一种快速提取新生隐球菌基因组DNA的方法

本研究建立了简单快速抽提新生隐球菌基因组DNA的方法,适用于PCR和酶切分析。方法是细胞悬浮于含5mmol/LDTT的1%Sarkosyl抽提缓冲液中,通过加入玻璃珠在混漩器上剧烈振荡破碎细胞壁和荚膜;然后酚氯仿抽提DNA,1×108细胞约可得1μgDNA。     

玻璃珠-盐析法提取常见致病真菌DAN的研究

目的 进一步提高提取 DNA的效率并减少污染和毒性，以适应临床 PCR检测的需要，建立玻璃珠－盐析法快速提取常见致病真菌 DNA。方法 分别采用玻璃珠－盐析法和经典的酶解－酚氯仿法比较从白念珠菌、乳酒念珠菌、克柔念珠菌、季也蒙念珠菌、新生隐球菌、烟曲霉、黄曲霉和马内菲青霉等 8种常见致病真菌中提取 DNA，同时行 PCR以评价其可靠性。 结果 本方法从 8种常见致病真菌均提取浓度较高且较完整的 DNA，用于 PCR也获得良好结果。结论 玻璃珠－盐析法提取致病酵母菌和丝状真菌安全、快速且有效。     

新生隐球菌随机扩增DNA指纹分型研究

目的　用随机引物扩增新生隐球菌临床和环境分离株的DNA ,观察DNA指纹与血清型的关系 ,探索新生隐球菌基因分型标准。方法　采用 3种不同寡核苷酸重复序列 [CN1(GTG) 5、CN2(GACA) 4和CN3(GATA) 4]为引物 ,对从临床和鸽粪中分离到的 2 4株血清A型和 8株四种血清型的新生隐球菌标准株的DNA进行扩增 ,根据扩增产物的电泳带型来对比DNA指纹和血清型之间的关系。结果　 2 4株临床和鸽粪分离的血清A型株中 ,2 0株产生和标准株完全相似的DNA带型 ,1株与标准D型DNA带型相似。 3株的PCR指纹与血清A、B、C、D型均不相同。 2株B型和 2株C型产生几乎完全一致的DNA指纹带型。结论　①大多数血清A型新生隐球菌菌株具有相似DNA指纹带型。②血清B型和C型 (gattii变种 )的DNA带型不易区别。③相同血清型不同的株可能有不同的DNA指纹带型。④PCR法用于新生隐球菌菌株鉴定是一种快速、方便、可行的方法。     

几种隐球菌酶扩增核糖体DNA图谱及快速基因鉴定

DNA的聚合酶链式反应(PCR)和核糖体DNA(rDNA)位点内限制酶切片段长度的多态性分析(RFLP)是遗传学分析的新方法,作者将这两种方法用于隐球菌rDNA的分析.受试菌种含新生隐球菌(19株)、浅白隐球菌(5株)、指甲隐球菌(2株)、罗伦隐球菌(4株)、黑隐球菌(1株)、白念珠菌(2株).将经土豆浸汁培养基中     

玻璃珠－盐析法提取常见致病真菌DNA的研究

目的 进一步提高提取ＤＮＡ的效率并减少污染和毒性,以适应临床ＰＣＲ检测的需要,建立玻璃珠－盐析法快速提取常见致病真菌ＤＮＡ。方法 分别采用玻璃珠－盐析法和经典的酶解－酚氯仿法比较从白念珠菌、乳酒念珠菌、克柔念珠菌、季也蒙念珠菌、新生隐球菌、烟曲霉、黄曲霉和马内菲青霉等８种常见致病真菌中提取ＤＮＡ,同时行ＰＣＲ以评价其可靠性。结果 本方法从８种常见致病真菌均提取浓度较高且较完整的ＤＮＡ,用于ＰＣＲ也     

