密度梯度离心法加上游法处理精液对精子运动参数及形态学的影响——附102份标本分析

目的:了解密度梯度离心法加上游法处理精液对精子各运动参数和形态学的影响.方法:采用密度梯度离心法加上游法处理102份男性精液标本,应用计算机辅助精液分析系统软件分析精子各项运动参数,并运用改良巴氏染色法观察精子形态.结果:经密度梯度离心法加上游法处理后,精子活动率、活动力、曲线速度、直线速度等运动参数值均明显提高(均为P＜0.01).经该法处理后,畸形精子百分率、精子畸形指数均明显降低(均为P＜0.01).结论:密度梯度离心法加上游法可使精子的运动参数及形态学均得到明显改善,是较好的体外处理精液方法.     

两种精液优化法在宫腔内人工授精中的应用效果分析

目的探讨密度梯度离心法与直接上游法两种方法优化处理精液行宫腔内人工授精(IUI)对精子动态参数和妊娠率的影响。方法根据精液检查结果将IUI妇女分为2组,A组:采用直接上游法;B组:采用密度梯度离心法,优化处理精液后行IUI。比较两种方法处理后的精子检测结果与妊娠结局。结果两种方法处理前、后精子密度、活率、活力(a+b)、前向运动精子总数(PTMS)的差异具有统计学意义(P<0.05);两种方法处理后,各项指标的差异无统计学意义(P>0.05),两组间临床妊娠率的差异也无统计学意义(P>0.05)。结论两种方法处理精液均可改善精子动态参数,但行IUI后临床妊娠率差异无统计学意义(P>0.05)。     

精子自发顶体反应率与体外受精胚胎质量的相关性研究

目的探讨精子自发顶体反应率以及两种精子处理方法与体外受精(IVF)胚胎质量的相关性。方法将200例接受IVF治疗的男性随机分为观察组和对照组,每组100例。对照组患者精液采用密度梯度离心法进行处理,观察组患者采用密度梯度离心法联合上游法优化精子,两组均进行常规IVF授精。比较两组间受精率和优胚率,分析观察组精子自发顶体反应率与胚胎质量的关系。结果观察组患者受精率明显高于对照组患者,差异有统计学意义(P0.05),且精子自发顶体反应率与受精率呈负相关(r=-0.890,P0.05)。观察组患者优胚率明显高于对照组,差异有统计学意义(P0.05),且精子自发顶体反应率与优胚率呈负相关(r=-0.647,P0.05)。结论密度梯度离心联合上游法有助于分离自发顶体反应率更低的精子,从而提高IVF成功率,而精子自发顶体反应率在预测胚胎质量方面具有一定的临床应用价值。     

密度梯度离心法优选精液22周期宫腔内人工授精的临床分析

目的 探讨密度梯度离心法优选精液行IUI的临床疗效.方法 采用密度梯度离心法制备精液行IUI 22个周期,并对制备前后的精液进行常规分析、改良巴氏染色、混合抗球蛋白反应实验.结果 洗涤后的精子,其密度、活力、精子正常形态比率明显升高,精子畸形指数及精子包被抗体阳性率明显下降.结论 密度梯度离心法优选精液行IUI可增加受孕机率.     

体外受精-胚胎移植中精子形态与胚胎质量的相关研究

目的分析体外受精-胚胎移植(IVF-ET)中男性精液精子形态与胚胎质量的相关性。方法选择行IVF-ET助孕治疗的112对不孕夫妇,以密度梯度离心法处理男方精液后运用Diff-Quick方法染色并按世界卫生组织精子形态学标准进行严格精子形态学分析,于体外受精后观察受精情况,受精后第3天观察胚胎卵裂情况。结果正常形态精子率、头部畸形精子率、中段畸形精子率及尾部畸形精子率与胚胎质量间均无显著相关性,差异均无统计学意义(P>0.05)。结论精子形态与胚胎质量无明显相关性。     

