应用全外显子组测序技术鉴定1个白化病家系致病基因HPS1

目的采用全外显子组测序鉴定1个常染色体隐性遗传白化病家系患者的致病基因,探讨其发病机制。方法采集先证者及其家系成员外周血并提取其基因组DNA,对先证者进行全基因外显子组测序,并结合序列变异生物信息学分析方法,鉴定其致病基因,利用Sanger测序对基因突变位点验证。结果全外显子组测序结果显示,先证者HPS1基因存在由c.1276_1279dupGGAG(p.Asp427fs)移码突变和c.398+5GA剪切位点变异组成的复合杂合突变,而其表型正常的父亲为c.1276_1279dupGGAG(p.Asp427fs)杂合突变,表型正常的母亲为c.398+5GA杂合突变。结论该白化病先证者由HPS1基因c.1276_1279dupGGAG和c.398+5GA复合杂合突变导致,此患者被诊断为Hermansky-Pudlak综合征1型。外显子测序技术可以快速准确地筛查白化病候选基因,并明确其具体临床亚型,有利于临床医师积极干预患者潜在并发症以及改善患者生存质量。     

全外显子测序产前诊断Walker-Warburg综合征

目的利用全外显子测序技术对患有脑积水和先天性心脏病的胎儿进行产前诊断,并指导再次妊娠。方法提取胎儿羊水细胞DNA以及父母外周血DNA,采用外显子测序技术进行检测,经过建库、杂交捕获、测序等过程,将得到的数据经过比对、软件分析、查找数据库及文献等,根据美国医学遗传学与基因组学学会(ACMG,2015)原则寻找胎儿的致病基因,并利用Sanger测序对致病位点进行验证。结果全外显子测序技术检测结果发现患儿POMT1基因发生复合杂合突变,分别遗传自母亲的经典剪切位点突变c.605+1GA(IVS7)和遗传自父亲的移码突变c.1367_c.1368(exon 15)ins GA,p.L456Lfs*80;Sanger测序验证结果与外显子捕获测序结果一致。胎儿为Walker-Warburg综合征患者。胎儿父母最终决定终止妊娠。结论利用全外显子测序技术可快速可靠地诊断Walker-Warburg综合征患者,在临床决策及产前咨询中发挥重要作用。     

一角膜营养不良家系的TGFBI基因突变*

摘要:目的对一角膜营养不良家 系的致病基因进行检测,明确该家系角膜营养不良的致病基因突变位点。方法采集先证者及其家系成员外周血标本，提取基因组DNA,采用全外显子组测序筛查先证者致病基因及突变位点，并通过Sanger测序对 先证者及其家系成员DNA样本进行验证。结果全外显 子测序结果显示，先证者5号染色体上的转化生长因子β诱导基因(TGFBI)4号外显子发生c.370 C>T(p.R124C)杂合突变,8号外显子发生c.1007 A>T(p.E336V)杂合突变。Sanger 测序验证 发现患者父亲及家系其他患者TGFBI基因也发生c.370 C>T(p.R124C)杂合突变,患者母亲及家系其他正常成员未见TGFBI基因发生突变。TGFBI基因c.370 C>T(p.R124C)突变与疾病表型共分离。结论TGFBI 基因e.370 C>T(p.R124C)杂合突变 是导致该家系角膜营养不良的致病原因。     

目标基因捕获测序技术检测1例肥厚型心肌病致病基因突变

目的通过靶向捕获高通量测序技术初步筛查肥厚型心肌病(HCM)致病基因突变。方法收集1例HCM患者临床信息和外周血,并提取基因组DNA,制备DNA全基因组文库。挑选导致HCM的8个候选基因,用GenCap基因序列捕获技术靶向富集该患者外周血DNA候选基因并行高通量测序。通过生物信息学分析筛选致病突变。用Sanger测序来验证相应致病基因突变位点。结果目标基因靶向捕获测序结果经与公共数据库和内部健康人测序数据库对比,发现致病基因突变位点MYBPC3 D770N,该致病基因突变与Sanger测序结果一致。结论用目标基因靶向捕获测序技术可实现对HCM致病基因突变的初步筛查,对HCM的临床基因诊断具有潜在的应用价值。     