新生隐球菌28S rDNA的基因型特征与序列分析

目的 探讨新生隐球菌各变种、血清型与基因型的关系。方法 新生隐球菌标准株10株、新生隐球菌荚膜缺陷株CAP10以及临床分离株19株,采用变性梯度胶电泳(DGGE)结合DNA序列分析,对以上菌株的28S rDNA片段进行研究。结果 经过DGGE和DNA序列分析,所有新生隐球菌新生变种(A、D型)具有一致的基因带型和序列,格特变种(B、C型)具有不同于新生变种的独特一致的带型和序列;AD型的基因型和序列与格特变种完全相同,新生隐球菌荚膜缺陷株CAP10(D型)的基因型类同于新生变种;19株临床分离菌在DGGE上可分为2型,17株与A、D型完全相同,2株与B、C型相同。结论 DGGE结合DNA序列分析,对于探讨新生隐球菌各变种、血清型的基因型特征、关系具有重要价值;我国非艾滋病隐球菌病感染以新生变种为主,AD型在系统发育上更类同于格特变种,而不是新生变种;本研究不支持A血清型为新生变种以外的新变种即grubii变种的观点。     

新生隐球菌格鲁比变种、新生变种和格特隐球菌的多重聚合酶链反应鉴定

目的 建立一种基于核糖体基因内间隔区（IGS）的多重聚合酶链反应（PCR）,用于快速鉴定新生隐球菌新生变种、格鲁比变种和格特隐球菌。方法 选取新生隐球菌和格特隐球菌IGS中变异度最高的Ⅰ区（IGS1）为靶点,经ClustalW2多重比对,并结合Oligo6软件在不同序列位点设计针对新生隐球菌新生变种、格鲁比变种和格特隐球菌的引物用于多重PCR分析。通过51株新生隐球菌（VNⅠ-VNⅣ和VNB基因型）和41株格特隐球菌（VGⅠ-VGⅣ基因型）对该方法进行验证,并将该方法与已报道的CGB显色培养和采用特异性引物GPA1A、CLA4D和SOD1gattii扩增格鲁比变种、新生变种和格特隐球菌的单一引物PCR方法进行比较。结果 基于IGS的多重PCR分析成功鉴定所有92株新生隐球菌和格特隐球菌,对其他常见致病酵母的扩增均阴性,显示所设计引物较高的特异性;已报道的基于GPA1A和CLA4D引物PCR分别在鉴定2株和1株格特隐球菌时出现假阳性结果;CGB培养基在鉴定1株格鲁比变种和1株新生变种时出现假阳性结果。上述方法在鉴定时均未出现假阴性结果。结论 建立的多重PCR可快速准确地鉴定新生隐球菌新生变种、格鲁比变种、AD杂合子和格特隐球菌,且优于已报道的单一引物PCR 或CGB显色培养法。     

真菌病

20 0 2 2 190　 PCR对新生隐球菌的基因分型研究 /温海(二军大长征医院皮肤科 )…∥第二军医大学学报 .-2 0 0 1,2 2 (11) .- 10 0 5～ 10 0 8用 AP- PCR方法检测新生隐球菌的临床和环境分离株 ,观察 PCR指纹与血清型的关系 ,探索 PCR指纹对于新生隐球菌的分型标准。采用 3种寡     

致病隐球菌DNA中鸟嘌呤加胞嘧啶摩尔百分比含量的研究

用热变性法测定了致病隐球菌DNA核普酸组成中的硷基比率.结果罗伦隐球菌最低,新型隐球菌最高,新型隐球菌上海变种介于罗伦隐球菌和新型隐球菌格特变种之间.其变异范围为47.82-61.98.用蜗牛酶辅以十二烷基磺酸钠(SLS)破壁,克服了隐球菌壁厚且有夹膜难以提取DNA的问题.     

