昆明小鼠iPS细胞传代培养方法的优化研究

目的:探索不同胰蛋白酶序贯传代方法对小鼠诱导多潜能干(iPS)细胞培养的影响。方法:利用不同胰蛋白酶序贯方法消化小鼠iPS细胞(实验组),与传统的单一胰蛋白酶传代方法(对照组)进行比较,利用流式细胞学计数技术比较2组消化后的细胞中iPS细胞的比例。结果:iPS细胞所占比例在实验组、对照组分别为60.25%、47.06%,有显著性差异(P<0.01)。结论:用不同胰蛋白酶序贯消化方法对小鼠iPS细胞进行传代培养,可提高小鼠iPS细胞的纯度,有利于小鼠iPS细胞的扩增培养。     

人参皂苷Rg1参与诱导小鼠多潜能干细胞的研究

目的:观察人参皂苷Rg1对鼠胚成纤维细胞(MEF)向诱导多潜能干细胞(iPSCs)诱导转化效率的影响。方法:采用经典四因子的逆转录病毒载体感染,在细胞感染后3 d内在MEF培养基里加入人参皂苷Rg1(0、0.3、1、3、10μg/mL),进行iPSCs诱导及鉴定。结果:人参皂苷Rg1(1μg/mL)组可明显提高iPSCs的诱导效率,诱导效率为(0.0450±0.0019)%,人参皂苷Rg1(0μg/mL)组为(0.0100±0.0033)%,所获iPSCs经鉴定为阳性。结论:人参皂苷Rg1可能在提高小鼠iPSCs的诱导效率方面发挥一定作用。     

霉酚酸酯诱导Balb/c小鼠调节性T细胞的分化和增殖

目的:观察霉酚酸酯对Balb/c小鼠调节性T细胞(regulatory T cells,Treg)分化和增殖的影响,进一步探讨其可能的免疫耐受诱导机制。方法:取8周龄的SPF级Balb/c小鼠24只,随机分为3组,霉酚酸酯组(MMF组):每只灌胃霉酚酸酯40mg/(kg·d),环孢素组(CsA组):每只灌胃CsA10mg/(kg·d),对照组:灌胃每天予等体积生理盐水。3周后眼眶静脉取血,无菌条件下分离脾脏,制备单细胞悬液。采用流式细胞仪检测小鼠外周血和脾细胞CD4+CD25+Treg细胞,免疫组化法检测小鼠脾脏Foxp3蛋白的表达。结果:霉酚酸酯组小鼠外周血和脾细胞中CD4+CD25+Treg细胞的比例分别为(6.35±0.09)%和(11.62±1.10)%,CsA组小鼠外周血和脾细胞中CD4+CD25+Treg细胞的比例分别为(2.57±0.09)%和(5.46±0.75)%,对照组小鼠外周血和脾细胞中CD4+CD25+Treg细胞的比例分别为(4.64±0.13)%和(7.61±0.73)%,差异均有显著性(P<0.01)。霉酚酸酯组小鼠脾脏Foxp3蛋白的表达水平明显高于对照组,差异有显著性(P<0.01),CsA组小鼠脾脏Foxp3蛋白的表达水平明显低于对照组。结论:霉酚酸酯能够明显诱导Balb/c小鼠体内CD4+CD25+Treg细胞的增殖,并能提高Foxp3蛋白的表达,有利于免疫耐受的形成,其免疫抑制机制与CsA不同。     

人胰岛素生长样因子-1诱导和多聚蛋白聚糖酶-1沉默对人骨髓干细胞微丝结构的影响

目的探讨人胰岛素生长样因子-1(h IGF-1)诱导和多聚蛋白聚糖酶-1(aggrecanse-1)沉默对人骨髓干细胞微丝结构的影响。方法用基因重组技术构建携带h IGF-1过表达和沉默aggrecanase-1-si RNA的慢病毒载体,用其转染人骨髓干细胞,记为基因诱导组、基因沉默组、基因诱导沉默组,以不携带目的基因的慢病毒转染人骨髓干细胞和未处理的人骨髓干细胞分别记为对照组1、对照组2,转染7 d后PCR检测基因表达,同时激光共聚焦显微镜下观察各组细胞的微丝结构,并用Image J检测各组细胞的荧光强度。用SPSS软件进行统计学分析。结果基因诱导沉默组的荧光强度(0.119±0.008)高于基因诱导组(0.081±0.001)和基因沉默组(0.080±0.003),基因诱导组和基因沉默组的荧光强度高于对照组1(0.065±0.003)和对照组2(0.066±0.005),差异有统计学意义(P<0.01)。对照组1和对照组2的荧光强度差异无统计学意义(P>0.05)。结论 h IGF-1的诱导和aggrecanse-1的沉默均促进骨髓干细胞微丝结构的生成,诱导沉默双向作用更显著。     

