冷冻载体对扩张期囊胚解冻结局的影响

背景:囊胚的冷冻复苏对人类辅助生殖技术的发展具有重要意义,合适的冷冻载体可以降低冷冻毒性提高冷冻效率,是改善囊胚冷冻复苏结局的研究热点之一。目的:观察不同冷冻载体对昆明小鼠扩张期囊胚玻璃化冷冻解冻结局的影响。方法:以新鲜昆明小鼠扩张期囊胚作为对照组,随机选取同期小鼠胚进行玻璃化冷冻解冻,冷冻前使用激光仪行人工皱缩,使用玻璃化法进行冷冻和解冻,按实验载体不同分为冷冻环组、闭合拉细麦管组和自制麦管叶片组;冷冻环组和自制麦管叶片组投入液氮前与冷冻保护剂接触时间<40s,40-60s和60-90s;解冻后囊胚使用胚胎囊期培养基添加10%血清替代品进行微滴培养。比较解冻后组间囊胚丢失率、囊胚复苏率和培养24h囊胚孵出率。结果与结论:相比闭合拉细麦管组,冷冻环组和自制麦管叶片组的囊胚丢失率降低,胚胎复苏率增高(P<0.05),各冷冻组复苏囊胚培养24h孵出率均低于对照组(P<0.05)。使用冷冻环载体和自制麦管叶片载体冷冻解冻囊胚,投入液氮前与冷冻保护剂接触时间90s内不同时间胚胎复苏率和孵出率的比较差异无显著性意义。结果说明冷冻环载体和自制麦管叶片载体用于昆明小鼠扩张期囊胚玻璃化解冻复苏的效果较好。     

不同玻璃化冷冻保护剂对早卵裂期小鼠胚胎生存发育的影响

目的评价四种玻璃化冷冻保护剂冷冻早卵裂期胚胎效果,以及复苏后胚胎的存活率及体外继续发育能力。方法以小鼠为实验动物,采用玻璃化冷冻方法,比较观察EFS30,EFS40,EDFS30和EDFS40四种玻璃化冷冻溶液对小鼠4-细胞胚胎冷冻解冻后胚胎的存活率和囊胚形成率的影响。结果 EDFS30溶液冷冻小鼠4-细胞胚胎,解冻后胚胎存活率为82.9%,囊胚形成率为48.3%,而其它三种玻璃化冷冻溶液的胚胎存活率和囊胚形成率分别是:EFS30为65.8%和34.3%;EFS40为64.7%和31.2%;EDFS40为68.3%和37.8%。EDFS30的冷冻效果显著高于其它三种玻璃化冷冻溶液(P<0.05)。结论 EDFS30是一种冷冻早卵裂期小鼠胚胎有效的玻璃化冷冻保护剂。     

不同冷冻保护剂和冷冻方法对小鼠胚胎发育的影响

目的 评价不同冷冻保护剂和不同冷冻方法对小鼠2-细胞胚胎发育的影响。方法 采用丙二醇（PROH）、乙烯乙二醇（EG）、二甲基亚砜（DMSO）和甘油（G）4种不同冷冻保护剂,慢速冷冻、Vit-Master玻璃化冷冻两种冷冻方式冷冻小鼠2-细胞胚胎,观察胚胎的成活率。结果 采用慢速冷冻方式冷冻小鼠2-细胞胚胎时,以PROH为冷冻保护剂的胚胎成活率、囊胚形成率、囊胚孵出率显著高于以DMSO、G为冷冻保护剂的结果（P〈0.05）,而以DMSO、G、EG为冷冻保护剂的结果比较差异无显著性意义（P〉0.05）;采用Vit-Master玻璃化冷冻方式冷冻小鼠2-细胞胚胎时,以EG为冷冻保护剂的胚胎成活率、囊胚形成率、囊胚孵出率显著高于以PROH、DMSO、G为冷冻保护剂的结果（P〈0.05）,而以PROH、DMSO、G为冷冻保护剂的结果比较差异无显著性意义（P〉0.05）。结论 PROH是慢速冷冻小鼠2-细胞胚胎理想的冷冻保护剂;EG是Vit-Master玻璃化冷冻小鼠2-细胞理想的冷冻保护剂,有可能替代慢速冷冻法。     