一汉族玻璃体淀粉样变性家系的TTR基因突变检测

目的对一汉族玻璃体淀粉样变性家系的致病基因Transthyretin(TTR)进行检测,明确该家系玻璃体淀粉样变性的致病基因突变位点。方法采集该家系9个成员(包括临床确诊患者2例,无症状者7例)外周血,提取其基因组DNA。用PCR技术对TTR基因的4个外显子进行扩增,并对扩增产物进行Sanger测序;同时选取100例无血缘关系的健康人作为对照。结果该家系8例受检者中有4例受检者检测到TTR第2号外显子中第35位的密码子发生了AC(Lys35Thr)的杂合突变,而100例健康人对照组中均未发现相同突变。结论 TTR基因Lys35Thr杂合突变是导致该家系玻璃体淀粉样变性的致病基因。     

PRRT2 c.649C>T突变导致智力障碍以及蛋白质表达异常

摘要:目的?利用全外显子测序技术寻找1例智力障碍合并癫痫及运动障碍患者的遗传学病因，并探究其致病机制。方法?提取患儿及父母双方的外周血DNA，使用外显子测序技术寻找患儿的致病基因，并使用Sanger测序验证致病位点。利用小鼠cDNA诱导克隆该致病基因并构建质粒，采用western blot检测致病基因蛋白与野生型蛋白的表达情况。结果?全外显子测序检测发现该患者PRRT2基因存在无义突变(c.649C>T;p.R217X)，遗传自母亲；Sanger测序验证结果与外显子捕获测序结果相一致。western blot证实小鼠PRRT2?R223X突变蛋白(对应人PRRT2 R217X)不能正常表达。结论?PRRT2基因c.649C>T突变可能是该例患者智力障碍的致病原因。突变的PRRT2?R217X蛋白不能正常表达。     

应用全外显子组测序技术筛查罕见石骨症致病基因

目的筛查石骨症患者的致病基因,为疾病的基因诊断及预后提供参考。方法收集石骨症患者临床资料及外周血标本,提取DNA,构建全外显子测序文库,进行高通量测序并结合生物信息学技术筛查石骨症致病基因。结果对2例石骨症患者的全外显子进行了分析,平均测序深度分别为169.38X、231.06X,其中患者1携带罕见突变TCIRG1(c.1305+2TC)、TCIRG1(c.2008CT)和CLCN7(c.1116CT);患者2携带罕见突变CLCN7(c.857GA),生物信息学分析表明患者携带的罕见突变均对基因产物的结构和功能具有不同程度的影响。结论全外显子测序可一次性筛查已知石骨症致病突变,是石骨症致病突变筛查的有效工具,2例石骨症患者的临床病征可能与患者携带的TCIRG1和CLCN7突变密切相关。     

1例罕见Melnick-Needles综合征患者基因变异分析

摘要:目的研究 1例Melnick-Needles综合征家系的致病基因并为该家系提供遗传咨询依据。方法采集先证者即 1例不明原因骨骼发育异常、身材矮小的青年女性患者及其父母外周血标本,提取基因组DNA,采用家系全外显子组测序(Trio-WES)筛查先证者致病基因及突变位点，并通过Sanger测序进行验证。结果先证者位于 X染色体上的FLNA基因有一杂合变异位点:NM_ 001 110556.2: c.3562G>A(p.A1188T),父母均为野生型。根据ACMG指南,提示FLNA基因的c.3562G>A突变为1个致病突变位点,与X连锁显性遗传疾病Melnick-Needles综合征相关。国内未见该致病位点报道。结论确诊1 例罕见Melnick-Needles综合征,致病FLNA突变c.3562G>A在国内为首次报道,为患者及家属遺传咨询提供了依据。     