姥鲛烷联合鼠源性B淋巴瘤A20细胞株诱导淋巴瘤小鼠模型的实验研究

目的建立有一定免疫功能的B细胞淋巴瘤小鼠模型。方法 38只BALB/c小鼠,其中32只小鼠尾静脉注射1×106个A20细胞后分为实验组16只和对照组16只,分别腹腔注射姥鲛烷0.5mL和生理盐水0.5mL,观察2组小鼠成瘤情况、时间、部位和成瘤率,并分别取各脏器组织行组织病理检查,采用免疫组织化学法检测肿瘤组织免疫表型。另6只小鼠作为空白对照组,采用流式细胞术检测3组小鼠的免疫功能。结果对照组小鼠成瘤率为43.8%,成瘤时间为(72.6±8.7)d;实验组小鼠成瘤率为87.5%,成瘤时间为(32.5±4.1)d,差异有统计学意义(P<0.05);荷瘤鼠的免疫功能未明显改变,实验组成瘤小鼠CD19阳性细胞表达率为(90.01±3.51)%,对照组为(87.79±5.62)%,差异无统计学意义(P>0.05);实验组、对照组小鼠第30天NK细胞数(40.7±2.2和60.3±1.9)均明显高于空白对照组(15.1±0.6)(P<0.05),对照组高于实验组(P<0.05)。结论姥鲛烷联合A20细胞株成功构建了有一定免疫功能的播散性B细胞淋巴瘤小鼠动物模型,成瘤率高,成瘤时间短,且保留了较好的免疫功能。     

不同培养体系下iPS细胞分化为造血干细胞差异的研究

目的:探讨不同培养体系条件下诱导多能干细胞(iPS)体外分化为造血干细胞的能力差异。方法:比较2种无滋养层培养液——E8和mTESR及经典ES培养体系下培养的iPS细胞,在体外与小鼠骨髓基质细胞OP9细胞共培养,诱导iPS细胞分化为造血干/祖细胞。采用流式细胞术及实时定量PCR方法分别检测造血特异标志物的表达,比较3种培养液对iPS体外造血分化的影响。结果:3种不同培养液培养的iPS均可分化为造血干细胞,经典ES培养体系培养的iPS诱导造血效率达28.4%,明显高于无滋养层E8和m TESR培养体系。结论:iPS与OP9共培养可分化为造血干/祖细胞,且使用经典ES培养液培养iPS更有利于其向造血系的分化。     

