存活素反义寡核苷酸对角质形成细胞增殖和凋亡的影响

目的探讨存活素反义寡核苷酸对角质形成细胞增殖和凋亡的影响。方法以脂质体介导存活素反义寡核苷酸转染体外培养的角质形成细胞。采用MTT方法观察存活素反义寡核苷酸对角质形成细胞生长曲线的影响;采用RT-PCR方法观察存活素反义寡核苷酸对角质形成细胞存活素表达水平的影响;采用流式细胞仪检测存活素反义寡核苷酸对角质形成细胞细胞周期和凋亡的影响。结果存活素反义寡核苷酸作用于角质形成细胞后,细胞增殖受到明显抑制,存活素mRNA表达水平明显下降,细胞出现明显的凋亡现象。结论存活素反义寡核苷核酸能够抑制角质形成细胞增殖,促进角质形成细胞凋亡。提示存活素可能会成为一个新的治疗银屑病的靶分子。     

siRNA抑制生存素基因对恶性黑素瘤细胞A375凋亡的影响

目的 探讨RNA干扰技术抑制恶性黑素瘤细胞株A375生存素基因表达后,对A375细胞凋亡的影响。方法 构建针对凋亡抑制基因生存素的siRNA真核表达载体pU-生存素-siRNA,用电穿孔法转染A375细胞,采用蛋白质印迹技术检测生存素的表达,并用流式细胞仪检测细胞凋亡的变化。结果 转染pU-生存素-siRNA后,生存素在A375细胞中的表达(0.24±0.02)较对照组(0.98±0.21)明显下降,试验组细胞的凋亡率(83%)较对照组(28%)明显增加。结论 通过RNA干扰技术可抑制生存素的表达,诱导A375细胞的凋亡增加。     

干细胞因子及受体c-kit对A375细胞增殖和凋亡影响的体外研究

目的利用基因工程方法建立稳定表达干细胞因子受体(SCF/c-kit)的恶性黑素瘤A375细胞株,再给予外源性SCF/c-kit,观察其对A375细胞增殖、凋亡的影响。方法通过脂质体转染技术构建稳定表达c-kit的黑素瘤细胞株(hc-kit/A375),给予A375细胞和hc-kit/A375细胞外源性SCF,将所有的细胞分为A375组、A375-SCF组、hc-kit/A375组和hc-kit/A375-SCF组。应用MTT法及流式细胞仪分析细胞的增殖和凋亡,并应用酶联免疫吸附法(ELISA)和免疫组化方法检测肿瘤细胞血管内皮生长因子(VEGF),基质金属蛋白酶(MMP)-9及肿瘤坏死因子(TNF)-α的表达。结果①通过脂质体介导能将c-kit-pcDNA3.1neo重组质粒成功转染入黑素瘤细胞,建立稳定表达c-kit的黑素瘤细胞株hc-kit/A375,hc-kit/A375细胞中c-kit表达明显增加。②给予外源性SCF后,细胞的生长受到抑制,以培养后第5天尤为显著;细胞的凋亡率明显增加,S期比例降低,且hc-kit/A375-SCF组尤明显。③转染后细胞及加入SCF干预组VEGF、MMP-9分泌减少,而TNF-α的分泌增加。结论通过脂质体转染和G418筛选成功构建稳定表达c-kit的A375细胞株;通过增加A375细胞中SCF/c-kit的表达能改变肿瘤细胞对VEGF、MMP-9、TNF-α的分泌,抑制肿瘤细胞的增殖,促进其凋亡。     

反义寡核苷酸阻遏角蛋白14的表达

目的 研究脂质体介导角蛋白K14反义寡核苷酸(ASODN)阻遏人角质形成细胞K14基因和蛋白的表达及抑制体外增殖活性的效果.方法 人表皮角质形成细胞原代培养,3~10代用于实验,利用脂质体将人工合成的正义、反义及错配K14寡核苷酸基因片段导入角质形成细胞,应用流式细胞仪、逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和免疫组化(SABC)方法检测反义寡核苷酸对角质形成细胞的细胞周期、K14基因和蛋白表达的影响.结果 脂质体介导的K14反义寡核苷酸转染角质形成细胞后,能有效地抑制角质形成细胞中K14基因的表达;48h后可阻遏K14蛋白表达;流式细胞仪检测见反义寡核苷酸处理组细胞周期发生明显改变,G₁期细胞百分率上升,S期细胞百分率下降.而正义寡核苷酸1组、错义寡核苷酸组及空白对照组均无此变化.结论 应用反义技术封闭K14基因,可以阻遏角蛋白K14基因和蛋白的表达,并可以抑制体外培养的角质形成细胞的增殖.     

