海洋创伤弧菌LAMP快速诊断方法的建立与评价

目的利用环介导等温扩增(LAMP)技术,建立海洋创伤弧菌快速、简便、特异且敏感的检测方法,并对该方法的特异性和灵敏度进行评价。方法选取海洋创伤弧菌溶细胞素(vvhA)基因作为靶基因,根据GenBank公布的序列设计4条LAMP引物;对47株细菌(包括20株弧菌属细菌)进行LAMP和聚合酶链式反应(PCR)扩增,并做特异性比较;对创伤弧菌M06株增菌液10倍倍比稀释,提取DNA后进行灵敏度的检测,并与常规PCR作比较;构建含vvhA基因片段的重组质粒,作为LAMP反应体系的标准阳性对照。结果常规PCR实验出现假阳性结果,而LAMP实验只有海洋创伤弧菌出现阳性扩增,其他样品均为阴性,无假阳性和假阴性结果,表明引物的特异性较好,加入钙黄绿素和电泳结果相一致;针对vvhA基因建立的LAMP技术其最低检测下限为每个反应4×10CFU,是常规PCR(每个反应4×10~2 CFU)的10倍,呈现较好的灵敏度。重复实验过程两遍,PCR和LAMP技术检测结果稳定。结论建立了一种用于检测海洋创伤弧菌的LAMP检测方法,该方法特异性强,灵敏度高,方便快捷,特别适合用于现场和床旁的快速检测。     

TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR法检测幽门螺杆菌

目的建立TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR快速检测幽门螺杆菌(HP)的方法。方法针对HP cagA基因设计特异性引物和探针,建立TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR检测方法,并验证该方法的特异性、灵敏度和重复性。用该法对肝癌、肝硬化患者腹水及全血,猪、金黄地鼠、猴、犬、兔、豚鼠、大鼠、小鼠的全血、粪便、肠共1 201份标本进行检测,同时作常规细菌分离和测序分析。结果本方法特异性为100%,最低可检测2.2×101copies/μL的质粒DNA。标准曲线表明其具有良好线性关系,回归方程为:Y=-3.306X+38.633,相关系数(r)为0.999,扩增效率为100.648%。批内相对标准偏差(RSD)为0.19%～1.2%,批间RSD为0.14%～3.4%,RSD均<5%。上述1 201份标本用本法检出HP阳性130份,常规细菌分离法仅检出2份HP阳性。测序结果表明,与GenBank中收录的HP序列同源性为99%～100%。结论建立的TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR法特异性和灵敏度高,重复性良好,适用于HP感染的检测。     

基于TaqMan探针的幽门螺杆菌实时荧光定量PCR检测方法的建立

目的探讨基于TaqMan探针的幽门螺杆菌23SrDNA基因片段的实时荧光定量PCR检测的有效方法。方法根据幽门螺杆菌23SrDNA序列设计引物和探针,构建质粒标准品,建立实时荧光定量PCR体系并进行方法学评价,并对2012年5月至10月收集的100份临床样本进行检测同时应用免疫组化及银染方法进行比较分析。结果建立了检测23SrDNA的实时荧光定量PCR方法：107-102copies/ul范围内均有＂S＂型扩增曲线,最低检测浓度为102copies/ul,标准曲线相关系数为1。对临床其它消化道病原体不出现特异性的扩增曲线。对100份样本进行检测,实时荧光定量PCR能检出31份阳性,而免疫组化方法能检出25份阳性,银染方法能检出28份阳性。结论实时荧光定量PCR方法可成功检测幽门螺杆菌,且该方法具有灵敏度和特异性高及重复性好等优点。     