TMPRSS3基因的VUS变异在1个耳聋家系中的致病性分析

摘要:目的针对一对耳聋夫妇和其 胎儿进行家系全外显子组检测,为该家系遗传咨询提供参考和依据。方法收集该家系的临床资料,采集孕妇和其配偶的外周血和孕妇羊水,并提取基因组DNA,应用家系全外显子组测序技术进行产前遗传学检测,发现疑似致病位点进行Sanger测序验证;通过Minigene技术针对可能导致异常选择性剪切突变位点进行分析。结果孕妇携带跨膜丝氨酸蛋白酶3基因( transmembrane serine protease 3 , TMPRSS3)的复合杂合疑似致病突变,孕妇配偶携带GJB2基 因c.235delC的纯合致病突变。胎儿携带TMPRSS3基因复合杂合突变,分别来源于父亲的意义未明的c.323-8T>C杂合突变以及来源于母亲的c.325 C>T杂合突变;采用Minigene技术检测发现c.323-8T>C杂合突变未导致明显的剪切改变。结论 TMPRSS3基因的复合杂合突变可能是导致孕妇耳聋的原因,GJB2基因纯合突变是导致孕妇配偶耳聋的原因,胎儿携带的TMPRSS3基因复合杂合突变不会导致耳聋,夫妇再生聋儿的几率很小。     

全外显子组测序鉴定汉族人群扩张型心肌病新的MYH7基因突变

目的：我们应用全外显子测序筛查一个扩张型心肌病患者家系的致病基因。方法：我们对一位在复旦大学附属中山医院就诊的扩张型心肌病患者及其家族成员采集临床资料,同时采集外周血做全外显子测序,寻找可能的致病基因突变,然后用sanger测序对患者及家系成员验证。结果：通过对家系患者及家族成员基因测序分析,经过多个数据库过滤,我们发现了致病基因突变位点MYH7 c.2458G>C (p.Ala820Pro),随后我们发现在家族成员中携带该突变位点的成员心功能异常。检索数据库发现该位点既往未在汉族人群中报道过,首次发现该突变位点与扩张型心肌病有关。结论：本研究通过全外测序发现了一个扩张型心肌病家系的致病基因,为新的汉族人群扩张型心肌病致病位点。     

1例男性乳腺癌患者的临床特征及基因突变分析

目的对1例异时性男性乳腺癌和结肠癌患者及其家系成员进行基因突变分析,以明确病因,便于指导临床风险管理决策。方法采用全外显子测序技术对先证者外周血样本进行基因突变分析,结合表型资料,确定候选基因的可能致病位点。应用Sanger测序技术对先证者及其家系成员候选突变位点进行共分离验证。结果在先证者BRCA2基因第11号外显子中发现c.64026406delTAACT (p.Asn2134fs)杂合突变,该突变在乳腺癌信息中心(BIC)、ClinVar数据库中已有报道,为乳腺癌致病性突变。Sanger测序证实其儿子也为该突变的携带者,而其患结肠癌的母亲未检测到该突变。结论 BRCA2基因c.64026406delTAACT突变是该先证者乳腺癌的致病突变位点,而先证者及其母亲所患结肠癌可能为散发。     

基于全外显子组测序技术的遗传性血液病分子诊断技术体系

目的 探讨通过全外显子组测序技术建立遗传性血液病的分子诊断技术体系.方法 选择2013年6月至2014年3月于上海交通大学医学院附属上海儿童医学中心就诊的临床表现不典型,但高度怀疑为遗传性血液病的3例患者为研究对象.通过全外显子组测序技术筛选3例患者的候选致病基因的突变位点,并采用基于毛细管电泳技术的Sanger法测序和家系分析对其突变位点进行验证.结果 通过全外显子组测序技术发现了3例患者相应的遗传学损伤,并采用Sanger法对患者及其父母的致病基因位点的测序进行验证,验证结果与患者的遗传学损伤相符,每例患儿均获得了明确的分子诊断结果.结论 在遗传性血液病的分子诊断中,全外显子组测序是候选基因靶向测序的重要补充,且在一定程度上可提高疾病的诊断符合率.     