两种精液处理方法对宫腔内人工授精妊娠率影响的比较

目的:探讨两种精液处理方法对宫腔内人工授精(IUI)妊娠率的影响。方法:回顾性分析292个周期IUI(136例患者)受孕结果。作者对门诊不孕患者选择一种精液处理方法,A组126个周期采用直接上游法处理精液,B组166个周期采用Isolate密度梯度离心法。结果:两种方法处理后精液在密度、活力上差异有显著性,P<0.05,但两组间的临床妊娠率相似,P>0.05。结论:直接上游法和Isolate密度梯度离心法处理精液作IUI得到的临床妊娠率是相似的,两者间差异无显著性。     

迟缓液化精液的两种体外处理方法的比较研究

目的 比较加糜蛋白酶后上游法和梯度离心法处理液化延长精液的精子质量。方法 30例正常精液和34例液化延长精液均取自本室门诊精液常规检测,所有标本量均≥2ml。常规检测后均分为两份,一份采用加糜蛋白酶后上游法处理,另一份用Percoll梯度离心法处理,显微镜下观察精子的活动力、活动率及24小时存活率。结果 除不液化伴高粘度的精液外,两种方法处理后镜下观测的精子参数经统计学处理差异无显性。结论 对液化延长精液采用加糜蛋白酶后上游法方便、有效。     

宫腔内人工授精中应用上游法和密度梯度离心法的系统评价

背景:精子体外优选方法很多,最常见的是上游法和密度梯度离心法.采用何种方法来减少体外处理过程对精子的不良刺激,优选出具有良好受精潜能的精子,目前尚无定论.目的:系统评价上游法和密度梯度离心法在宫腔内人工授精中的应用,比较两种精子优选法的优劣.方法:计算机检索PubMed、Cochrane Library、EMBASE等数据库,手工检索专业相关期刊,检索时间为1966-01/2009-02.纳入关于两种精液优选法在宫腔内人工授精中应用的随机对照试验或半随机对照试验,评价纳入研究的方法学质量,并提取有效数据用RevMan 5.0.软件进行Meta分析.结果与结论:纳入6个研究,包括4个随机对照试验和2个半随机对照试验,共486例患者,1099个周期(优选精子的次数).Meta分析结果显示,上游法与梯度离心法相比,周期妊娠率[OR=1.11,95%CI(0.8,1.55)]、流产率[OR=0.31,95%CI(0.09,1.04)]、精子密度[WMD=-0.89,95%CI(14.17,12.38)]、精子活力[WMD=2.31,95%CI-7.27,2.65)],4项测最指标差异均无显著性意义.尽管与其他精子优选法相比,上游法与梯度离心法的周期妊娠率较高,但是该系统评价结果还不能提示这两种方法在宫腔内人工授精应用中何者临床效果更好.建议今后进行更多高质量的随机双盲对照试验为临床提供最佳证据,并且增加处理前后精子的质量对比,包括精子活力、精子密度以及精子功能等指标测量,以全面考察两种方法的优劣.     

改良上游法在宫腔内人工授精的临床观察

目的:研究人工授精时对精子损伤最小的优化技术。方法:把精子密度≥20×106/mL,活率≥50%的精液随机分为两组,一组采用常规上游法,精液孵育30 m in,取上游液离心后收集精子;另一组采用改良上游法,精子孵育3~7 m in,静置60~80 m in,收集试管底部精子,两组收集的精子均用于作人工授精。结果:常规上游法收集精子的密度显著高于改良上游法收集精子的密度,但改良上游法的妊娠率高于常规上游法。结论:改良上游法的优点是减少共同孵育时间,减少精浆中畸形精子、活力弱的精子上游的比例等,使精子的受精能力提高。     