玻璃化冷冻对胚胎体内外发育潜能的影响

目的观察新鲜8-细胞胚胎和玻璃化冷冻复苏8-细胞胚胎在囊胚形成率、囊胚孵出率及胚胎种植率、小鼠出生率的差异,探讨玻璃化冷冻对胚胎体内外发育潜能的影响。方法性成熟期雌鼠（〉6～7周龄）106只,取2-细胞胚胎,培养至6～8细胞胚胎时分为新鲜胚胎进行移植（新鲜移植组）和玻璃化冷冻（玻璃化冷冻组）,2周后复苏移植。2组各取50枚移植前胚胎,体外培养48～72h,观察2组胚胎体外培养发育至囊胚及囊胚孵出情况。新鲜胚胎及复苏后的8-细胞胚胎经1～3h培养,选择外形正常胚胎移植于假孕63～67h的受体母鼠的两侧子宫中,妊娠17～20d自然分娩后记录产仔数,比较2组妊娠率、小鼠出生率。结果新鲜移植组囊胚形成率、孵出率、妊娠率、出生率分别为92%,84%,48.93%,13.16%,玻璃化冷冻组囊胚形成率、孵出率、妊娠率、出生率分别为90%,86%,47.06%,12.62%,2组差异均无统计学意义（P〉0.05）。结论玻璃化冷冻复苏对小鼠胚胎体内外发育潜能无明显影响。     

种属和发育期及不同实验条件对卵裂期胚胎冷冻复苏结局的影响

背景:人卵裂期胚胎冷冻复苏的研究中,不同的实验条件及实验动物模型是否与人类胚胎具有相同的敏感性从而反映出实验方案的优劣值得探讨.目的:观察胚胎种属和发育期及不同冷冻条件对卵裂期胚胎冷冻复苏结局的影响.方法:将人卵裂期胚胎作为对照组,将KM小鼠胚分为2细胞,4细胞,8细胞组.各组胚胎随机采用以下实验方案:①冷冻操作环境温度18～20 ℃、24～26 ℃和37 ℃.②慢速程序化方案、自制straw叶片玻璃化方案和CPS玻璃化方案.③与玻璃化液接触时间< 40 s、40～60 s和60～90 s.各组胚胎比较不同实验条件下胚胎复苏率和培养24 h发育率.结果与结论:①对照组24～26 ℃冷冻操作环境温度复苏率高于37 ℃冷冻操作环境(P < 0.05).②对照组和4细胞鼠胚组采用自制straw叶片玻璃化方案复苏率高于慢速程序化方案(P < 0.05),培养24 h胚胎发育率差异无显著性意义(P > 0.05).③各组胚胎与冷冻保护剂接触不同时间胚胎复苏率差异无显著性意义(P > 0.05).表明卵裂期胚胎玻璃化冷冻复苏效果优于慢速程序化,24～26 ℃操作环境、减少冷冻保护剂剂量和缩短接触时间可改善玻璃化冷冻复苏结局;相同冷冻条件下,胚胎种属和发育阶段对冷冻复苏结局有影响,4细胞鼠胚更适合作为研究人类卵裂期胚胎冷冻复苏的实验模型.     

