNA(shRNA)的DNA序列,体外分别合成3对互补并编码mRNA基因的特异性shRNA序列的寡核苷酸,克隆到经BamHI和HindⅢ双酶切线性化的pGCsilencer人U6启动子质粒载体中;为了确定利用酶切和测序鉴定所构建的重组载体是否正确,采用脂质体转染的方法将构建好的3个重组载体(pGY1-1,pGY1-2,pGY1-3)导入慢性髓系白血病耐药细胞株K562/A02,采用实时PCR方法检测转染细胞的mdr-1基因表达,Western-blot检测P-gp表达量的变化。结果表明:应用PCR电泳图谱和测序证实了克隆RNAi打靶序列完全正确,而且该载体又同时表达GFP标记基因,用于测定转染效率。分别转染pGY1-1,pGY1-2,pGY1-3后K562/A02细胞的mdr-1基因表达和P-gp表达水平下降,证明shRNA可以特异性沉默mdr-1基因。结论:靶向mdr-1基因shRNA真核表达载体构建成功,为进一步研究mdr-1基因在K562/A02细胞中的作用奠定了实验基础。     

丁酸钠诱导人凝血因子Ⅷ的体外表达

目的：观察丁酸钠对人凝血因子Ⅷ（hFⅧ）表达的作用，并初步探讨其机制。方法：采用B区缺失（760－1639氨基酸）的hfⅧ cDNA(BDD-hfⅧcDNA)的重组质粒载体pRC/RSV-BDD-hFⅧ转化体外培养的小鼠NIH/3T3细胞，经丁酸钠作用后，分别采用一期法和ELISA法检测细胞培养上清中hfⅧ的活性（hfⅧ：C）的抗原含量（hfⅧ：Ag），并运用体外细胞核连缀反应技术（Run-on assay)观察丁酸钠对编码BDD－hfⅧ全长、重链和轻链的cDNA转录的影响。结果：经丁酸钠诱导后，hfⅧ：C和hfⅧ：Ag较对照组提高了约70％。Run-on assay显示丁酸钠通过增强BDD－hfⅧ重链基因的转录进而增强BDD－hfⅧcDNA全长的转录，因而提高hfⅧ cDNA的表达水平。结论：丁酸钠通过增强编码hfⅧ重 cDNA的转录进而提高hfⅧ的表达水平，因而是一个很有前途的诱导hfⅧ表达的化学物。     

克隆并应用计算机软件分析小鼠LASS1基因启动子区的特征

目的:克隆并应用计算机分析小鼠LASS1基因启动子,为进一步研究在细胞衰老过程中LAG1基因的转录调控奠定基础。方法:实验于2006-03/07在汕头大学医学院细胞衰老实验室完成。培养EC109细胞株,预测小鼠LASS1基因启动子所在区域,用PCR技术扩增启动子区序列,构建重组质粒pGEM-T-501、pGEM-T-181、pGEM-T-26,并转化JM109感受态菌,并分别克隆入荧光素酶报告基因载体pGL3-Basic及增强型绿色荧光蛋白报告基因载体pEGFP-1,酶切pGEM-T-501、181、26重组质粒及pGL3-Basic、pEGFP-1载体,制备插入片段和载体,构建重组表达质粒pGL3-501、pGL3-181和pGL3-26及pEGFP-501、pEGFP-181和pEGFP-26,转化JM109感受态菌。用脂质体介导的方法瞬时转染EC109细胞,测定荧光素酶表达活性及观察绿色荧光蛋白的表达情况。结果:①在预测启动子区构建了3种荧光素酶报告基因表达体系及3种增强型绿色荧光蛋白报告基因表达体系,分别为pGL3-501(-501bp～ 106bp)、pGL3-181(-181bp～ 106bp)、pGL3-26( 26～ 106)、pEGFP-501、pEGFP-181和pEGFP-26。②pGL3-501表达载体与pGL3-181表达载体荧光素酶表达活性相近,pGL3-26表达载体荧光素酶表达活性极低,与阴性对照活性相近, 26bp～ 106bp无启动子活性。绿色荧光蛋白的表达情况也类似,pEGFP-501和pEGFP-181有明显的绿色荧光蛋白表达,pEGFP-26和空载体pEGFP-1无表达活性。结论:-181bp～ 26bp区域含有小鼠LASS1基因转录所必需的基本启动子序列。其中2个SP1保守序列是小鼠LASS1基因启动子所必需的。     

大鼠SERCA2a启动子虫荧光素酶质粒的构建、鉴定和转染

目的 构建大鼠SERCA2a启动子一虫荧光索酶质粒，并进行鉴定和转染检测。方法 PCR法扩增出含SERCA2a启动子基因的DNA大片段，经pGEM-Tesay载体连接后酶切获得目的基因，亚克隆到pGL3-Basic载体中；酶切及测序鉴定；用Lipofectin Reagent转染到心肌细胞中。细胞培养后裂解并作荧光检测。结果 构建出了含虫荧光家酶基因的质粒，酶切及测序鉴定插入子为大鼠SERCA2a启动于。转染细胞后检测到荧光。结论 成功构建了大鼠SERCA2a启动子-虫荧光索酶质粒，为SERCA2a基因调控等研究提供了工具和基础。