利用TaqMan技术定量检测基因表达的引物探针设计

目的建立优化的实时荧光定量PCR的引物探针设计参数。方法设计引物和探针时的原则包括：①上、下游引物的融解温度（Tm值）应尽量相同或相差越小越好，以利于PCR退火温度的优化；②扩增区域应当跨越不同的外显子（在基因组DNA上至少一个以上的内含子），以利于区分基因组DNA扩增产物和cDNA扩增产物；③引物和探针的位置最好位于外显子和内含子交界处，以避免引物和探针与基因组DNA的结合；④扩增区域最好靠近基因的3’端，以减少不完全逆转录的影响。本次研究设计了实时荧光定量RT—PCR检测人甲胎蛋白mRNA的引物和探针，并提取临床肝癌组织标本中的RNA，检测其中甲胎蛋白的表达。绪果本次研究设计的实时荧光定量RT—PCR检测甲胎蛋白mRNA的引物和探针具有良好的特异性，可用于临床标本的检测。结论本次研究确定的原则对提高利用TaqMan技术定量检测目的基因结果的可靠性具有很好的指导意义。     

骨形成发生蛋白-7成熟肽基因克隆及序列测定

目的：克隆人骨形态发生蛋白-7成熟肽基因。方法：根据Genebank人骨形态发生蛋白-7基因序列合成两条引物，从培养的人胎儿软骨细胞中提取mRNA，利用bnestep RT—PCR技术扩增出人骨形态发生蛋白-7成熟肽的基因序列，将PCR扩增产物基因片段连接克隆载体质粒中转化大肠杆菌DH5a进行克隆筛选鉴定及测序。结果：琼脂糖凝胶电泳检测RT—PCR产物显示-长约456bp的条带，阳性克隆质粒经双酶切可切出约456bp的片段，DNA测序结果与Genebank中的序列相符。结论：利用RT—PCR技术可成功的从人胎儿软骨细胞中克隆出人BMP-7成熟肽基因。     

BRCA1基因全长mRNA序列分析技术

目的:建立BRCA1基因全长mRNA序列测定方法。方法:根据文献和GenBank(U14680)报道的BRCA1基本序列设计6对特异性引物,建立6个特异性逆转录PCR(RT-PCR)技术,分段且扩增BRCA1全长mRNA,然后采用毛细管电泳进行cDNA测序,方法建立后用于3名健康女性样本。结果:6个特异性RT-PCR反应扩增片段相互覆盖,使序列分析结果包括全长BRCA1mRNA,共5000多bp。3名经PCR技术检测确定携带正常BRCA1基因的样本的mRNA分析结果显示,其BRCA1mRNA序列均与过往报道的正常mRNA序列完全一致。结论:所建立的RT-PCR特异性结合BRCA1基因,能用于其mRNA全长序列分析。     

改进的RT-PCR检测PML/RARα融合基因快速诊断急性早幼粒细胞白血病

在急性早幼粒细胞白血病(APL)细胞中迅速、准确检出PMI/RARα融合基因对于及时应用全反式维甲酸(ATRA)或亚砷酸(As2O3)提高诱导缓解率、减轻出血导致的早期死亡至关重要，但目前临床上采用的嵌套式RT—PCR方法繁琐且费时，亟待改进以满足临床APL快速、准确诊断的需要。本研究采用TRIZOL快速提取高质量的细胞总RNA，随机引物反转录，热启动单轮PCR，适当控制MgCl2及引物浓度和Taq酶用量，4条引物，3个体系，相同循环参数，对40例初诊APL患骨髓标本同时扩增PML/RARα融合基因及内对照RARα。结果显示，40例APL患标本均扩增出特异条带，非APL标本无特异扩增产物；阳性扩增片段清晰易辩、断裂点类型易于确定，检测可在6小时内完成。结论：此改进的RT-PCR检测PML/RARα融合基因快速、特异、简便，完全满足临床对初诊APL诊断的需要。     