玻璃化冷冻与程序化冷冻对小鼠MⅡ期的卵母细胞及经单精子卵胞浆注射得到的胚胎发育潜能的影响

目的评估两种冷冻方法对小鼠卵母细胞和单精子卵胞浆注射(ICSI)胚胎发育潜能的影响,以期为辅助生殖领域人卵母细胞的冷冻保存和胚胎发育潜能的研究提供实验依据。方法分别用玻璃化冷冻与程序化冷冻对小鼠MⅡ期的卵母细胞进行冷冻保存,解冻后存活的卵母细胞用于ICSI注射,然后将得到的胚胎体外发育并进行胚胎移植。用卡方和单因素的方差分析进行统计学分析,并比较两种方法冻存的卵母细胞解冻后的存活率,ICSI胚胎的2-细胞率、8-细胞率、囊胚率和妊娠率等。结果采用玻璃化冷冻法冷冻的MⅡ期卵母细胞存活率为81.6%,明显高于程序冷冻法组的70.7%。两组得到的胚胎在2-细胞形成率方面没有差异,但是8-细胞率和囊胚发育率差异均有统计学意义。两组假孕母体的妊娠率(63.6%和50.0%)和幼崽出生率(20.0%和12.4%)均没有统计学差异。结论与程序化冷冻相比,玻璃化冷冻对于小鼠MⅡ期卵母细胞的保存效果较好。解冻后卵母细胞用于ICSI,玻璃化冷冻组的胚胎得到较高的8-细胞率和囊胚发育率。但这两组的囊胚移植得到的妊娠率和出生率没有差异。     

玻璃化冷冻对卵裂期胚胎发育潜能的影响

目的探讨玻璃化冷冻对卵裂期胚胎发育潜能的影响。方法对40例经徐州市妇幼保健院生殖中心实施玻璃化冷冻卵裂期胚胎（玻璃化冷冻组）和41例程序冷冻卵裂期胚胎（对照组）行复苏移植术作为对照,比较两组的复苏胚胎存活率、种植率、临床妊娠率。结果在玻璃化冷冻组的40例中,共复苏胚胎81个,存活胚胎77个,复苏率95.1%,共移植79个胚胎,种植率为30.4%,临床妊娠率为50%;对照组共41例,解冻135个胚胎,复苏后存活87个胚胎,存活率64.4%,种植率为17.9%,临床妊娠率为26.8%。玻璃化冷冻组的胚胎存活率、种植率、妊娠率均显著高于对照组（P〈0.05）。结论玻璃化冷冻和程序冷冻均适于人卵裂期胚胎的冷冻,但玻璃化冷冻法更好的保存了胚胎的发育潜能,能够获得更好的冷冻效率。     

2种冻融方法对人类早期胚胎质量的影响

目的:探讨2种冷冻方法对人类早期胚胎冷冻复苏后胚胎质量的影响.方法:回顾性分析本院胚胎实验室胚胎冷冻复苏资料,依据胚胎冷冻方法不同分为玻璃化冷冻组(130枚)和程序化冷冻组(120枚),分析比较2组胚胎复苏率、复苏胚胎完整率、优质胚胎率、临床妊娠率等数据.结果:玻璃化冷冻复苏组与程序化冷冻组胚胎复苏率分别为100.0%与83.3%,复苏胚胎完整率为96.2%与63.5%.优质胚胎率为76.7%与50.0%,临床妊娠率为54.6%与33.3%,2组比较差异有统计学意义(P＜0.05).结论:玻璃化冷冻技术可简化胚胎冷冻程序,冷冻复苏效果显著.可提高临床妊娠率.     

2种冷冻方法对人早期胚胎冷冻复苏效果比较

目的:比较栽杆玻璃化冷冻法与程序冷冻法对人早期胚胎冷冻复苏的效果.方法:将接受体外受精-胚胎移植患者剩余的Ⅰ～Ⅲ级胚胎进行程序冷冻或栽杆玻璃化冷冻,比较胚胎复苏后的复苏率、优胚率、临床妊娠率、种植率等指标.结果:载杆玻璃化冷冻复苏66个周期,253个胚胎、存活192个(75.89%),复苏后优胚173个(90.10%),移植66个周期,临床妊娠26个周期(39.39%).种植率19.25%,流产2个周期.程序冷冻复苏105个周期,589个胚胎、存活327个(55.52%),复苏后优胚268个(81.96%),移植105个周期,临床妊娠32个周期(30.47%),种植率15.18%,流产4个周期.载杆玻璃化法冷冻后的胚胎复苏率和优胚率明显高于程序冷冻法(P<0.01,P<0.05),临床妊娠率、种植率略高于程序冷冻法(P>0.05).结论:栽杆玻璃化冷冻法是一种有效的胚胎冷冻方法,其复苏率和复苏后优胚率均明显高于传统的程序冷冻法,可以提高胚胎的有效使用.     