C-myc反义寡核苷酸抗恶性黑素瘤作用机制初探

目的　初步探讨C-myc反义寡核苷酸(ASODN)抗恶性黑素瘤可能作用机制。方法　以全硫代修饰的C myc反义寡核苷酸体外转染恶性黑素瘤细胞株A375,用台盼蓝活细胞计数法检测其对细胞增殖的影响,流式细胞仪检测细胞周期变化,间接免疫荧光流式细胞术检测HLA Ⅰ抗原的水平。结果　与对照组相比,①30μmol/LASODN组细胞生长明显受抑制,且发生G1 期阻滞;②ASODN组细胞上HLA Ⅰ抗原的水平明显上调。结论　C myc反义寡核苷酸可能通过抑制A375M细胞的增殖和上调HLA Ⅰ抗原水平的双重机制发挥抗肿瘤作用。     

COX-2反义寡核苷酸对Colo-16细胞生长及c-myc基因表达的影响

目的探讨脂质体介导环氧合酶(COX)-2反义寡核苷酸(antisense oligodeoxynucleotide,AsODN)对皮肤鳞状细胞癌细胞株Colo-16细胞生长及对c-myc表达的影响。方法将COX-2无义(Nonsense oligodeoxynucleotide,NsODN)、反义寡核苷酸用脂质体分别导入Colo-16细胞中。四甲基偶氮唑蓝(MTT)法观察COX-2反义寡核苷酸对Colo-16细胞体生长曲线的影响;Hoechst33258荧光染色法观察细胞凋亡的形态学变化;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测c-myc蛋白表达的变化。结果COX-2反义寡核苷酸作用于Colo-16细胞后,细胞增殖能力受到抑制,荧光染色可见细胞核染色质边集、固缩、核碎裂的凋亡形态学改变;c-myc表达明显下调。结论COX-2反义寡核苷核酸能够抑制Colo-16细胞体外增殖,诱导Colo-16细胞凋亡,并能显著下调c-myc表达。     

反义p53寡核苷酸对阿霉素诱导的培养人皮肤角质形成细胞凋亡的影响

目的 探讨反义p53寡核苷酸(ODN)对阿霉素诱导的培养人皮肤角质形成细胞凋亡的影响.方法 用MTT法检测不同浓度脂质体和0.5mg/L反义p53 ODN转染角质形成细胞后对2mg/L阿霉素抑制细胞增殖的影响;RT-PCR方法 测定p53 mRNA水平的变化;用流式细胞仪检测细胞凋亡.结果 阿霉素抑制体外培养的人皮肤角...     

COX-2反义寡核苷酸对Colo-16细胞生长能力及VEGF表达的影响

目的:评估脂质体介导环氧合酶(COX)-2反义寡核苷酸(AsODN)对皮肤鳞状细胞癌细胞株Colo-16生长及血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响.方法:将COX-2无义寡核苷酸(NsODN)和AsODN用脂质体分别导入Colo-16细胞中,克隆并观察COX-2 AsODN对细胞的生长抑制作用.Hoechst33258荧光染色法和流式细胞仪观察Colo-16细胞凋亡形态学变化及凋亡率.Western blot检测VEGF表达水平.结果:COX-2 AsODN作用于Colo-16细胞后,增殖能力受到抑制,克隆形成率下降(P<0.05),细胞出现明显凋亡,COX-2 AsODN组细胞早期凋亡率显著高于对照组(P<0.05);VEGF表达明显下调.结论:COX-2AsODN能够抑制Colo-16细胞体外生长,诱导其凋亡,并能显著下调VEGF表达.     