巢式RT—PCR检测肺癌患者外周血微量转移癌细胞

[目的]建立检测肺癌患者外周血微转移癌细胞的敏感的分子检测方法，探讨其临床应用的意义。[方法]从肺癌患者外周血中分离有核细胞，用TRzol提取RNA，采用巢式反转录聚合酶链反应(RT—PCR)技术特异引物扩增CK19mRNA，凝胶电泳观察结果，以检测肺癌患者外周血CK19-mRNA的表达情况。分析CK19mRNA扩增结果与患者临床指标的关系。[结果]76例肺癌患者外周血标本中39例CK19mRNA阳性，阳性率为51．3％(39／76)，27例肺良性病变中仅1例阳性，阳性率为3．7％，15例健康对照者为阴性。[结论]巢式RT—PCR检测肺癌患者外周血微量转移癌细胞具有较高的敏感性和特异性，CK19-mRNA可作为一个标志物来检测肺癌患者外周血微转移。     

实时荧光定量RT-PCR检测TGF-β1 mRNA表达

利用荧光TaqMan技术 (5′核酸外切酶活性 )和一种可以实时检测荧光信号的仪器 (ABIPrism 770 0序列检测系统 ) ,在PCR反应完全封闭的情况下可实时检测PCR扩增的动力学变化 ,能够对标本扩增过程中的起始拷贝数快速、准确地定量 ,极大地克服了原有PCR技术存在的不足 ,已逐步成为PCR更新换代的新技术[1 ,2 ] 。目前常规检测 β1 转化生长因子(TGF β1 )表达多采用竞争RT PCR及内源性参比基因RT PCR ,它们都属于PCR终点法检测 ,很难对起始模板数准确定量。我们利用实时荧光定量RT PCR技术建立了检测TGF β1 mRNA表达的方法。…     

一步法RT-PCR检测慢性粒细胞白血病BCR-ABL融合基因

目的：建立一步法RT-PCR检测CML患者BCR—ABL融合基因的实验方法。方法：Trizol试剂提取细胞RNA，用特异引物一步法RT—PCR检测BCR—ABL融合基因．并作灵敏度试验。结果：本方法的灵敏度可达到10pg水平。对25例CML患者检测BCR-ABL融合基因，阳性率为100％．并可检测出BCR—ABL融合基因各种融合方式。结论：一步法RT—PCR检测BCR-ABL融合基因有很好的灵敏度和特异性，操作简便、快速，特别适用于临床检测。     

人血小板衍生生长因子B在大肠杆菌中的表达及对骨组织修复的影响

目的：为研究人血小板衍生生长因子BB(PDGF—BB)在大肠杆菌中的表达及其在治疗骨折愈合、骨质疏松等疾病中的作用，克隆了PDGF—B的成熟肽基因并进行了序列分析。方法：从脐静脉内皮细胞提取总RNA，经反转录聚合酶链式反应(RT—PCR)扩增出包含全长编码人PDGF—B基因cDNA，再以此为模板，用特异引物进行PCR扩增出PDGF—B成熟肽基因；将目的基因连接到载体pGEM—T上，进行序列测定。之后将此片段克隆到表达载体pQE30，构建成表达质粒pQE30—PDGFB。结果：重组质粒经酶切及PCR鉴定，证实PDGF—B成熟肽基因克隆成功，序列正确。结论：PDGFB基因的成功克隆和原核表达载体的构建，为促进骨修复功能研究及基因工程生产奠定了基础。     