与发育癫痫性脑病9型相关的一-种新型PCDH19变体

摘要:目的探讨一发育性癫痈性脑病9型( developmental and epileptic encephalopathy-9, DEE9)患儿的临床特点及遗传学病因,以提高临床医生对该疾病的认识。方法收集 DEE9患儿临床资料,采集患儿及其父母外周血并提取基因组DNA,通过全 外显子高通量测序进行基因检测,Sanger测序验证突变位点，总结临床特征并分析遗传病因。结果全外显 子组测序结合Sanger测序验证发现DEE9患儿原钙黏蛋白19(Protocadherin 19, PCDHI9)基因在1号外显子c.851_ _852 处存在GC二核苷酸 杂合性插入，导致PCDHI9发生移码突变。通过变异位点检测系统推测PCDHI9基因的c.851_ _852dupGC突变为致病突变,且与DEE9存在相关性。结论患儿 PCDHI9基因的1号外显子发生变异,导致其患X染色体遗传疾病DEE9,c. 851 _852dupGC是一种新型突变形式,该突变位点的确认有助于明确患儿疾病诊断及父母再生育指导。     

二代测序技术检测家族性偏瘫型偏头痛患儿的基因突变

目的:采用二代测序技术检测1例因可逆性左侧肢体无力伴随头痛、呕吐而诊断为家族性偏瘫型偏头痛患儿的外显子基因组,探讨其分子遗传发病机制。方法:用二代测序技术检测患儿的外显子基因组,并用Sanger测序技术对筛选出的可疑位点进行双向及父母来源验证,应用蛋白质功能预测软件对新生突变位点进行生物信息学分析。结果:该患儿CACNA1A基因第28号外显子存在c.4552G>A(p.G1518R)突变,为未见报道的新突变,父母该位点正常。在100例健康人对照者中均未检测到该突变,排除其为多态性位点。蛋白质功能预测软件预测为“有害”,且在进化上高度保守。结论:采用二代测序技术检出家族性偏瘫型偏头痛家系1个新的CACNA1A基因突变,为临床诊断和遗传咨询提供了重要线索。     

二尼曼匹克病家系NPC1和NPC2基因突变检测分析

目的:二C型尼曼匹克病患者家系,对其进行NPC1和NPC2基因测序分析基因型与表型关系.方法:采患者及家系外周血基因组DNA,根据人类基因组数据库NC_000018 (NPCl)及NG_007117 (NPC2)基因序列设计引物分别扩增25个外显子和5个外显子区域,产物经过回收纯化,采用直接测序进行突变检测,测序结果应用DNAman等软件进行序列分析,对于异常片段进行重新扩增测序,验证结果可靠性.结果:二例患者均在NPC1基因发现杂合子位点A644G (H215R),导致第215位氨基酸由His突变为Arg;18号外显子发现一个杂合位点N931N (C2793T),氨基酸编码没有改变,家系成员未发现上述基因位点突变.结论:二尼曼匹克患者具有典型尼曼匹克临床特征,在基因水平上也发现相关基因突变位点,但在遗传上与家系成员相关不大.因此对于尼曼匹克患者或存在其他致病因素.     

Dravet综合征SCNIA基因新突变及遗传咨询

摘要:目的对2 例癫痫伴精神运动发育迟缓的患儿进行遗传学病因分析,旨在为患儿治疗及其家庭遗传咨询、生育指导提供依据。方法提取2例患儿及 其父母外周血基因组DNA并采用全外显子测序技术进行检测,按照美国医学遗传学与基因组 学学会(ACMG,2015)标准进行致病性分析,通过Sanger测序验证致病变异。结果全外显子测序结果发现,2例患儿电压门控性钠离子通道a1亚单位基因(SCNIA)基因存在c.5354T>C(p.11785T)和c.4380T>A(p.Y1460* )新发de novo杂合突变,分 别评估变异为可疑致病、致病突变位点,Sanger测序验证了该突变并确认双方父母相应位点均为野生型。结论结 合临床和基因诊断信息,2例患儿均被诊断为常染色体显性遺传病Dravet综合征,明确患儿的致病原因对于合理治疗方案的制定及其 家庭的优生优育、遗传咨询具有重要的意义。     