几种精液处理方法在宫腔内人工受精中的选择

随着辅助生殖技术的迅速发展,精液体外处理的方法也越来越多,每一种方法都有其优缺点。洗涤法是精子经过洗涤可有效去除精液中的前列腺素,去获能因子,抗精子抗体等,使精子获能,提高精子受精能力,但不能很好去除白细胞、细胞碎片、细菌及死精子等。标准上游法是利用精子具有主动游过液体界面进入不同培养液的能力,而达到自行与死精、凝集精子、畸形精子和细胞杂质分离的目的。获得的精子活力、活率较高,达90%以上。但却存在精子回收率较低的缺点,仅适用于精子活动力、密度均正常的患者。而Isolate密度梯度离心法则是利用不同成熟阶段的精子和各种细胞成分各自的密度差异,使之在不同浓度的溶液中,在离心力作用下停留在不同密度的界面上,达到较好的分离目的,处理后精子数回收较高,处理的时间短,但由于离心时间长,可能对精子造成物理损伤如顶体的松动或不完整等,处理后死精子相对标准上游法多,回收的精子活动率较标准上游法低,可能引起精子受精功能下降等[1]。     

精子优选和精液冷冻对顶体完整率的影响

目的:探讨精子优选和精液冷冻对精子顶体完整率的影响。方法:16例精液样本采用Percoll和上游两种方法优选,13例精液标本采用快速和缓慢冷冻处理,采用巴氏染色法分析精子顶体完整率。结果:Percoll和上游两种方法优选后精子顶体完整率均明显高于优选前(P<0.05),两种优选方法间顶体完整率比较差异无显著性(P>0.05)。冷冻后与冷冻前顶体完整率比较差异无显著性(P>0.05),甘油-卵黄-枸橼酸钠(GYC)和甘油两种冷冻保护剂对顶体完整率的影响差异无显著性(P>0.05),速冻和缓慢冷冻对精子顶体完整率的影响差异亦无显著性(P>0.05)。结论:Percoll和上游法优选后精子顶体完整率较优选前明显改善。冷冻过程对顶体完整率无明显影响,速、缓冷冻方法和冷冻保护剂类型对顶体完整率亦无明显影响。     

Evaluation and comparison of four reticulocyte enrichment procedures

Four reticulocyte enrichment techniques were compared: differential centrifugation, and density gradient centrifugation with phthalate esters, Percoll-Renografin (PR), and silicone oil. The reticulocyte yields were 2.6, 7.4, 13.5, and 13.1 percent, respectively. The differential centrifugation procedure did not separate a statistically significant higher number of reticulocytes than were counted in an unseparated sample. The PR density gradient procedure was the best for our needs because it yielded the highest number of reticulocytes and was the easiest and quickest of the four procedures to perform; however, the method requires a high-speed centrifuge.     

两种分离培养小鼠骨髓来源内皮祖细胞方法的比较

目的 比较密度梯度离心法及全骨髓培养法分离培养内皮祖细胞的差异。方法 取4周雄性近交系C57BL/6J小鼠骨髓,分别使用密度梯度离心法及全骨髓培养法培养,观察细胞贴壁情况和细胞形态,并行DiI acLDL及FITC UEA I双染、vWF、eNOS及细胞表面标志检测。结果 密度梯度离心法培养细胞可形成典型铺路石样改变及形成血管样结构;而全骨髓培养法贴壁细胞形态多样,较多呈长梭形铺展生长,部分细胞呈类圆形及纺锤形。比较两种方法培养细胞摄取DiI acLDL、结合FITC UEA I双阳性率以及vWF、eNOS及细胞表面标志表达阳性率,差别均有统计学意义（P〈005）。应用密度梯度离心法,随着培养时间延长,表达CD34、CD133及FLk 1细胞逐渐增多（P〈005）。结论 密度梯度离心法及全骨髓培养法在EGM 2MV培养体系下均可培养出内皮祖细胞,但密度梯度离心法较全骨髓培养法培养的内皮祖细胞纯度高。     