急性髓系白血病核仁磷酸蛋白基因及其突变检测方法的建立

本研究建立PCR技术检测白血病细胞核仁磷酸蛋白（nucleophosmin，NPM）基因及突变的方法。以白血病细胞系和白血病临床标本为研究对象，首先采用RT—PCR检测NPM mRNA表达水平，其次应用PCR方法检测NPM第12外显子，并对扩增产物进行测序分析，最后以插入NPMA型突变cDNA的质粒作为阳性模板，建立PCR检测NPM突变的方法并进行方法学评价，并采用此方法直接检测白血病细胞中是否存在NPM基因突变。结果表明：白血病细胞系NPM mRNA表达水平较正常单个核细胞对照组高，23例急性髓系白血病标本均不同程度地高表达NPM mRNA；采用PCR扩增联合测序分析发现，髓系白血病细胞系（THP1和K562）NPM基因组第12外显子无突变，但K562细胞NPM基因3’非编码区存在1个T碱基缺失；建立直接针对NPMA型突变cDNA的PCR方法，能特异扩增NPMA型突变基因；该方法重复性好，批内、批间变异系数分别为1．6％和3．1％，灵敏度为100PgcDNA；采用此方法从23例白血病临床标本中检出2例NPM突变阳性。结论：建立了检测NPM mRNA水平和A型突变的实验方法，发现白血病细胞高表达NPM mRNA水平，部分白血病患者NPM基因发生A型突变。     

维甲酸诱导HL-60细胞分化过程中端粒酶活性与 hTERT,c-myc和bcl-2表达的研究

为了探讨全反式维甲酸(ATRA)诱导HL—60细胞分化过程中端粒酶活性与hTERT，c—myc和bcl—2　mRNA表达的变化规律及其意义，复制HL—60细胞的诱导分化模型，在分化前和分化过程中通过端粒重复序列扩增PCR—ELISA方法测定端粒酶活性，采用RT—PCR方法检测hTERT，c—myc和bcl—2　mRNA表达水平。结果显示，在ATRA诱导HL－60细胞分化过程中，端粒酶活性水平逐渐下降，hTERT　mRNA表达下调的同时c—myc和bcl—2　mRNA表达亦下调，且hTERT　mRNA下调早于端粒酶活性水平下降。结论：全反式维甲酸诱导的HL—60细胞分化过程与端粒酶活性降低和hTERT，c—myc及bcl—2　mRNA表达下降有关。     

分子生物学技术在MALT淋巴瘤诊断及鉴别诊断中的应用

目的研究免疫球蛋白重链基因重排及融合基因API2-MALT1在MALT淋巴瘤诊断和鉴别诊断中的作用。方法采用RT—PCR方法对60例MLAT淋巴瘤，对照组30例结外弥漫性大B细胞淋巴瘤和30例淋巴结反应性增生病例石蜡包埋组织中API2-MALT1进行检测，以看家基因PGK作为内对照检测cDNA质量；采用半嵌套式PCR方法，对60例MALT淋巴瘤，对照组30例淋巴结反应性增生病例石蜡包埋组织中B细胞免疫球蛋白重链进行扩增，以看家基因B-actin作为内对照检测基因组DNA质量。结果60例MALT淋巴瘤中42例检出B细胞免疫球蛋白重链基因重排，去除B-actin DNA阴性4例，MALT淋巴瘤中免疫球蛋白重链基因重排检出率75．0％(42／56)。对照组30例弥漫性大B细胞淋巴瘤重排检出率90．3％(23／30)，反应性增生未检出重排。60例MALT淋巴瘤中6例检出API2-MALT1 mRNA表达，去除PGK阴性病例7例，MALT淋巴瘤中API2-MALT1 mRNA阳性率10．1％(6／53)。所有对照组未检出API2-MALT1 mRNA表达。结论半嵌套式PCR技术在石蜡包埋组织中检测B细胞免疫球蛋白重链基因重排可用于MALT淋巴瘤和淋巴组织反应性增生的鉴别诊断。RT-PCR技术在石蜡包埋组织中检测API2-MALT1 mRNA阳性率较低，但特异性强，可用于MALT淋巴瘤的鉴别诊断。     

实时荧光定量RT—PCR技术在疾病相关mRNA定量检测方面的应用进展

实时荧光定量逆转录多聚酶联反应（RT—PCR）技术作为一项高度敏感、程序结束无需后处理和可高通量检测的新型技术已广泛用于基因表达的定量检测。为了更好地将这一技术应用于临床研究的各领域，本文就荧光定量RT—PCR检测基因表达的原理、绝对定量与相对定量的区别、实时荧光定量RT-PCR技术检测核糖核酸（mRNA）存在的几个问题，以及目前该技术在临床研究方面的应用进展作一综述。     