80株中国大陆新生隐球菌环境株表型和分子特征的初步研究

目的了解中国大陆地区新生隐球菌环境株的分布情况,及其表型和基因型特征。方法采用CACA培养基培养1372份来自中国大部分地区私人和公共养鸽场所的鸽粪标本,分离出新生隐球菌,并对其表型和基因型特征进行分析。结果共分离出80株新生隐球菌,分离阳性率约为5．5％,所有菌株37℃生长良好,有完整荚膜,尿素酶试验阳性。ITS序列分析证实分离出的新生隐球菌均属于血清型A。M13-PCR显示,其基因型为我国及东南亚地区特征性的VNIC型,显示了与临床株的高度一致性。结论中国大陆地区的新生隐球菌临床株与环境株显示了高度的同源性,提示对于易感人群,阻断与相应环境的接触可有效预防新生隐球菌的感染。     

白癜风患者郎格罕细胞的光,电镜研究

白癜风患者郎格罕细胞的光、电镜研究杜娟①朱铁君①郎格罕细胞（ＬＣ）是抗原呈递细胞，在许多皮肤病的发病中占重要地位，很多文献也报道了ＬＣ在白癜风皮损中的数量变化，但结论很不一致。本研究旨在通过严格的自身平行对照，观察白癜风患者白斑、白斑边缘及远离白斑处...     

应用PCR-RFLP进行申克孢子丝菌的分子生物学鉴定

目的　探索一种简单、快速的申克孢子丝菌的鉴定方法。方法　应用真菌通用引物ITS1和ITS4对来源于不同地区及不同临床型别孢子丝菌病的 2 8株申克孢子丝菌以及 9种其他临床上重要的真菌进行PCR扩增 ,利用限制性内切酶HaeⅢ对PCR产物进行酶切分析鉴定。结果　所有 2 8株申克孢子丝菌和其他 9种真菌均扩增出一条约 3 5 0bp的片段 ,其中 2 8株申克孢子丝菌RFLP带型一致 ,与 9种其他临床上重要的真菌RFLP带型差异较明显。 结论　PCR RFLP可以为建立一种简单、快速鉴定申克孢子丝菌的方法提供依据。     

新生隐球菌生物膜体外抗真菌药物敏感性研究

目的了解新生隐球菌生物膜对氟康唑、两性霉素B、伊曲康唑和卡泊芬净的体外敏感性。方法采用标准微量稀释法测定上述4种抗真菌药物对20株新生隐球菌悬浮状态与生物膜状态的最低抑菌浓度(MIC),MIC结果判定采用四甲基偶氮唑盐[XTT,2,3-bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-2H-tetrazolium-5-carboxanilide inner salt]-降解法。结果悬浮新生隐球菌20株均对两性霉素B敏感(<1μg/mL),3株对氟康唑耐药(>64μg/mL);1株对伊曲康唑耐药;20株均对卡泊芬净耐药。而生物膜新生隐球菌显示:在20株中,除4株对两性霉素B敏感外,其余各株均对两性霉素B耐药。20株菌均对氟康唑和伊曲康唑耐药,远远高于耐药浓度。对卡泊芬净,均高于其耐药浓度。结论标准微量稀释法结合四甲基偶氮唑盐(XTT)-降解法测定新生隐球菌生物膜对抗真菌药物的敏感性其结果具有可重复性和一致性的特点;新生隐球菌生物膜的明显降低抗真菌药物的敏感性。     

阴道念珠菌病患者阴道分泌物总RNA提取方法的研究

目的 探索一种简单有效的人体阴道分泌物标本总RNA提取方法并验证其可行性。方法 采用人体上皮细胞与念珠菌标准菌株的混合物（106 ∶ 106）,对匀浆、玻璃珠和液氮研磨三种破壁方法,纯化柱、酚两种提取方法组合产生的5种不同RNA提取方法进行比较。并将提取效果最好的方法应用于临床标本。结果 5种方法均可提取出总RNA,其中,热酚法提取质量浓度最高,达到0.6546 g/L,其次为RNeasy试剂盒提取方法为0.6010 g/L,玻璃珠法为0.2678 g/L,匀浆后TRIzol法为0.2284 g/L,液氮研磨后TRIzol法为0.2115 g/L。但电泳结果显示,以液氮研磨后TRIzol提取质量最好,而且标准菌株及培养细胞混合物两种细胞成分RNA均被提取,RT-PCR以及荧光定量PCR验证结果显示,该方法可以应用于临床标本RNA提取。结论 液氮研磨后TRIzol法是一种简单而有效的阴道分泌物临床标本RNA提取方法,而且提取物可以满足常规下游实验的需求。     