脂质体携带反义寡核苷酸对A375细胞Survivin表达的影响

目的研究脂质体携带反义寡核苷酸转染对A375细胞Survivin mRNA及蛋白表达的影响。方法通过反转录聚合酶链反应(RT-PCR)和Western免疫印迹法对反义寡核苷酸转染后A375细胞Survivin mRNA和蛋白表达变化进行定性和半定量分析。结果RT-PCR结果经光密度扫描半定量分析:对照组为0.9994,反义寡核苷酸处理组为0.4761,较对照组降低了52.36%。Western免疫印迹法证实在A375细胞中存在分子量16.5KD的特异性条带,与Survivin分子量相符,反义寡核苷酸处理组细胞在NC膜上特异性条带明显弱于对照组细胞。结论证实反义寡核苷酸通过降解mRNA,阻断基因翻译成蛋白质的特异性反义活动机制。     

K17反义寡核苷酸对角质形成细胞增殖和K17表达的影响

目的研究脂质体介导角蛋白17(K17)反义寡核苷酸对培养人角质形成细胞增殖和K17表达的影响。方法利用脂质体将人工合成的正义、反义及错配K17寡核苷酸基因片段导入体外培养的人角质形成细胞系HaCaT,应用MTT法检测其对HaCaT细胞增殖的影响,以逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测K17mRNA水平的变化,并以蛋白质印迹法、免疫荧光细胞化学结合激光扫描共聚焦显微镜检测K17蛋白水平的改变。结果脂质体介导的K17反义寡核苷酸转染HaCaT细胞后,细胞增殖受到明显抑制,同时细胞中K17mRNA和蛋白的表达明显下降,而正义寡核苷酸组、错义寡核苷酸组及空白对照组均无明显变化。结论应用反义技术封闭K17基因,可以阻遏角蛋白K17基因和蛋白的表达,抑制角质形成细胞的体外生长和增殖能力。     

KPNA2基因在皮肤黑素瘤中的表达及功能

目的研究KPNA2基因在皮肤黑素瘤中的生物学功能。方法基因芯片分析KPNA2在皮肤黑素瘤中的表达,Real time PCR检测KPNA2基因在皮肤黑素瘤组织及细胞中的表达水平。小干扰RNA转染A375细胞株,平板克隆、MTT法检测KPNA2基因敲低组、对照组皮肤黑素瘤细胞的增殖活性。Transwell实验计算皮肤黑素瘤细胞过膜数量,研究KPNA2与皮肤黑素瘤细胞迁移作用的关系。结果 KPNA2在皮肤黑素瘤组织中的表达显著高于癌旁皮肤组织,表达随着病理分级的恶性程度的升级而增高。高表达KPNA2组患者预后明显比KPNA2组患者差。平板克隆及MTT实验结果显示si-KPNA2组的细胞活性及增殖明显受抑制(P均<0.01),Transwell实验显示si-KPNA2组的细胞过膜数量(87.33±6.20)/视野,明显低于对照组(271.70±8.70)/视野,差异有统计学意义(P<0.01)。结论 KPNA2在皮肤黑素瘤组织表达升高,促进黑素瘤细胞的增殖和迁移,其可作为黑素瘤的潜在临床诊治靶点及预后标志物。     

白藜芦醇对恶性黑素瘤细胞株增殖的影响

目的 研究白藜芦醇对恶性黑素瘤体外抗癌作用,探讨其抗癌作用的分子机制.方法 采用MTT法检测白藜芦醇对人恶性黑素瘤细胞系A375及小鼠恶性黑素瘤细胞系B16-F1增殖的影响;Annexin-V/PI双标流式细胞术检测白藜芦醇对A375、B16-F1细胞凋亡的影响,PI单标流式细胞术测定白藜芦醇对A375、B16-F1细胞周期的影响;Western印迹法检测白藜芦醇对A375、B16-F1细胞Bcl-2、Bax蛋白表达的影响.结果 白藜芦醇对A375、B16-F1细胞增殖具有明显的抑制作用,且呈量效及时效关系.25 μmol/L白藜芦醇作用24 h即可诱导A375细胞凋亡,其细胞凋亡率为16.7%±2.1%.100μmol/L白藜芦醇作用24 h时B16-F1细胞凋亡率可达39.6%±3.3%.100 μmol/L白藜芦醇作用12 h时A375细胞凋亡率为17.2%±1.7%,作用72 h时达52.3%±4.1%;相同浓度白藜芦醇作用12 h时B16-F1细胞凋亡率为18.4%±1.6%,作用72 h时达56.7%±4.5%.白藜芦醇处理组A375及B16-F1细胞周期均发生变化,细胞周期被阻滞于G1期,此阻滞效应随白藜芦醇浓度的增加而增加,25 μmol/L、100μmol/L白藜芦醇作用24 h时,A375 G1期比例分别为40.51%±3.97%和55.64%±4.95%.B16-F1细胞分别为41.34%±3.12%和53.93%±5.12%.白藜芦醇明显下调A375及B16-F1细胞抗凋亡蛋白Bcl-2的表达,同时上调促凋亡蛋白Bax的表达水平.结论 白藜芦醇可通过调控细胞周期进程、诱导细胞凋亡而有效抑制A375及B16-F1的增殖,其机制与调节Bel-2、Bax的表达有关.     