大鼠骨髓内皮祖细胞的分离培养与鉴定

背景：内皮祖细胞参与血管新生,但其分离、培养、鉴定方法目前并不统一。目的：探索大鼠骨髓内皮祖细胞的分离培养及鉴定方法。方法：使用密度梯度离心法及差速贴壁法联合的方法培养内皮祖细胞,在倒置显微镜下观察细胞生长情况及形态变化,使用Dil标记的乙酰化低密度脂蛋白和FITC标记的荆豆凝集素1双荧光染色、流式细胞仪检测细胞表面抗原CD34、CD133表达情况。结果与结论：培养前4d细胞增殖不明显,第5～10天迅速增殖,并可见细胞集落及线状结构形成。培养第7天的内皮祖细胞具有吞噬Dil标记的乙酰化低密度脂蛋白和FITC标记的荆豆凝集素1的功能。流式细胞仪检测体外培养第10天的细胞,CD133＋细胞占19.2%,CD34＋细胞占28.7%,CD34＋/CD133＋细胞占19.1%。说明密度梯度离心法联合差速贴壁法可在体外有效分离培养大鼠骨髓内皮祖细胞。     

Urine flow cytometer quantification of leukocytes in samples containing a large proportion of lymphocytes

OBJECTIVE: We compared leukocyte counts obtained by cytometric analysis and Fuchs-Rosenthal (FR) chamber counting in different proportions of lymphocytes (Lym%) suspensions and cerebrospinal fluid (CSF). DESIGN AND METHODS: UF-100 (UF) was evaluated. For preparation of cell suspensions, gradient density centrifugation method was used. RESULTS: The regression equation for UF and FR chamber counting of the cell suspensions was y=0.88x+18.8 WBC/microL (r=0.832, n=106). For a few high Lym% samples, markedly underestimated WBC counts were obtained by UF. CONCLUSIONS: Underestimated WBC count is due not to systematic error but to random error. Counts of the "other" population by UF may be useful for detection of underestimated samples.     

两种不同分离方法对羊骨髓间充质干细胞生物活性的影响

背景：近几年关于鼠、兔等小型动物骨髓间充质干细胞的研究较多,如何获得大型动物羊的骨髓间充质干细胞的报道还较少。目的：观察全骨髓培养法和密度梯度离心法对羊的骨髓间充质干细胞生物活性的影响。方法：取健康2月龄的阿勒泰大尾羊,麻醉后于髂后上棘穿刺抽取骨髓,分别采用全骨髓培养法和密度梯度离心法提取羊骨髓间充质干细胞,倒置荧光显微镜观察原代骨髓间充质干细胞的细胞形态及贴壁情况,记录两组细胞首次传代时间,流式细胞仪检测CD44抗原表达,MTT法测定细胞的生长曲线,VonKossa’s染色检测成骨诱导的分化潜能。结果与结论：两种分离方法均能得到较均一的梭形,三角形和多边形的BMSCs,胞核大胞浆丰富,CD44抗原表达阳性。全骨髓培养法较密度梯度离心法的细胞数量较多,传代时间略早。骨髓间充质干细胞诱导培养至第14～21天,两组的VoKossa染色均阳性。其中首次传代全骨髓贴壁法的传代细胞较密度梯度离心法的细胞贴壁较快,活力较好。提示全骨髓培养法是一种简单有效的提取方法。     

大鼠骨髓间充质干细胞体外两种分离方法和培养条件下生物学特点的比较

目的：建立并探讨一种体外分离、培养和扩增骨髓间质干细胞的优化方法。方法：采用密度梯度离心法和全骨髓贴壁法分离培养大鼠骨髓干细胞,应用倒置显微镜和免疫组化法观察和鉴定骨髓间质干细胞。结果：大鼠骨髓干细胞呈均一的梭形成纤维细胞样,形成集落样生长,显微结构表现出干细胞特征;免疫组化显示CD14、CD45阴性,CD44、CD90阳性。与密度梯度离心法比较,贴壁法获得的骨髓干细胞活性高,增殖力强,克隆形成早,传代时间短。结论：全骨髓贴壁法和密度梯度离心法均可获得高纯度贴壁生长的骨髓干细胞,其中全骨髓贴壁法方法简单易行,骨髓于细胞增殖快,活性好,传代力持久,是一种有实用价值的骨髓干细胞培养方法。     