肺炎链球菌TaqMan实时荧光定量PCR的建立及临床应用

目的：建立TaqMan实时荧光定量PCR检测肺炎链球菌的方法,应用于临床儿童社区获得性肺炎（CAP）标本的快速筛查。方法根据 GenBank公布的肺炎链球菌自溶酶基因（lytA）设计引物和探针,建立实时荧光定量 PCR,并对体系进行优化;同时以痰培养法做双盲对照,应用于1504份 CAP患儿标本检测。结果 TaqMan实时荧光定量 PCR菌液的最低检出限可达18.75 cfu/PCR,无交叉反应,特异度好;对1504份儿童CAP标本检测,141份肺炎链球菌实时荧光定量PCR阳性,其中140份肺炎链球菌痰培养阳性,该方法灵敏度为100％,特异度为99.93％。从样品处理到结果报告仅需2.5 h。结论 TaqMan实时荧光定量PCR快速、简便、灵敏度高、特异度强,可用于儿童CAP中肺炎链球菌的初筛和指导抗生素的的合理使用。     

Taqman-探针荧光定量PCR鉴定副溶血弧菌方法的建立

目的 建立一种Taqman荧光定量PCR鉴定副溶血弧菌的方法。方法 以副溶血弧菌标准株(ATCC-VPJS421)和其它常见致病菌标准株为研究对象,通过Gene Bank获取toxR基因的序列,采用生物信息学软件设计特异性PCR引物及Taqman探针,在SLAN 96P荧光定量PCR仪进行扩增检测,评价该检测方法的特异度和灵敏度。结果 ①设计的引物能够扩增出特异性条带; ②扩增体系中0.5 μl探针的扩增效果优于1.0 μl探针; ③Taqman-探针荧光定量PCR检测方法对副溶血弧菌toxR基因的检测灵敏度为10^-1 mg/L; ④在检测粪肠球菌、金黄色葡萄球菌、腐生葡萄球菌、霍氏肠杆菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、溶藻弧菌、创伤弧菌、梅氏弧菌和弗尼斯弧菌等10种常见致病菌时未出现阳性扩增,特异度为100%。结论 成功建立Taqman探针荧光定量PCR鉴定副溶血弧菌的方法,该方法特异度、灵敏度均较好,适用于副溶血弧菌的快速检测,具有良好的应用价值。     

人血浆DNA双重实时荧光定量PCR检测法的建立

目的 建立带有内参照的双重实时荧光定量PCR方法检测血浆DNA含量.方法 构建重组质粒DNA作为内参照物,采用共用下游引物的双重实时荧光定量PCR技术同步扩增人看家基因β-actin和重组质粒载体中人工合成DNA序列,定量检测健康成年人血浆DNA含量.结果 本法能在同一个反应管中对目的基因和内参照进行同步扩增,两者的扩增无相互干扰,特异性好;重组质粒DNA的平均扩增效率达90%,β-actin基因的平均扩增效率接近100%;本法批内变异系数（CV）11%,批间CV17%.结论 成功建立含有内参照的双重实时荧光定量PCR方法,可对血浆DNA进行定量检测.     

Taqman-探针荧光定量PCR鉴定溶藻弧菌方法的建立

目的建立一种基于DNA回旋酶B亚单位基因(gyrB)基因的Taqman-探针荧光定量聚合酶链式反应(PCR)鉴定溶藻弧菌的方法。方法以溶藻弧菌标准株(ATCC)和溶藻弧菌野生株(WT)为研究对象,通过软件设计溶藻弧菌gyrB基因的特异性PCR引物及Taqman-探针,采用荧光定量PCR仪进行检测,评价该检测方法的特异性和灵敏度。结果 Taqman-探针荧光定量PCR检测方法对溶藻弧菌gyrB基因的检测灵敏度为10~(-3)mg/L;在检测粪肠球菌、金黄色葡萄球菌、腐生葡萄球菌、霍氏肠杆菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希氏菌6种其他常见致病菌时未出现阳性扩增,特异性均为100%。结论成功建立Taqman-探针荧光定量PCR是一种特异性、灵敏度均较好的鉴定溶藻弧菌的方法,该方法适用于溶藻弧菌的快速检测,具有应用价值。     