BRAFV599E突变基因对A375细胞生长的影响

目的 探讨BRAFV599E突变对黑素瘤生长的作用。方法 使用BRAF表达受到抑制的黑素瘤细胞Abraf1和Abraf2,以及BRAF表达未受抑制的A375细胞和Aneg细胞,MTT比色实验和平板克隆形成实验分别检测4种细胞的生长和克隆形成能力,流式细胞仪检测细胞周期和凋亡的变化。结果 与A375和Aneg细胞相比,Abraf1和Abraf2细胞的体外生长（F = 25.48,P < 0.001）和克隆形成（F ＝ 90.06,P < 0.001）均受到明显抑制,S期细胞减少（F = 147.87,P < 0.001）,G1期细胞增多（F = 9.14,P < 0.05）,但细胞凋亡没有显著增加（F = 2.27,P > 0.05）。结论 BRAFV599E突变基因能促使黑素瘤细胞从G1期进入S期,从而增强黑素瘤细胞的体外生长和增殖能力,但对黑素瘤细胞的体外凋亡没有影响。     

芹菜素对人恶性黑素瘤A375细胞周期的影响及机制研究

目的研究芹菜素对人恶性黑素瘤细胞系A375细胞周期的影响,并进一步探讨其作用机制。方法 A375细胞经芹菜素干预后,MTT比色法检测芹菜素对细胞增殖的影响,PI单标流式细胞术检测芹菜素对细胞周期的影响,蛋白印迹法检测芹菜素对细胞周期相关蛋白Cyclin D1及p21表达的影响。结果芹菜素在体外能明显抑制A375细胞增殖,其抑制效应呈时间及浓度依赖性;芹菜素可影响A375细胞周期,经芹菜素干预的A375细胞,其细胞周期被阻滞于G1期;芹菜素可显著影响A375细胞周期相关蛋白的表达,芹菜素在下调A375细胞Cyclin D1表达的同时,明显上调p21蛋白的表达。结论芹菜素能拮抗人恶性黑素瘤A375细胞增殖,其机制可能与芹菜素影响A375细胞周期相关蛋白Cyclin D1/p21的表达进而调控A375细胞周期进程有关。     

基质金属蛋白酶7在恶性黑素瘤中的表达

目的 探讨基质金属蛋白酶7（MMP7）的表达与恶性黑素瘤浸润、转移的关系。方法 采用免疫组化SP法研究MMP7在恶性黑素瘤（30例）、交界痣（30例）、正常人皮肤（15例）组织中的表达，并观察其在恶性黑素瘤A375细胞株和不同浓度乙酰肝素酶反义寡核苷酸转染的裸鼠体内恶性黑素瘤移植瘤中的表达情况。结果 MMP7在恶性黑素瘤组、交界痣组及正常人皮肤组中的阳性表达率分别为83.33%（25/30）、6.67%（2/30）和0，恶性黑素瘤组与交界痣组MMP7的阳性表达率比较，χ2 = 35.62，P < 0.01；交界痣组与正常人皮肤组比较，差异无统计学意义。10、20、30 μmol/L乙酰肝素酶反义寡核苷酸对裸鼠体内恶性黑素瘤移植瘤MMP7表达表现出不同程度的抑制作用，30 μmol/L组的抑制作用最强，与其他2个组相比，差异均有统计学意义（P < 0.05）。MMP7在A375细胞株中呈强阳性表达。结论 MMP7在恶性黑素瘤中的表达明显高于其在交界痣和正常人皮肤；乙酰肝素酶反义寡核苷酸对裸鼠体内恶性黑素瘤移植瘤中MMP7的表达有显著抑制效应；MMP7在A375细胞株中呈强阳性表达。     