实时荧光定量RT-PCR技术在疾病相关mRNA定量检测方面的应用进展

实时荧光定量逆转录多聚酶联反应（RT—PCR）技术作为一项高度敏感、程序结束无需后处理和可高通量检测的新型技术已广泛用于基因表达的定量检测。为了更好地将这一技术应用于临床研究的各领域，本文就荧光定量RT—PCR检测基因表达的原理、绝对定量与相对定量的区别、实时荧光定量RT-PCR技术检测核糖核酸（mRNA）存在的几个问题，以及目前该技术在临床研究方面的应用进展作一综述。     

荧光定量RT-PCR检测糖尿病病人PBMC中TGF-β1表达水平

目的：应用荧光定量逆转录聚合酶链反应（FQ—RT—PCR），检测糖尿病病人外周血单个核细胞（PBMC）中TGF-β1mRNA的表达水平。方法：分离外周血单个核细胞，用Trizol裂解液提取总RNA，逆转录为cDNA，在扩增体系中加入SYBR Green I，应用FQ—RT—PCR定量检测TGF-β1mRNA。结果：重组质粒测序证明插入的片断为TGF-β1特异性片断。荧光定量RT—PCR检测TGF—β1mRNA的灵敏度达10^5拷贝／ml，线性范围为10^5～10^11拷贝／ml，批内、批问变异系数分别为2．27％～2．56％和4．78％～5．22％．临床应用显示．糖果病惠者PBMC中TGF—β1 mRNA含量显著高于正常。结论：FQ-RT-PCR检测TGF-β1mRNA具有灵敏、特异、快速等特点．为临床应用提供了方法学依据。     

弓形虫表面抗原SAG1基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

目的 体外扩增弓形虫RH株膜表面抗原SAG1编码基因，构建原核表达质粒，并表达SAG1编码基因序列。方法 收集、纯化RH株速殖子，提取RNA，据已知的SAG1基因序列，在设计合成的1对引物中引入EcoRI和HindⅢ酶切位点。应用RT—PCR技术，扩增SAG1基因片段，插入原核表达质粒pET28a中，转化大肠杆菌BL21感受态细胞，重组子经EcoRI和HindⅢ双酶切、PCR鉴定，转化宿主菌BL21，并以IPTG诱导表达。结果 从弓形虫RH株RNA中扩增出1011bp的SAG1基因片段，构建重组质粒pET28a／SAG1，酶切和PCR鉴定产物大小均与预期值相符；IPTG诱导，SDS—PAGE显示表达产物的大小约34．8kD．结论 成功地从弓形虫RH株RNA中获取SAG1基因，构建了pET28a／SAG1重组质粒并获得了高效表达，为免疫学诊断和蛋白质疫苗的研究创造了条件。     

主动外排系统acrAB在临床分离肺炎克雷伯菌中的分布和表达

目的：研究临床分离多重耐药肺炎克雷伯菌的耐药机制。检测肺炎克雷伯菌中有无类似大肠埃希菌主动外排系统acrAB的结构基因acrAB的分布和表达。方法：用聚合酶链反应(PCR)检测acrAB基因在临床分离的肺炎克雷伯菌和肺炎克雷伯菌标准菌株(ATCC 10031)中分布。用逆转录(RT)-PCR测定其mRNA表达水平。并对PCR扩增的ATCC 10031的acrAB基因片段进行序列分析。同大肠埃希菌acrAB基因的相应序列进行同源性比较。结果：在所有被检的临床分离肺炎克雷伯菌和ATCC 10031的染色体中均发现有类似大肠埃希菌的acrAB基因;肺炎克雷伯菌多重耐药菌株acrAB的mRNA水平显高于敏感野生株和耐药谱不同的菌株,而耐药谱不同的菌株仅略高于敏感菌株;PCR扩增的ATCC 10031的acrAB基因片段同大肠埃希菌acrAB基因相应片段,在核苷酸序列上具有很高的同源性。结论：本研究表明在肺炎克雷伯菌中有类似大肠埃希菌的acrAB基因存在,其表达水平决定了多重耐药表型。     