新型二聚体突变荧光引物定量PCR方法的建立及其在检测HCV中的应用

目的 开发新型二聚体突变荧光引物技术,建立一种能广泛应用于临床检测HCv的实时PCR方法.方法 构建重组质粒pMD18-T-HCV 5′NCR作为标准品,设计二聚体突变荧光引物,优化定量PCR体系,并进行方法学评价.将本法应用于临床确诊的30份HCV阳性患者、30份其他病毒性肝炎患者和30份健康志愿者血清标本的检测,定量结果与商品化TaqMan HCv定量试剂盒的定量结果进行比较.结果 建立了利用二聚体突变荧光引物的实时PCR方法,检测的线性范围为20～109IU/ml;批内CV在1.37%～4.59%之间,批间CV在1.58%～4.81%之间;对所有其他病毒性肝炎患者和健康志愿者血清HCV的检测结果均阴性,检测特异性为100%(60/60);对临床确诊的HCV感染患者血清标本全部检出HCV阳性,定量结果与商品化TaqMan HCV定量试剂盒的定量结果具有很好的相关性,相关系数R2=0.9501.结论 建立的以二聚体突变荧光引物为平台的HCV实时PCR检测方法,具有快速、价廉、准确、结果可靠等特点,可为HCV感染的诊断、治疗监测和流行病学调查提供较好的技术支持.     

利用TaqMan技术定量检测基因表达的引物探针设计

目的建立优化的实时荧光定量PCR的引物探针设计参数。方法设计引物和探针时的原则包括：①上、下游引物的融解温度（Tm值）应尽量相同或相差越小越好，以利于PCR退火温度的优化；②扩增区域应当跨越不同的外显子（在基因组DNA上至少一个以上的内含子），以利于区分基因组DNA扩增产物和cDNA扩增产物；③引物和探针的位置最好位于外显子和内含子交界处，以避免引物和探针与基因组DNA的结合；④扩增区域最好靠近基因的3’端，以减少不完全逆转录的影响。本次研究设计了实时荧光定量RT—PCR检测人甲胎蛋白mRNA的引物和探针，并提取临床肝癌组织标本中的RNA，检测其中甲胎蛋白的表达。绪果本次研究设计的实时荧光定量RT—PCR检测甲胎蛋白mRNA的引物和探针具有良好的特异性，可用于临床标本的检测。结论本次研究确定的原则对提高利用TaqMan技术定量检测目的基因结果的可靠性具有很好的指导意义。     

TaqMan荧光定量PCR检测流感嗜血杆菌和肺炎链球菌方法的建立及应用

目的 建立TaqMan荧光定量PCR检测方法 ,用于流感嗜血杆菌和肺炎链球菌的检测和鉴别诊断.方法 针对流感嗜血杆菌种属特异性基因bexA和肺炎链球菌种属特异性基因lytA,设计合成引物和TaqMan探针,研究不同引物和探针荧光定量PCR检测的特异性和灵敏度,确定标本检测中循环阈值(Ct)的临界值(cut-off值).将荧光定量PCR、乳胶凝集和细菌培养3种检测方法 同时应用于278份细菌性脑膜炎患者脑脊髓液标本的检测.结果 bexA基因引物和探针能特异性检测流感嗜血杆菌a、b、c、d血清型的菌株,检测灵敏度为每个反应10个基因组DNA拷贝;lytA基因引物和探针能特异性检测肺炎链球菌常见致病的血清型肺炎链球菌菌株,检测灵敏度为每个反应90个基因组DNA拷贝.通过荧光定量PCR方法 ,278份脑脊髓液标本中共检测出 4份流感嗜血杆菌阳性和7份肺炎链球菌阳性,其中各有2份培养出相应的病原菌,另有1份流感嗜血杆菌和2份肺炎链球菌乳胶凝集结果 阳性.结论 TaqMan荧光定苗PCR方法 能特异地检测和鉴定流感嗜血杆菌和肺炎链球菌,具有较高的灵敏度和快速检测的特点,能提高临床流感嗜血杆菌和肺炎链球菌感染患者标本的阳性检出率.     