胎盘免疫调节因子对细胞因子诱导的杀伤细胞超微结构及免疫表型的调节作用

目的:通过电子显微镜、流式细胞仪观察经胎盘免疫调节因子处理的细胞因子诱导的杀伤细胞超微结构及免疫表型变化,了解胎盘免疫调节因子的免疫调节活性。方法:实验于2006-02/2007-01在广西医科大学医学科学实验中心重点实验室进行。实验材料:重组人干扰素γ和白细胞介素1α为Peprotech公司产品。重组人白细胞介素2和抗人CD3单克隆抗体为北京远策药业有限公司产品。实验方法:①胎盘免疫调节因子的制备:将新鲜经检人胎盘去筋膜,生理盐水冲净、剪碎匀浆,置-20℃48h后,反复冻融3次,用生理盐水透析,取透析外液,过虑除菌,分装,抽样做有关鉴定实验。②细胞因子诱导的杀伤细胞的制备:抽取健康自愿者静脉血20mL,用淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞,加RPMI1640培养液调整细胞的密度至1×109L-1,放于50mL培养瓶中培养。于当天加入1×106U/L干扰素γ,置于37℃、50mL/LCO2孵育箱中培养24h。次日将悬浮的细胞转移到6孔板培养中,分别加入终浓度为100mg/L的PHA、3×105U/L白细胞介素2、133μg/L抗CD3mAb及1×105U/L白细胞介素1α,每3d半量换液1次,同时补加白细胞介素2至3×105U/L。将培养14d细胞因子诱导的杀伤细胞以5×109L-1接种于24孔板,实验组中加入一定剂量的胎盘免疫调节因子诱导,对照组加入等量生理盐水,继续培养72h。③实验评估:制备电镜标本,观察细胞超微结构。采用流式细胞术测定细胞因子诱导的杀伤细胞CD4 、CD8 、CD3 CD4 、CD3 CD8 、CD25 、HLA-DR、CD3 CD56 、CD80 百分含量。结果:①细胞因子诱导的杀伤细胞表型分析:实验组CD4 、CD8 和CD3 CD4 明显低于对照组[实验组:(8.40±8.15)%,(33.10±4.61)%,(7.98±12.65%);对照组:(39.43±9.16)%,(58.90±11.35)%,(31.30±5.94)%,P<0.05];实验组CD3 CD8 、CD25 表达明显高于对照组[实验组:(30.50±2.56)%,(24.8±6.31)%;对照组:(15.90±7.35)%,(0.56±0.21)%,P<0.05]。②透视电镜下观察细胞因子诱导的杀伤细胞超微结构特征:与对照组相比,实验组细胞因子诱导的杀伤细胞线粒体深染,溶酶体增加,异染色质比例增加,微绒毛肿胀及增长等。结论:胎盘免疫调节因子能促使细胞因子诱导的杀伤细胞超微结构及细胞表型发生明显变化:细胞因子诱导的杀伤细胞线粒体深染,溶酶体增加,异染色质比例增加,微绒毛肿胀增长,CD3 CD8 、CD25 细胞百分比升高,CD4 、CD8 和CD3 CD4 细胞百分比降低。     

葛根素抑制乙醇诱导骨髓基质细胞成脂分化的实验

背景:动物实验证明乙醇可引起股骨头内脂肪积聚,导致骨坏死。分子生物学实验证明乙醇能够诱导骨髓基质细胞成脂分化。若某种药物能够对抗乙醇诱导骨髓基质细胞的成脂分化作用,则可能防治酒精性骨坏死。目的:从细胞生物学角度观察葛根素对抗酒精诱导骨髓基质细胞成脂分化作用,探讨葛根素对酒精性骨坏死的防治作用。设计:随机对照实验。单位:郑州大学第一附属医院骨科和郑州大学基础医学院生物化学与分子生物学教研室。材料:实验于2000-04/2002-12在郑州大学基础医学院生物化学与分子生物学教研室实验室完成。选用清洁级健康昆明小鼠50只,6～8周龄,雌雄不拘。获取双侧股骨骨髓细胞,细胞接种密度1.5×106/cm2,置入6孔及24孔培养板内,随机分组,每孔作为1个样本,每组为24个样本。方法:分离培养小鼠骨髓基质细胞,随机分为3组:模型组(给予乙醇0.09mol/L处理细胞),实验组(乙醇0.09mol/L和葛根素终浓度为0.01g/L),对照组(无乙醇和葛根素)。苏丹Ⅲ染色,光镜下脂肪细胞计数;测定细胞内三酰甘油含量、碱性磷酸酶活性和细胞培养液中的骨钙素含量。主要观察指标:①3组小鼠骨髓基质细胞分化为脂肪细胞结果。②3组小鼠骨髓基质细胞内三酰甘油含量。③3组小鼠骨髓基质细胞内碱性磷酸酶活性值。④3组细胞培养液中骨钙素含量。结果:①处理细胞并培养21d后,实验组、对照组中脂肪细胞均比模型组显著为少。模型组中脂肪细胞数是实验组的8.9倍,是对照组的15.6倍[(319.17±19.92),(35.92±23.77)(20.42±12.15)个/cm2,P<0.001]。②处理细胞并培养21d后,实验组和对照组中三酰甘油含量均明显低于模型组[(4.15±1.92)和(3.42±1.60),(11.55±4.42)μg/孔,P<0.001]。③处理细胞并培养12d后,实验组和对照组细胞内碱性磷酸酶活性均明显高于模型组[(9.51±2.96),(11.18±3.11),(4.84±2.23)μkat/g,P<0.001]。④处理细胞并培养14d后,实验组和对照组培养液中的骨钙素含量分别是模型组的2.2倍和2.7倍,与模型组间的差异均非常显著[(11.11±4.57),(13.43±5.29),(4.95±2.31)μg/g,P<0.001]。结论:葛根素能够抑制酒精诱导骨髓基质细胞分化为脂肪细胞,维持其成骨分化,可能预防骨坏死。     