激光人工皱缩对单囊胚解冻后移植结局的影响

目的探讨激光人工皱缩对单囊胚解冻后移植结局的影响。方法对2011年12月至2018年12月广东省江门市中心医院生殖医学诊疗中心接受经阴道超声引导下穿刺取卵术及助孕治疗,且行单囊胚移植的不孕症患者进行回顾性队列研究。将508例研究对象分为皱缩组(n=222,囊胚采用激光打孔皱缩后再玻璃化冷冻)和对照组(n=286,囊胚未行皱缩直接玻璃化冷冻),分析冷冻复苏后单个囊胚的发育情况及妊娠结局。结果两组优质囊胚率、临床妊娠率、生化妊娠率、种植率、流产率、异位妊娠率等指标比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。结论在单囊胚玻璃化冷冻中,不论是否行激光人工皱缩均能够获得比较理想的妊娠结局;未行激光人工皱缩的玻璃化冷冻从经济性、安全性上优势更大,建议在单囊胚冻融移植中将其作为首选方案。     

冻融胚胎和冻融囊胚对移植周期和分娩结局影响的比较

背景：自从1983年人类首例冷冻胚胎移植取得成功以来,胚胎冷冻技术已成为人类辅助生殖技术中重要组成部分。对选择冻融胚胎还是选择冻融囊胚移植,各地都有不少争议。 目的：比较解胚胎和囊胚经过低温保存解冻复苏后的分娩结局及新生儿状况。 方法：比较冻融胚胎移植周期1273例和冷冻囊胚移植周期471例两组妊娠率、流产率、异位妊娠率、早产率、平均早产孕周、足月产率、平均足月产孕周、新生儿男女性别比例、出生体质量、出生缺陷等指标。 结果与结论：冻融囊胚解冻周期478例,移植周期471例（其中7例无囊胚移植取消）,妊娠236例,分娩201例,分娩胎数251胎,男孩140个,女孩111个。冻融第3天胚胎解冻周期1280例,移植周期1273例（其中7例无胚胎移植取消）,妊娠415例,分娩343例,分娩胎数431胎,男孩225个,女孩206个。冻融囊胚的妊娠率显著高于冻融胚胎妊娠率。冻融胚胎和囊胚的流产率、异位妊娠率、早产率、平均早产孕周、足月产率、平均足月产孕周、新生儿男女性别比例、出生体质量等差异无显著性意义。冻融胚胎和冻融囊胚移植出生缺陷并未明显增加。结果表明冻融囊胚与冻融胚胎的分娩结局及新生儿状况差异无显著性意义,但冻融囊胚的妊娠结局优于冻融胚胎的妊娠结局。     

移植复苏周期第5日和第6日冻融囊胚发育潜台邑的比较

目的：比较移植复苏周期第5日（D5）、第6日（D6）冻融囊胚对妊娠结局的影响,探讨D5和D6囊胚的发育潜能。方法收集行复苏周期单囊胚移植480个周期及双囊胚移植783个周期的临床资料,按照冻融时胚胎发育的不同阶段分为4组：单囊胚D5移植组（ SET-D5组,255个周期）,单囊胚D6移植组（ SET-D6组,225个周期）,双囊胚D5移植组（ DET-D5组,475个周期）和双囊胚D6移植组（ DET-D6组,308个周期）,比较其妊娠结局。结果 SET-D5组比SET-D6组获得了较高的临床妊娠率（58.8％比35.1％, P＜0.01）和种植率（60.0％比34.2％, P＜0.01）。 DET-D5组的临床妊娠率（69.5％比51.9％, P＜0.01）、种植率（53.4％比34.9％, P＜0.01）也明显高于DET-D6组。对于同一发育时间,无论移植1枚还是2枚胚胎,种植率比较差异无统计学意义（ P均＞0.05）。结论复苏周期移植D5囊胚比D6可以获得更好的妊娠结局, D5胚胎具有更好的发育潜能。     