Expression and targeting of the apoptosis inhibitor, survivin, in human melanoma

The newly described apoptosis inhibitor survivin is expressed in many human cancers and appears to play a critical part in both apoptosis regulation and cell cycle progression. Its potential role in malignant melanoma is unknown. In a panel of 30 malignant melanomas, survivin was strongly expressed in all cases (15 of 15) of metastatic malignant melanomas and 13 of 15 cases of invasive malignant melanomas by immunohistochemistry. In invasive malignant melanomas, survivin was also expressed in the in-situ component of the lesion. Survivin expression was found in all cases (11 of 11) of nevi, but not in melanocytes in sections of normal skin. The apoptosis inhibitor bcl-2 was expressed in 26 of 30 cases, but generally at lower levels than that of infiltrating lymphocytes. The mitotic index, as assessed by MIB-1 staining, was consistently higher in metastatic than invasive malignant melanomas. Assessment of apoptotic index by in situ end-labeling revealed extremely low rates of apoptosis in most malignant melanomas. Survivin expression by western blotting was detected in four human metastatic malignant melanoma cell lines but not in cultured normal human melanocytes. Transfection of both YUSAC-2 and LOX malignant melanoma cells with green fluorescence protein-conjugated survivin anti-sense or green fluorescence protein-conjugated survivin dominant negative mutant (Cys84Ala) [corrected] resulted in increased apoptosis in the absence of other genotoxic stimuli. Two-color flow cytometry confirmed that YUSAC-2 cells transfected with survivin anti-sense expressed less endogenous survivin and exhibited an increased fraction of cells with sub-G1 DNA content. These data demonstrate that apoptosis inhibition by survivin may participate in the onset and progression of malignant melanomas, and suggest that therapeutic targeting of survivin may be beneficial in patients with recurrent or metastatic disease.     

Bcl-2 and bcl-xL antisense oligonucleotides induce apoptosis in melanoma cells of different clinical stages

Recent clinical studies have shown the promise of bcl-2 antisense therapy in patients with melanoma. To further demonstrate the importance of bcl-2 and validate the related antiapoptotic protein bcl-xL as targets for antisense therapy in melanoma, their implication as survival factors in melanoma cells of different clinical stages as well as in normal melanocytes was investigated. Primary cell cultures derived from 17 melanomas, the cell line A375, and normal melanocytes from healthy donors were treated with antisense oligonucleotides targeting either the bcl-xL mRNA or the bcl-2 and the bcl-xL mRNAs simultaneously. Bcl-2 and bcl-xL expression in cells was analyzed by real-time polymerase chain reaction and Western blotting. Cell viability was assessed in 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide and apoptosis assays. Bcl-2 expression was low in melanoma cells of stages I, II, and III, hardly detectable in A375 cells, but high in normal melanocytes. Bcl-xL expression was high in all cell types tested. As shown in A375 cells and the stage III melanoma cells 0513, both the bcl-xL monospecific oligonucleotide 4259 and the bcl-2/bcl-xL bispecific oligonucleotide 4625 effectively reduced tumor cell viability by induction of apoptosis with IC50 values ranging from 200 to 350 nM. Oligonucleotide 4625 proved to be superior to 4259, as it significantly reduced the viability of cells from all melanoma stages. Both oligonucleotides reduced also the viability of normal melanocytes. Our data suggest that bcl-2 and bcl-xL are promising targets for antisense therapy of melanoma, and that the simultaneous downregulation of their expression may provide additional clinical benefit.     

血管内皮生长因子-siRNA对恶性黑素瘤细胞生长的抑制作用

目的 探讨血管内皮生长因子siRNA对恶性黑素瘤细胞株A375增殖和凋亡的影响。方法 构建针对血管内皮生长因子的siRNA真核表达载体pU-VEGF-siRNA将其表达载体经电穿孔转染A375细胞,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、免疫酶联吸附实验(ELISA)方法 检测转染后的A375细胞VEGF的mRNA和蛋白表达,应用细胞计数比较转染组和对照组A375细胞增殖能力,将含转染组和对照组A375细胞的上清液分别培养人静脉内皮细胞(ECV-304),观察其生长情况,并用流式细胞仪观察转染pU-VEGF-siRNA载体对A375细胞凋亡的影响。结果 转染pU-VEGF-siRNA载体后,A375细胞的VEGFmRNA和蛋白表达均较对照组明显下降,并且其生长缓慢,其细胞周期出现亚二倍凋亡峰。用转染pU-VEGF-siRNA的A375细胞上清液培养的ECV-304细胞增殖力较对照组下降。结论 通过RNA干扰技术阻断VEGF的表达,可抑制A375和ECV-304细胞增殖,诱导A375细胞凋亡。