供体特异输注诱导同种异体小鼠移植心脏免疫耐受的研究

目的 :研究供体特异输注诱导同种异体小鼠移植心脏免疫耐受。方法 :建立同种异体小鼠移植心脏模型 ,实验组经下腔静脉输注供体小鼠脾细胞 ,观察小鼠移植的心脏存活天数和病理改变。结果 :实验组移植的心脏存活时间为 ( 15 2± 4 4)d ,对照组 ( 7 8± 1 3)d ,两组有显著性差异 (P <0 0 1)。组织学改变 :对照组可见大量淋巴细胞、单核细胞浸润 ,组织充血水肿 ,心肌变性、坏死、出血 ,病理分级为Ⅳ级。实验组可见多处炎细胞浸润病灶和心肌变性 ,病理分级为Ⅲ级。结论 :经下腔静脉输注供体脾细胞可诱导同种异体小鼠心脏移植免疫耐受     

LY294002对小鼠体内调节性T细胞的影响

背景:研究已证实,磷酸肌醇3激酶特异性阻滞剂LY294002在体外具有剂量依赖性抑制细胞活性的作用,可以用于诱导肿瘤细胞凋亡,但LY294002对正常免疫系统的影响尚不清楚.目的:观察抗肿瘤药物LY294002对C57BU6小鼠体内调节性T细胞的影响.设计、时间及地点:以调节性T细胞比例为观察对象,分组对比实验,于2008-08/12在广州南方医科大学珠江医院移植免疫研究所完成.材料:14只8周龄SPF级C57BL/6小鼠随机分成实验组与对照组,每组7只.LY294002购自广州英韦创律公司.方法:实验组腹腔注射LY294002溶液200 μL(0.1 mg),对照组给予等体积PBS.1 0 h后后眼眶静脉从采血,并分离脾脏、胸腺,制备单细胞悬液,流式细胞术检测小鼠外周血、脾细胞和胸腺细胞中的CD4+CD25high T细胞.主要观察指标:小鼠外周血、脾细胞和胸腺细胞中CD4+CD25high T细胞的比例.结果:实验组小鼠外周血、脾脏、胸腺中CD4+CD25high T细胞比例分别为(0.787±0.036)%,(0.921±0.063)%,(1.230±0.131)%,对照组小鼠外周血、脾脏、胸腺中CD4+CD25high T细胞比例分别为(0.640±0.030)%,(0.639±0.046)%,(0.857±0.077)%.实验组和对照组比较差异有显著性意义(P＜0.01,P＜0.05).结论:腹腔注射LY294002可提升小鼠体内调节性T细胞的比例,提示其有可能会抑制机体免疫反应,从而不利于治疗.     