枸杞多糖对胎儿卵巢组织冷冻保存的影响

背景：抗氧化剂的应用对于提高卵巢组织冻存后的活力起着很重要的作用。目的：通过观察冷冻保存的胎儿卵巢组织异种移植到裸鼠肾被膜下的发育情况,探索枸杞多糖在卵巢组织冷冻保存中的作用。方法：实验分为4组。①新鲜移植组：取材后的新鲜胎儿卵巢组织直接进行移植。②冻存对照组：冷冻保护液为基液。③β-巯基乙醇组：冷冻保护液为基液添加100μmol/Lβ-巯基乙醇。④枸杞多糖组：冷冻保护液为基液添加400mg/L枸杞多糖。对冷冻复温后的胎儿卵巢皮质块进行祼鼠的肾被膜下移植,并于移植后12周取材。结果与结论：各组在移植物的存活率上差异无显著性意义（P〉0.05）。在卵泡计数上冷冻对照组最低（P〈0.05）。在卵泡的存活率上,各组间差异均有显著性意义,其中以冷冻对照组最低,枸杞多糖组最高。β-巯基乙醇组和枸杞多糖组卵巢超微结构较冷冻对照组保存的好。提示400mg/L的枸杞多糖和100μmol/L的β-巯基乙醇有利于卵巢组织的冷冻保存,并可显著提高冷冻卵巢组织移植后的存活率。     

三种方法构建去细胞肌肉生物支架：组织学和生物力学比较

背景：目前构建去细胞肌肉生物支架的方法有化学方法、物理冻融法和冷冻法。目的：比较化学方法、物理冻融法和改良化学方法构建去细胞肌肉生物支架组织学和生物力学差异。方法：将6只SD大鼠竖脊肌截成36段,随机分3组（n=12）,分别采用化学方法、物理冻融方法、改良化学方法构建去细胞肌肉生物支架。将荧光标记的骨髓间充质干细胞接种于3组支架上进行组织学与生物力学检测。结果与结论：苏木精-伊红染色显示3组支架均可见平行排列结构,化学方法组连续性较物理冻融组、改良化学组差;Masson染色显示3组支架结构主要为胶原纤维,物理冻融组残留一些肌纤维,间隙不均。物理冻融组第7天荧光标记种子细胞计数明显少于化学方法组、改良化学组（P〈0.01）,第14天物理冻融组少于改良化学组（P〈0.05）;扫描电镜可见细胞贴附各组支架生长、大量存活;物理冻融组最大载荷高于化学方法组（P〈0.05）,与改良化学组无明显差别,各组弹性模量无差异;物理冻融组孔隙率低于化学方法组、改良化学组（P〈0.05）。表明改良化学方法可以兼顾支架的组织学和生物力学特性,彻底清除肌细胞,较多保留更完整的细胞外基质。     

人废弃胚胎体外培养成囊胚的实验室结局

背景:有报道称可以利用废弃胚胎建立人类胚胎干细胞系,对形态发育滞后的胚胎冻融后移植仍有再利用的医学价值。目的:观察人废弃胚胎在体外继续培养形成囊胚的潜能。方法:收集接受体外受精-胚胎移植或卵胞浆内单精子注射患者治疗后第3天废弃的胚胎404枚,进行囊胚序贯培养。结果与结论:①废弃胚胎404枚,形成囊胚65枚,总囊胚形成率为16.1%。②囊胚形成与患者的病因分类、年龄、受精方式无相关性(P>0.05)。③胚胎来源于≥三原核(3PN)的(6～8)细胞组的囊胚形成率最高(P<0.05)。卵裂球数随细胞数的增加,囊胚率也增高,但>8细胞囊胚率反而下降、与<3细胞组的结果相近。④Ⅰ,Ⅱ胚胎形成囊胚速度快,形成率显著高于Ⅲ,Ⅳ胚胎(P<0.05)。⑤有囊胚形成患者的临床妊娠率显著高于无囊胚形成患者(P<0.05)。提示囊胚形成与患者病因分类、年龄、受精方式无相关性。优质胚胎与(6～8)细胞的胚胎囊胚形成率高,多原核胚胎形成囊胚的价值应引起关注。废弃胚胎再利用能预测临床结局,为人类胚胎干细胞提供有利资源。     