离心管贴壁细胞对人脐血单个核细胞体外培养成功率的影响

背景：在常规的脐血间充质干细胞密度梯度离心分离过程中,离心管壁有大量单个核贴壁细胞,这些早期的贴壁细胞是否与脐血间充质干细胞的体外培养成功率低存在一定的联系呢？目的：比较4种方法分离人脐血单个核细胞的体外培养成功率,观察离心管贴壁细胞对人脐血单个核细胞体外培养成功率的影响。方法：取足月健康顺产新生儿脐血36份,随机分为4组,每组9份,于采集后6h内分别采用甲基纤维素沉降法（A组）、密度梯度离心分离法（B组）、甲基纤维素联合密度梯度离心分离法（C组）、甲基纤维素联合改良密度梯度离心分离法（D组）分离出单个核细胞,锥虫蓝染色检测细胞活力,用细胞计数板进行细胞计数,调整细胞浓度为1×109L-1～2×109L-1,接种于含体积分数为10%胎牛血清的低糖DMEM培养基中培养和传代,相差显微镜下观察脐血单个核细胞的形态。收集第3代脐血单个核细胞,采用细胞计数板进行计数,计算扩增倍数,采用流式细胞仪鉴定细胞免疫表型。结果与结论：36份脐血中,成功分离33份脐血单个核细胞,B组有3份分离失败。33份中共22份原代培养中出现大量贴壁细胞,其中A组8份,B组2份,C组5份,D组7份。9份（27%）培养出能融合且可稳定传代的成纤维样细胞,其中A组3份,B组0份,C组1份,D组5份。4组脐血单个核细胞在原代培养5～7d后均可见数量不等的贴壁细胞,呈梭形成纤维样细胞或（和）圆形巨核样细胞。A组与D组于原代培养三四周可见成纤维样细胞集落形成,细胞形态与骨髓间充质干细胞相似,呈较均一的长梭形,可稳定培养至60～90d形态无明显变化。流式细胞仪免疫检测,第3代脐血单个核细胞不表达或弱表达CD34、CD45和CD106等造血干细胞和内皮细胞标志,但显著表达CD29、CD105等间充质干细胞表面标志。结果显示离心管贴壁细胞可显著提高脐血单个核细胞的体外培养成功率,而甲基纤维素联合改良的密度梯度离心分离法,可充分回收离心管贴壁细胞,利于脐血单个核细胞的体外扩增和稳定传代。     

全骨髓贴壁并差速传代分离纯化大鼠骨髓间充质干细胞:与密度梯度离心法的比较

背景:目前国内外分离纯化骨髓间充质干细胞有两种主要方法;密度梯度离心法及全骨髓贴壁法,前者步骤较复杂,后者简单易操作,但纯化效果不理想.目的:在全骨髓贴壁分离骨髓间充质干细胞基础上,并用差速传代消化法,建立大鼠骨髓间充质干细胞体外分离培养纯化方法.方法:全骨髓贴壁培养法分离并差速消化传代大鼠骨髓间充质干细胞,利用间充质干细胞在消化传代过程中较其他骨髓细胞消化悬浮速度快,以及贴壁快的特点,代替密度梯度离心操作来分离纯化间充质干细胞,对其形态学特征进行观察,并与密度梯度离心法比较两种分离培养法的细胞生长增殖情况;观察碱性磷酸酶及油红染色情况,验证骨髓间充质干细胞的分化能力;检测细胞表面标记物,验证免疫特性及检测其纯度.结果与结论:全骨髓贴壁培养法分离并差速传代大鼠骨髓间充质干细胞,流式细胞鉴定、成骨成脂肪培养结果显示其细胞免疫特性、纯度、分化能力与密度梯度离心法无显著差异,但细胞活力,增殖能力有明显提高.