C反应蛋白、肿瘤坏死因子、白细胞介素及胰岛素样生长因子检测在2型糖尿病患者中的意义

目的探讨C反应蛋白(CRP)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)及胰岛素样生长因子-1(IGF-1)检测在2型糖尿病患者中的意义。方法选取2013年2月至2015年3月在甘肃省平凉市人民医院就诊的2型糖尿病患者患者60例为观察组,选取该院同期体检健康者60例为对照组,检测两组空腹血糖(FBG)、餐后2h血糖(2hBG)、空腹胰岛素(FINS)、糖化血红蛋白(HbA1c)水平及CRP、TNF-α、IL-6、IGF-1的变化,分析CRP、TNF-α、IL-6、IGF-1与FBG、FINS、HbA1c的相关性。结果观察组FBG、2hBG、HbA1c水平显著高于对照组,差异具有统计学意义(P0.05)。观察组FINS水平显著低于对照组,差异有统计学意义(P0.05)。观察组CRP、TNF-α、IL-6、IGF-1水平分别为(8.46±2.45)mg/L、(18.56±4.23)ng/L、(13.53±3.24)pg/L、(125.33±23.14)ng/L,显著高于对照组CRP、TNF-α、IL-6、IGF-1水平,分别为(3.23±1.02)mg/L、(11.25±3.01)ng/L、(7.24±1.78)pg/L、(98.45±18.56)ng/L,差异有统计学意义(P0.05)。CRP、TNF-α、IL-6与FBG、FINS、HbA1c呈正相关;IGF-1与FBG、HbA1c呈负相关。结论通过检测CRP、TNF-α、IL-6及IGF-1的水平可为2型糖尿病的诊断提供依据并为2型糖尿病患者的治疗提供思路。     

定量CT评估1型糖尿病患者股骨骨密度和骨强度

[目的] 采用定量CT评估1型糖尿病患者股骨骨密度和骨强度,并探讨其与胰岛素样生长因子-1(IGF-1)的相关性.[方法] 选择本院收治的25例1型糖尿病患者为观察组,选择同期在本院健康体检的25例健康者为对照组.通过三维定量CT计算股骨不同部位体积骨密度(vBMD)和骨强度,检测血清IGF-1、骨特异性碱性磷酸酶(B-ALP)、骨钙素(sOC)、Ⅰ型前胶原氨基端肽(PⅠNP),分析1型糖尿病患者股骨骨密度和骨强度与IGF-1之间的相关性.[结果] 与对照组比较,观察组股骨颈皮质vBMD明显降低[(582.5±27.7) mg/cm3 vs (558.1± 31.9) mg/cm3,P<0.05] ;股骨粗隆总vBMD、皮质厚度和皮质横截面积显著降低[(258.4 ± 42.9) mg/cm3 vs(223.7± 27.3)mg/cm3;(3.3 ± 0.7)mm vs(2.8 ± 0.5)mm;(5.3 ± 1.2)cm2 vs (4.3 ± 0.5)cm2;均P<0.01] .与对照组比较,观察组屈曲比(BR)显著增加[(10.8 ±1.8) vs(12.9±1.9), P<0.01] .观察组和对照组血清B-ALP、sOC、PⅠNP水平比较,差异无统计学差异(P>0.05).血清IGF-1与1型糖尿病患者股骨颈总vBMD呈显著正相关性(r=0.48;P<0.05).[结论] 定量CT发现1型糖尿病患者股骨粗隆间vBMD、皮质横截面积和皮质厚度较低,血清IGF-1水平可显著影响1型糖尿病患者股骨颈总vBMD.     

荷载自体白血病抗原的DC-CIK细胞预防急性髓细胞性白血病自体造血干细胞移植后复发的临床研究

目的探讨荷载自体白血病抗原的树突状细胞-细胞因子诱导的杀伤细胞(DC-CIK)细胞对于预防急性髓细胞性白血病(AML)自体造血干细胞移植后复发的作用。方法实验组:选取初治AML CR1期、自愿接受自体造血干细胞移植联合荷载自体白血病抗原的DC-CIK细胞治疗的患者32名,采用常规预处理方案,于移植+5—+10 d将荷载自体白血病抗原的DC-CIK细胞回输患者,采用流式细胞术、ELISA等方法测定DC-CIK细胞各指标情况;对照组:选取同期未采用DC-CIK细胞治疗的AML CR1期移植患者21名;观察、比较2组患者造血恢复情况、移植相关不良反应,评估3年总生存率。结果实验组患者CIK经荷载自体白血病抗原的DC致敏后,CD3+CD8+和CD3+CD56+细胞比例分别为(80.1±3.3)%和(37.1±4.5)%,较对照组[(56.1±3.8)%和(18.1±3.1)%]均有所上调(P<0.05),分泌IFN-γ的水平为(3 985.4±223.1)pg/ml,较对照组[(1 688.5±162.1)pg/ml]明显升高(P<0.05),除一过性发热、寒颤外,无其他不良反应。造血恢复情况、移植相关不良反应2组差异无统计学意义,自体造血干细胞移植后经DC-CIK细胞输注,3年的总生存率为75.0%(24/32),较同期未使用荷载白血病抗原DC-CIK细胞的自体造血干细胞移植患者的生存率明显提高。结论荷载自体白血病抗原的DC-CIK细胞用于预防AML自体造血干细胞移植后复发是安全和有效的。     

