烟曲霉对小鼠巨噬细胞自噬流的影响初步研究

【摘要】 目的 探讨烟曲霉对小鼠骨髓来源巨噬细胞（BMDM）自噬流的影响。方法 灭活烟曲霉体外诱导小鼠BMDM不同时间（0、0.5、4、12 h）,提取细胞蛋白,Western印迹法检测自噬关键蛋白LC3-Ⅰ型/Ⅱ型的转换及磷酸化雷帕霉素靶蛋白（p-mTOR）Ser2481的蛋白水平。用烟曲霉和溶酶体阻断剂［包括半胱氨酸蛋白酶抑制剂E-64d + 胃蛋白酶抑制剂pepstatin、巴佛洛霉素-A1（BAF-A1）、氯化铵、氯喹］单独或联合体外诱导小鼠BMDM不同时间（4、12 h）后,Western印迹法检测烟曲霉对新生的LC3-Ⅱ、细胞基础自噬流的影响,并通过共聚焦荧光显微镜观察烟曲霉与LC3、Rubicon（RUN domain Beclin-1-interacting and cysteine-rich-domain-containing protein）的共定位关系。不同处理时间数据结果采用非匹配t检验分析,烟曲霉孢子和自噬溶酶体阻断剂两因素处理数据结果采用2 × 2析因分析方法。结果 Western印迹显示,与对照组（0 h组）比较,烟曲霉体外诱导小鼠BMDM 0.5、4、12 h后细胞内LC3-Ⅱ表达逐渐增加,差异均有统计学意义（t值分别为6.58、3.28、3.02,均P < 0.05）,但各组p-mTOR蛋白水平差异无统计学意义（t值分别为0.441、0.477、0.382,P值分别为0.682、0.660、0.722）。与单独氯喹处理BMDM 4 h和12 h相比,烟曲霉联合氯喹处理后 LC3-Ⅱ进一步增高,差异均有统计学意义（t = 2.13、2.78,均P < 0.05）。与单独氯化铵处理BMDM 4 h和12 h相比,烟曲霉联合氯化铵处理后 LC3-Ⅱ进一步增高,差异均有统计学意义（t = 2.92、2.92,均P < 0.05）。与单独BAF-A1处理BMDM 4 h和12 h相比,烟曲霉联合BAF-A1处理后LC3-Ⅱ进一步增高,差异有统计学意义（t = 2.13、2.13,均P < 0.05）。与单独E-64d + pepstatin处理BMDM 4 h和12 h相比,烟曲霉联合E-64d + pepstatin处理后 LC3-Ⅱ进一步增高,差异有统计学意义（t = 2.13、2.92,均P < 0.05）。用钙荧光白荧光标记的烟曲霉孢子刺激BMDM 8 h后,共聚焦荧光显微镜显示LC3、Rubicon主要包绕于烟曲霉周围,与烟曲霉均有共定位关系。结论 烟曲霉体外诱导可增加小鼠BMDM基础自噬流。     

白念珠菌诱导小鼠骨髓来源巨噬细胞焦亡的初步研究

【摘要】 目的 探讨白念珠菌对小鼠骨髓来源巨噬细胞（BMDM）焦亡的影响。方法 通过活细胞工作站实时观察白念珠菌［感染复数（MOI） = 50，下同］体外诱导BMDM后是否发生焦亡；将BMDM分为对照组、白念珠菌组，分别用磷酸盐缓冲液和白念珠菌酵母诱导BMDM 6 h，实时荧光定量PCR检测NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3 （NLRP3）、白细胞介素1β （IL-1β）、IL-18 mRNA表达水平，Western印迹法检测NLRP3、胱天蛋白酶1（Caspase-1）、Gasdermin D（GSDMD）的表达及剪切水平。用白念珠菌诱导BMDM不同时间（0、10、15、20及25 h）后，酶联免疫吸附试验检测IL-1β、IL-18分泌水平。白念珠菌体外诱导野生型（WT）BMDM及 GSDMD 敲除（KO）BMDM 15 min，采用流式细胞仪比较WT、GSDMD KO BMDM对白念珠菌的吞噬率；诱导6 h后，采用流式细胞仪及乳酸脱氢酶（LDH）释放法分别检测WT、GSDMD KO BMDM的死亡率。分别设置空白对照组、对照组、样品最大酶活性对照孔组、IL-1β组、白念珠菌组、IL-1β + 白念珠菌组，用IL-1β和/或白念珠菌酵母诱导BMDM后用LDH释放法分析WT及GSDMD KO BMDM死亡率。采用非配对t检验、Kruskal-Wallis 检验、方差分析等统计学方法进行统计分析。结果 白念珠菌体外诱导BMDM后细胞可出现气球样变及出泡现象，证实焦亡发生；与对照组相比，白念珠菌组诱导BMDM 6 h后NLRP3、IL-1β的mRNA表达水平明显升高（t = 13.02、17.51，P = 或＜0.001），而IL-18 mRNA表达水平无明显变化（P = 0.486），且白念珠菌诱导可引起炎症小体NLRP3表达增多及Caspase-1、GSDMD剪切。白念珠菌诱导BMDM不同时间（0、10、15、20及25 h）后IL-1β的分泌水平随时间逐渐升高（H = 12.90，P = 0.012），而IL-18的分泌水平无明显变化（F = 0.48，P = 0.753），且GSDMD KO组BMDM的IL-1β分泌水平低于WT BMDM组（F = 24.22，P = 0.008）。白念珠菌体外诱导15 min后，GSDMD KO BMDM［（50.3 ± 1.10）%］对白念珠菌的吞噬率低于WT BMDM［（58.53 ± 1.19）%，t = 5.09，P = 0.007］；白念珠菌体外诱导6 h后，流式细胞仪检测显示GSDMD KO组BMDM的死亡率（38.40% ± 0.50%）高于WT组BMDM（34.37% ± 0.52%），t = 4.72，P = 0.009；LDH检测同样显示GSDMD KO BMDM的死亡率（22.52% ± 0.18%）高于WT BMDM（12.48% ± 0.15%），t = 42.36，P＜0.001；IL-1β预处理后予白念珠菌体外诱导的WT BMDM及GSDMD KO BMDM 的细胞死亡率均较单纯白念珠菌诱导组降低（均P＜0.001）。结论 白念珠菌可诱导BMDM发生焦亡，焦亡的发生可促进IL-1β释放，并通过提高巨噬细胞的免疫活性，降低巨噬细胞死亡率。     