二代测序技术在儿童T淋巴母细胞淋巴瘤全外显子测序中的应用

目的 建立从石蜡包埋的儿童T淋巴母细胞淋巴瘤（T-LBL）病理组织中提取基因组DNA,采用二代测序技术行全外显子测序检测的方法并分析其可行性。 方法 从10例儿童T-LBL石蜡包埋组织中提取基因组DNA,PCR反应扩增后采用二代测序技术行全外显子测序检测并确定致病位点,所获得的致病突变采用Sanger测序法测序确认,比较两种方法的一致性。 结果 10例石蜡包埋T-LBL组织标本中均成功提取到基因组DNA,采用二代测序技术开展全外显子测序测序均检测到致病突变;二代测序检测结果经Sanger测序法验证,证实致病突变确实存在,且与Sanger测序结果一致。 结论 基于二代测序技术的全外显子测序测序可用于检测石蜡包埋的儿童T-LBL病理标本的致病突变。       

1例成骨不全患者Ⅰ型胶原基因突变的检测

目的对1例成骨不全(OI)患者Ⅰ型胶原基因(COL1A1和COL1A2)进行基因突变检测,为研究中国人群的OI基因突变特点提供线索。方法患者具有OI典型的蓝巩膜、易骨折、牙本质发育不全等临床表现,临床诊断为OI,提取患者外周血基因组DNA,对所有启动子区、外显子及外显子-内含子边界区进行DNA测序,通过序列特异引物PCR(PCR-SSP)法进一步验证,以患者的父母、妹妹及200例体检健康者作为对照。结果 DNA测序结果显示,OI患者COL1A1基因45号外显子发生单核苷酸替代突变(c.3263 GA,p.Gly1088Glu),而患者的父母、妹妹及200例健康对照者未发现相同的突变位点。同时PCRSSP也证明了此位点的杂合性。结论 c.3263 GA突变位点是一个OI患者COL1A1基因的新突变位点,与OI临床表型具有一定相关性。     

应用全外显子测序对有汗性外胚叶发育不良家系致病基因突变筛查

目的筛查外胚叶发育不良(HED)家系的致病基因。方法收集HED家系的临床资料及DNA标本,通过全外显子测序及Sanger测序,筛查HED家系的致病基因。结果家系中患儿为完全表型,具有典型HED三联症表现,其母亲及舅舅为非完全表型。患儿行全外显子测序发现其GBJ2基因发生突变,而既往报道的HED致病基因GBJ6的四个位点(G11R、V37E、D50N、A88V)均无突变;GJA1基因的V41L位点,以及GJB2的R127H、F191L位点未发现突变。Sanger测序进一步确认,GBJ2在患儿、母亲、外婆中发生突变,突变位点均为rs80338943,又名235delC,而舅舅未发现突变。结论该结果提示GJB6并不是HED必需的或者唯一致病基因。而GJB2基因235delC位点的突变与HED的关系有待进一步确认。本研究为探明HED疾病的相关基因及分子机制提供新的线索。     

X-连锁迟发性脊髓骨骺发育不良家系的基因诊断

目的 探讨一个X-连锁迟发性脊髓骨骺发育不良(X-linked spondyloepiphyseal dysplasia tarda,SEDL)家系发病的分子机制,建立基因诊断方法 .方法 采用身高测量、影像学检查殚及家系分析进行临床诊断.收集相关家系成员的外周血标本.提取基因组DNA后,采用PCR-SSCP和DNA测序分析家系中先证者、携带者和健康人SEDL基因的第3～6外显子.利用微卫星位点DXS16进行连锁分析.结果 PCR-SSCP检测到先证者第4外显子有异常泳动带;第4外显子的序列分析表明3例先证者均存在C.218C＞T突变,导致氨基酸序列S73L改变,3例携带者均存在该核苷酸位点的杂合突变,健康人未见突变;先证者的第3、5和6外显子核酸序列未见突变.序列分析证实家系中3名未婚女性Ⅲ10、Ⅳ6和Ⅳ7为致病基因携带者.结论 C.218C＞T突变是导致该家系发病的分子机制,可采用第4外显子序列分析对该家系进行基因诊断和产前基因诊断.