人诱导性多能干细胞的培养及鉴定

目的建立稳定的人诱导性多能干细胞（iPS细胞）培养体系。方法取第3．5代的小鼠胚胎成纤维细胞．丝裂霉素C处理后用作饲养层。人iPS细胞接种于饲养层上生长,胶原酶消化或机械法传代。倒置显微镜下观察iPS细胞生长状态：观察拟胚体形成能力;RT—PCR检测iPS细胞多能性基因的表达情况。结果（1）小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）为贴壁生长细胞,呈梭形或多角形。细胞增殖旺盛。（2）生长在饲养层上的人iPS细胞呈典型的克隆状生长。克隆呈圆形或椭圆形．边界清晰。克隆内细胞排列紧密,细胞体积小,核大,细胞核／质比高。RT—PCR结果显示人iPS细胞强表达多能性基因Oct4,Nanog,Sox2;去除饲养层后悬浮培养能形成拟胚体（EB）。结论本实验的培养体系适合人iPS细胞的培养,人iPS细胞能稳定增殖,保持自我更新及分化潜能。     

支原体肺炎患儿外周血Th17,Treg细胞亚群和细胞因子表达及CRP,PCT水平的研究

目的 探讨外周血Th17,Treg细胞亚群和细胞因子在儿童支原体肺炎发生发展中的变化以及检测外周血C-反应蛋白(CRP)和降钙素原(PCT)的临床意义。方法 收集2017年1月～2018年8月来解放军第901医院儿科确诊的支原体(MP)感染性肺炎患儿75例作为实验组,纳入标准为病程均在一周以内并且排除其他疾病,ELISA方法检测血清特异性MP-IgM≥1:40,选择同期健康体检儿童75例作为对照组。采用流式细胞术检测两组外周血Th17和Treg细胞亚群比例,采用ELISA方法检测两组外周血细胞因子IL-17和IL-10的表达水平,采用散射比浊法检测两组血清CRP水平,采用化学发光法检测两组血清PCT水平,实验组治疗一周后再次抽血检查CRP和PCT水平。结果 Th17细胞,Treg细胞,IL-17,IL-10,CRP和PCT水平均采用均数±标准差((-overx)&#177;s)表示,实验组检测结果依次为3.35%±1.26%,3.39%±1.04%,19.12±2.96 pg/ml,8.94±0.87 pg/ml,21.58±2.78 mg/L和0.32±0.05 ng/ml,对照组检测结果依次为1.60%±0.29%,7.48%±1.28%,9.59±2.06 pg/ml,22.16±1.09 pg/ml,2.41±0.39 mg/L和0.05±0.01 ng/ml,实验组治疗一周后CRP和PCT检测结果依次为7.38±0.46 mg/L,0.15±0.02 ng/ml。实验组外周血Th17细胞的百分比、IL-17的表达水平、CRP和PCT水平均高于对照组,差异均具有统计学意义(t值分别为3.03,3.36,6.54,5.16,均P<0.05); 实验组外周血Treg细胞的百分比和IL-10的表达水平均低于对照组,差异具有统计学意义(t值分别为3.68,4.07,均P<0.05); 与治疗前相比,实验组治疗一周后外周血CRP和PCT水平均降低,差异具有统计学意义(t值分别为4.06,3.15,均P<0.05)。结论 支原体肺炎患儿外周血Th17细胞增加,Treg细胞减少,TH17/Treg比例失衡,由其分泌的细胞因子表达异常,可能在儿童支原体肺炎的发生发展中起着重要作用。联合检测CRP和PCT在支原体肺炎患儿病情观察和疗效判断上具有重要价值。     