PCR检测深部致病真菌感染的研究

目的探讨PCR在可疑深部真菌感染临床标本检测中的应用。方法对60份临床标本分别进行传统真菌培养以及真菌通用引物PCR和三重PCR检测。结果真菌培养阳性共19份，其中白念珠菌10份、烟曲霉2份、新生隐球菌2份、其他菌株5份（包括光滑念珠菌2份、热带念珠菌2份、克柔念珠菌1份）；真菌通用PCR检测共有21份阳性，经三重PCR检测共有15份阳性，分别为白念珠菌10份、烟曲霉3份、新生隐球菌2份。PCR方法与传统培养方法相比，检出率差异无统计学意义。结论PCR检测可疑深部真菌感染临床标本快速简便，稳定性好，敏感性和特异性均较理想，适合临床实验室常规使用。     

新型隐球菌核型的脉冲电泳分析

用脉冲电泳技术分离了包括３个变种、５种血清型在内的２０株新型隐球菌染色体ＤＮＡ，发现其基因组由１０～１２条染色体组成，大小在０．４～２．１Ｍｂ之间，总长度约１５Ｍｂ。特别是注意到电泳核型与血清型之间有相关性，并观察到菌株间的带型也存在不同程度的差异，提示电泳核型分析可作为变种鉴别和种内分型的新的基因型方法。     

氟康唑与5-氟胞嘧啶体外联合抗新生隐球菌临床分离株的实验研究

目的 评价新生隐球菌临床分离株对氟康唑和5—氟胞嘧啶联合用药的敏感性及判断两药物之间相互作用的方式。方法 采用美国国家临床实验室标准化委员会(NCCLS)M27—A推荐的棋盘微量稀释法，检测了20株新生隐球菌临床分离株对氟康唑、5—氟胞嘧啶及两药联合的体外药物敏感性，同时对两药的作用方式进行了判定。结果 联合用药时显著减少了每一药物MIC值的几何均数，在35％受试菌表现为协同作用方式，在55％的受试菌株表现为相加作用方式，在10％受试菌株表现为无关作用方式，未观察到拮抗作用出现。测定不同浓度下药物单独和组合作用的一株菌的菌落形成单位(cfu／mL)，每一种联合用药组合都较5—氟胞嘧单独用药有明显减少。结论 氟康唑与5—氟胞嘧啶联合比单一药物体外抗新生隐球菌的活性高。     

新生隐球菌ISC10基因的cDNA克隆及序列分析

目的克隆新生隐球菌ISC10基因(Meiosis-specific protein required for spore formation)的全长cDNA序列,并进行生物信息学分析。方法从新生隐球菌B3501菌株中分离提取总RNA,逆转录成cDNA,运用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术扩增获得新生隐球菌ISC10基因,构建pGM-T/ISC10重组载体,测序后与GenBank中ISC10基因(DQ332212)进行同源性比较和序列分析。结果所克隆的基因共编码267个氨基酸,分子量为31.65KD,与GenBank中ISC10基因(DQ332212)序列同源性达99.10%,编码的蛋白质在67位氨基酸由Ala(丙氨酸)突变为Pro(脯氨酸),233位氨基酸由Thr(苏氨酸)突变为Ser(丝氨酸)。结论所克隆的基因为新生隐球菌的一个新基因,其相关生物学信息的明确,为应用分子生物学技术进一步深入研究新生隐球菌的感染和致病机制奠定了基础。