护理干预对提高中风患者生活质量的效果观察

目的探讨提高中风患者生活质量的护理方法。方法将50例中风患者随机分为对照组23例和实验组27例,对照组给予针灸内科常规护理,实验组在此基础上给予心理护理和康复训练。结果两组患者治疗护理后日常生活活动(ADL)能力和贝克抑郁量表(BDI)评分均有好转,但实验组疗效明显优于对照组(P<0.05)。结论实施针对性心理护理和康复训练可明显提高中风患者的治疗效果。     

中国人四肢瘫日常生活能力评定量表的信度研究

目的研究四肢瘫日常生活能力评定量表评测四肢瘫患者的重测信度及观察者间信度。方法由1位评定者应用四肢瘫日常生活能力评定量表对20例四肢瘫患者进行评定,评定后1周内再次对该患者进行评定;另1位评定者在第1位评定者初次评定后2 d内对该患者进行评定。结果第1位评定者两次评定总分的组内相关系数为0.994(P<0.01);第1位评定者与第2位评定者评定总分的组内相关系数为0.971(P<0.01)。结论四肢瘫日常生活能力评定量表具有良好的重测信度及观察者间信度。     

肇庆市居民颈椎病流行病学调查

目的 :调查肇庆市居民颈椎病发病情况及相关问题。方法 :通过分层随机抽样选择该市区18～70岁居民5000人为研究对象 ,入户或至单位询问调查。结果 :该市居民颈椎病发病率为8.11% ,男女差异无显著性 ,随着年龄的增长 ,发病率逐渐增加。经多因素分析 :体位姿势不正确、情绪紧张、潮湿、疲劳是发病的主要诱因。结论 :该病严重影响肇庆市居民的健康 ,做好防治应从早做起 ,综合防治。     

脑卒中二级预防干预模式应用体会

目的:探讨脑卒中二级预防干预模式的实施效果.方法:将180例脑卒中患者随机分为观察组和对照组各90例,两组均建立健康档案,应用自行设计的脑卒中复发危险因素评估表对出院患者进行评估.观察组根据评估结果进行个体化强化教育和行为干预,对照组实施常规治疗和基本知识健康教育,分别在干预前和干预后3个月、6个月收集两组相关资料进行评价.结果:干预后观察组患者在疾病知识掌握正确率、不良生活方式改善情况及治疗依从性方面明显高于干预前及对照组(P＜0.01),观察组患者脑卒中复发率显著低于对照组(P＜0.05).结论:二级预防干预模式可有效降低脑卒中复发,提高患者生活质量.     

产科新生儿不同部位经皮测黄报警预值的可靠性观察

目的对比观察产科新生儿不同部位经皮胆红素（TCB）报警预值的可靠性。方法132例产科新生儿采取随机数字分组法分为正常产组和剖宫产组各66例,新生儿均于产后第4天同一时间点应用KJ8000经皮测黄仪分别测量额、胸、腹、额胸、额胸腹TCB值,TCB〉12．9mg／dl者,取得亲属同意抽取静脉血检测血清胆红素（SB）,对比分析不同部位TCB及其与sB值的差异。结果两组分别有17例或21例达到TCB报警预值。两组TCB或sB相同方法及相同部位比较,差异无统计学意义（P〉0．05）;两组TCB不同部位对比,额部值最低、胸部值最高,且与其他部位同组对比差异均有统计学意义（P〈0．01）;两组sB值对比差异无统计学意义（t=1．53,P〉0．05）,与不同部位TCB对比均以胸部数值差异无统计学意义（P〉0．05）,而与其他部位TCB两组差异均有统计学意义（P〈0．01）。结论正常产与剖宫产新生儿术后sB对比差异无意义;TCB动态监测以胸部结果更接近SB。     

早产儿视网膜病危险因素分析

目的调查瑞安市人民医院早产儿视网膜病（ROP）的发生率和高危因素。方法2005年8月1日至2008年8月1日对瑞安市人民医院新生儿监护病房（NICU）住院并符合筛查标准的540例新生儿进行了ROP筛查。结果在接受筛查的540例新生儿中,44例发生了ROP,发生率为8.1%。Ⅰ～Ⅲ期病变分别为35、7、和2例;其中2例需激光治疗,无失明病例。结论ROP相关因素的logistic回归分析结果表明,孕周、出生体重、吸氧时间、呼吸窘迫综合征是ROP形成的高危因素。     