CDCP1胞外段基因的克隆及在大肠杆菌中表达

目的：构建携带 CDCP1胞外段基因的原核表达载体。方法以 A549的 mRNA 为模板,应用所设计的引物通过 RT-PCR 法扩增 CDCP1胞外段基因;将 PCR 产物与 pGEX-KG 载体连接,获得重组质粒 pGEX-KG/CDCP1;经双酶切、PCR 及 DNA 序列测定进行鉴定;IPTG 诱导表达。结果①RT-PCR 扩增得到约270 bp 大小的 CDCP1胞外段基因目的片段;②目的片段正确插入到 pGEX-KG 中;③经 IPTG 诱导表达,可见在相对分子质量约35kD 处出现明显的诱导蛋白条带,与预期一致。结论成功构建了携带 CDCP1胞外段基因的原核表达载体,在大肠杆菌中获得大量表达。     

联合应用FISH和巢式RT-PCR技术检测慢性髓系白血病bcr/abl融合基因

目的 检测慢性髓系白血病(CML)bcr／abl融合基因，协助临床诊断。方法 联合应用荧光原位杂交(FISH)、Northem杂交和巢式RT—PCR技术。结果 在16例被检测的CML患中，有3例两种方法的结果不一致，经Northem杂交验证发现，RT—PCR较FISH更敏感，但存在假阳性；另外，FISH较容易检测到bcr／abl融合的少见类型，而巢式RT—PCR需要同时设计多对特殊引物，否则极易漏诊。结论 联合应用FISH和巢式RT—PCR技术检测CML bcr／abl融合基因可以优势互补，使结果更加准确、可靠，更适合于临床诊断、疗效判定以及对微量残留病的监测。     

建立人乳腺珠蛋白mRNA FQ-PCR方法用于乳腺癌微小转移的诊断

目的 克隆人乳腺珠蛋白（human mammaglobin,hMaM）基因,建立荧光定量PCR方法,探讨外周血hMaM mRNA的表达作为乳腺癌血行微小转移标志物的可能性。方法 设计特异引物,用RT-PCR方法从乳腺癌组织扩增获得目的片段,利用T／A克隆将PCR产物插入pMD-18T载体;优化扩增条件,以pMD／M质粒制备标准曲线,建立FQ-PCR方法,对乳腺癌不同分期的患者（n=28）,乳腺良性疾病患者（n=15）,其他肿瘤患者（n=33）的外周血进行检测。结果 成功获得hMaM基因并完成克隆,阳性克隆测序结果与预期序列一致;建立了FQ-PCR检测hMaM mRNA方法;28例乳腺癌病人中9例（32．1％）阳性（Ⅰ期4例,Ⅱ期3例,Ⅲ期1例,Ⅳ期1例）,hMaM mRNA的表达与乳腺癌病理分期无关（X^2=0．5936;P〉0．05）;乳腺良性疾病组,其他肿瘤病人组厦对照组外周血中均未检出hMaM mRNA。结论 hMaM mRNA是乳腺癌特异性标志物,其外周血的表达可作为乳腺癌血行微小转移的指标。     

咽拭子和痰标本中SARS冠状病毒核酸检测

目的 建立SARS冠状病毒的RT—PCR核酸检测方法。方法 合成针对SARS冠状病毒特异性引物，从SARS病人及疑似病人标本中提取RNA，经反转录和巢氏PCR扩增出相应大小的DNA片段。对这些片段克隆后进行DNA序列分析，并将序列与SARS冠状病毒和其它已知冠状病毒进行同源性分析。结果 从SARS病人痰、咽拭子或血液标本中得到多例RT—PCR阳性片段，其中8个片段经克隆和DNA序列分析证实为SARS冠状病毒序列(同源性100％)，而所有参照标本RT—PCR均为阴性。结论 该方法可用于SARS冠状病毒的RT—PCR核酸检测。