小鼠囊胚细胞凋亡和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达与维甲酸的诱导作用

背景：细胞凋亡是维甲酸导致早期胚胎异常发育的原因之一,而半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3介导的细胞凋亡是细胞凋亡的主要途径。目的：观察维甲酸对体外培养小鼠囊胚细胞凋亡的影响,以及对囊胚细胞中半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达的改变。方法：获取妊娠3.5d小鼠囊胚,分别在含0,1和10μmol/L维甲酸的M199培养基中培养24h,用带有荧光标记的原位末端标记法观察维甲酸对小鼠囊胚细胞凋亡的效应;并用免疫组织化学S-P法检测维甲酸对小鼠囊胚半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3的表达。结果与结论：所有组均观察到囊胚细胞凋亡和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达,高剂量维甲酸组中囊胚细胞凋亡荧光值,半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达的平均吸光度值和阳性面积率均显著升高（P〈0.01）。结果提示维甲酸可促进体外培养小鼠囊胚细胞凋亡和及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达,证实了维甲酸对小鼠胚胎的发育的细胞毒性作用。     

不同冷冻方案保存人类卵巢组织的活性比较

背景：卵巢组织冷冻保存被认为是保存女性生殖内分泌功能安全、有效的方法,但目前尚无统一确定的方案。 目的：探讨3种冷冻方案对人类卵巢组织保存冷冻效果及卵泡活性的影响。方法：采用丙二醇慢速程序冷冻法、二甲基亚砜玻璃化冷冻法、液氮直投法对20例人类卵巢组织进行冷冻保存,复苏后采用细胞存活/死亡荧光分析法计数有活性的细胞,体外培养测定培养液雌二醇浓度及各级卵泡计数,判断3种不同冷冻方案对人类卵巢组织活性的影响。结果与结论：不同冷冻方案冻融后卵巢组织块的活性卵泡率均低于新鲜卵巢组（P 〈 0.05）,二甲基亚砜组最低,液氮直投法组与慢速程序冷冻法组差异无显著性意义。体外培养各冷冻组分泌的雌二醇水平比较,第4天时二甲基亚砜组低于液氮直投法组和慢速程序冷冻法组（P 〈 0.05）,至第8天时各冷冻组雌二醇水平与新鲜卵巢组一致。培养14 d组织学观察,各组卵巢组织内生长期卵泡比例增多,始基卵泡仍然占最主要的。新鲜卵巢组织正常卵泡的总数高于冷冻组（P 〈 0.05）,二甲基亚砜组的正常卵泡数低于液氮直投法组和慢速程序冷冻法组（P 〈 0.05）。提示冷冻保存对卵巢组织卵泡有一定的损伤,但仍能保存大部分始基卵泡的活性,经体外培养后可进一步发育并具有分泌功能,在3种冷冻方案中,慢速程序冷冻法和液氮直投法的冷冻效果优于二甲基亚砜玻璃化冷冻法,液氮直投法操作简便,冷冻效果稳定。     

玻璃化冷冻法保存关节软骨

背景：同种异体骨软骨移植技术是治疗关节软骨缺损有效的方法之一,但由于移植物保存方法不理想,明显制约着该技术的临床应用。目的：探讨玻璃化冷冻法保存关节软骨组织的可行性和优越性。方法：切取成年猪骨软骨,制成约5mm×6mm（直径×长度）大小的圆柱形骨软骨块。以新鲜软骨组为对照,分别采用0.5mol/L甘油、1mol/L二甲基亚砜、1mol/L玻璃化溶液3种方法预处理软骨块,再行冷冻法保存软骨块8周,采用组织化学染色、免疫荧光染色观察并比较软骨细胞活性的变化。结果与结论：玻璃化溶液预处理组的关节软骨细胞存活率达到74.5%,明显高于甘油和二甲基亚砜预处理组,软骨基质成分仅少量丢失。3种方法相比较,玻璃化溶液预处理后慢速梯度降温冷冻保存法可以明显提高冻存关节软骨组织的活性。