韶关市农村留守儿童孤独感状况调查

目的了解广东省韶关市农村地区留守儿童孤独感现状及其影响因素。方法对韶关市某地区两所农村小学3～6年级学生中的489名留守儿童采用儿童孤独量表和自编调查表进行问卷调查。结果17．6％留守儿童存在孤独感，不同性别孤独感发生率无差异性，不同年龄及不同年级间孤独感发生率差异均有极显著性（P〈0.01）；随年级增加，孤独感发生率呈下降趋势（X^2趋势=5．970，P〈0.05）。留守儿童孤独感与健康状况、学习成绩、学习困难程度、父母教育方式、父母间关系和老师教育方式等因素显著相关（P〈0.01～0．05）。结论农村地区留守儿童中存在一定程度的孤独感问题，老师和家长应以正确的态度和方法对待留守儿童，以减少其孤独感的发生。     

壶腹癌的超声诊断分型在外科治疗中的意义

目的 探讨壶腹癌超声诊断分型在外科治疗中的临床意义。方法 将３１例手术病理证实的得癌根据超声表现分为３型∶Ⅰ型、胆总管下段无肿块型;Ⅱ型,胆总管下段小肿块型;Ⅲ型,胆总管下段明显肿块型。各型均与手术方式对照。结果 ３１例中Ⅰ型５例（１６．１％）,Ⅱ型１１例（３５．５％）,Ⅲ型１５例（４８．４％）。Ⅰ型与Ⅱ型合并手术切除率（１００％）与Ⅲ型的手术切除率（６０．０％）比较差异有显著性意义（Ｐ〈０．０１）。结论 壶腹癌超声诊断分型对术前制定手术方案、进一步提高手术切除率以及估计得癌的预后有重要的临床意义。     

胰腺癌治疗的Cochrane系统评价证据

目的评价胰腺癌治疗的Cochrane系统评价证据,以及纳入系统评价的临床随机对照试验（RCT）的方法学质量。方法检索Cochrane Library数据库（2009年第4期）中有关胰腺癌治疗的系统评价,并运用RewMan5.0.21对所纳入研究的偏倚进行评估。结果共检索到胆道支架置入术姑息治疗梗阻型胰腺癌的系统评价、放化疗治疗不能手术的进展期胰腺癌的系统评价共2篇系统评价,共纳入79个RCT。依照Cochrane协作网推荐的质量评价方法,对所纳入RCT的偏倚进行评估,表明均存在不同程度的偏倚,方法学质量普遍较低。结论 Cochrane系统评价是公认的最高质量的研究证据,但目前缺少足够强度的证据来支持胆道支架置入术姑息治疗梗阻型胰腺癌的疗效。其他治疗手段的疗效如胰腺癌围手术期的营养支持治疗等还需要通过进一步的完成系统评价来评估。建议推行临床试验透明化,实施临床试验注册制度以及按照CONSORT声明严格规范RCT的报告,以便于总结胰腺癌治疗的临床证据。     

ICU病人亲属家庭需要的调查研究

应用Molter“急危重病人家庭需要量表”对 5 0例ICU病人亲属进行调查 ,以了解当病人在ICU接受监护时 ,其亲属对病人家庭需要的认识。结果显示ICU病人亲属认为能够保证病人的安全 ,了解病人的治疗与预后 ,了解病人护理的需要最重要 ,而与病人亲属身心相关的需求重要性得分则较低。某些需要在男女病人亲属之间存在显著性差异 ,部分需要与病人亲属的年龄、教育水平和家庭收入分别有显著相关。提示ICU护士必须正确认识病人家庭需要 ,并根据病人亲属的性别、年龄、教育水平和家庭收入等因素满足病人家庭需要 ,以帮助病人家庭应对病人病重时的危机状态 ,维持病人及亲属的身心健康