肺腺癌细胞总RNA转染树突状细胞诱导特异性CTLs的体内抗肿瘤效应研究

目的探讨人肺腺癌细胞总RNA转染的树突状细胞(DCs)诱导抗原特异性的细胞毒T细胞(CTLs)对移植瘤裸鼠的抗肿瘤作用。方法 1)从外周血单个核细胞(PBMCs)中诱导DCs,提取人肺癌细胞A549总RNA,用于电转染DCs,转染后的DCs与自体T细胞混合培养,诱导抗原特异性的CTLs;2)实验分为转染RNA的DCs组、转染PBS的DCs组和未转染DCs组,流式细胞术(FCM)鉴定T细胞表型,3H-TdR掺入检测T细胞增殖能力;3)建立肺癌细胞株A549荷瘤裸鼠模型,过继回输CTLs,比较肿瘤体积,计算抑瘤率,免疫组化法检测移植瘤组织中Bax、Bcl-2、COX-2和VEGF的表达,并用全自动图像分析系统分析其平均光密度值(MOD)。结果 1)转染RNA的DCs和自体T细胞共育诱导的CTLs的CD8+T细胞大幅度上调,表达率(79.29±2.18)%明显高于转染PBS的DCs组CD8+T细胞(26.10±1.76)%和未转染DCs组CD8+T细胞(25.58±2.73)%(P0.05);2)转染RNA的DCs显著刺激了自体T细胞增殖,3H-TdR渗入所得的cpm值:阳性对照组为17 105±130,转染RNA的DCs组为7 759±493,转染PBS的DCs组为2 611±161,未转染DCs组为2 248±332(P0.05);3)成功建立肺癌裸鼠移植瘤模型,实验结束时,转染RNA组裸鼠荷瘤体积(540±99)mm3明显小于转染PBS组(1 572±147)mm3和未转染组(2 043±395)mm3(P0.05);4)转染RNA组和转染PBS组的抑瘤率分别为68.53%和8.62%;5)转染RNA的DCs诱导的CTLs能显著上调Bax的表达(转染RNA组MOD值为335±105),显著下调Bcl-2、COX-2和VEGF的表达(转染RNA组MOD值分别为146±47、122±33和128±58)。结论人肺腺癌细胞总RNA转染DCs诱导的抗原特异性CTLs对肺腺癌裸鼠移植瘤的生长产生抑制作用。     

RNA干扰survivin基因在EC109细胞中作用的体内实验研究

目的研究RNA干扰survivin基因对EC109细胞体内增殖的影响。方法构建siRNA-survivin真核表达载体,转染EC109细胞,筛选得到稳定细胞克隆。同时设非特异siRNA载体转染为对照;通过裸鼠移植瘤模型的成瘤时间、瘤结节重量,比较各组细胞在体内的增殖速度;免疫组织化学染色检测移植瘤的细胞凋亡。结果siRNA-survivin转染的EC109细胞组在裸鼠体内成瘤时间为(8.86±1.069)d,高于其它各组;平均瘤重为(0.32±0.12)g,低于其它组,均有显著差异(P<0.05);TUNEL法细胞凋亡检测,siRNA-survivin转染的EC109细胞组的凋亡指数为(10.52±4.35),高于其它组,具有显著性差异(P<0.05);结论RNA干扰survivin基因具有抑制人食管癌EC109细胞体内增殖的作用,诱导细胞的凋亡是其重要作用机制。     

超声辐照血卟啉单甲醚和声诺维协同杀伤MDA-MB-231细胞的实验研究

目的探讨超声辐照中血卟啉单甲醚(HMME)和声诺维(SonoVue)杀伤人乳腺癌细胞株MDA-MB-231细胞的协同作用。方法将处于对数生长期的MDA-MB-231细胞分为8组(M组、H组、H+M组、U组、U+M组、U+H组、U+H+M组和对照组)。采用优化后的实验参数,以50Hz脉冲波照射60s,以MTT法检测照射后的MDA-MB-231细胞存活率,观察细胞形态学改变。结果 M组、H组、H+M组、U组、U+M组、U+H组、U+H+M组及对照组中MDA-MB-231细胞存活率分别为(91.90±1.41)%、(95.28±3.30)%、(90.76±4.01)%、(77.59±1.52)%、(52.12±2.90)%、(46.72±1.35)%、(31.47±1.48)%和(99.95±0.66)%。U+H+M组细胞存活率与其他各组差异均有统计学意义(P均<0.01)。结论超声辐照时,SonoVue和HMME能够相互协同杀伤MDA-MB-231细胞。