依维莫司对顺铂产生抗人皮肤鳞状细胞癌COLO-16细胞效应的增效作用研究

目的 探讨依维莫司是否增加顺铂对人皮肤鳞状细胞癌COLO-16细胞的杀伤效应.方法 分别用50、100、200 nmol/L的依维莫司和25 μmol/L顺铂处理人皮肤鳞状细胞癌系COLO-16细胞12、24h,用AO标记自噬体囊泡并结合溶酶体酶抑制剂分析自噬和自噬流水平.Western印迹分析自噬标记性分子LC3-Ⅰ→LC3-Ⅱ转化、Caspase 3和PARP剪切;LDH释放实验分析细胞死亡;Annexin V-EGFP染色分析细胞凋亡.结果 50、100、200 nmol/L的依维莫司处理COLO-16细胞后,12 h LC3-I→LC3-Ⅱ转换值分别为3.52±0.21、4.03±0.39、5.05±0.22,两两之间比较,差异无统计学意义(P＞0.05),与未用药物处理的对照组(2.07±0.05)比较,差异有统计学意义(P＜0.05).24 hLC3-I→LC3-Ⅱ转换值分别为3.38±0.26、3.29±0.06、6.57±0.16,两两之间比较,差异无统计学意义(P＞0.05),与对照组(2.61％±0.16％)比较,差异有统计学意义(P＜0.05).50、100、200 nmol/L的依维莫司联合E64d、pepstatin处理COLO-16细胞12h后,LC3-Ⅱ与β肌动蛋白的比值分别为1.26±0.40、1.16±0.34、1.21±0.39,与E64d、pepstatin单独处理细胞组(1.19±0.27)比较,差异无统计学意义(P＞0.05).100 nmol/L依维莫司联合E64d、pepstatin自噬体囊泡表达阳性率2.06±0.61,与E64d、pepstatin单独处理细胞组(1.68±0.62)比较,差异无统计学意义(P＞0.05).依维莫司与顺铂联合处理24 h细胞死亡率42.58％±0.93％,高于顺铂单独处理的细胞(死亡率18.20％±1.46％),差异有统计学意义.依维莫司联合顺铂处理与顺铂单独处理细胞相比,Caspase 3和PARP剪切、Annexin V标记细胞数以及LC3-Ⅱ形成均无统计学差异(P＞0.05).结论 依维莫司增强顺铂诱导COLO-1细胞死亡,这种效应不依赖于凋亡和自噬调控.     

丹参酮ⅡA体外促进黑素瘤A375细胞自噬及信号通路的实验研究

目的：探讨丹参酮ⅡA体外对黑素瘤细胞A375细胞自噬的影响及其信号通路研究。方法0.5、1、2、4 mg/L丹参酮ⅡA作用黑素瘤A375细胞24、48、72 h后，噻唑蓝（MTT）比色法检测A375细胞的增殖活性。1、2、4 mg/L丹参酮ⅡA作用黑素瘤A375细胞48 h，采用流式细胞仪检测细胞自噬小体的数量，Western印迹检测自噬相关蛋白Beclin?1和微管相关蛋白1轻链3（LC3）?Ⅱ蛋白及磷酸肌醇3激酶（PI3K）、蛋白激酶B（Akt）、雷帕霉素靶蛋白（mTOR）、p70S6激酶1（p70S6K1）蛋白的表达水平。结果 MTT分析显示，0.5、1、2和4 mg/L丹参酮ⅡA分别作用黑素瘤A375细胞24、48、72 h，均能抑制A375细胞的增殖能力，且抑制作用呈剂量和时间依赖性（F=2564.12、1235.25，均P<0.05）。流式细胞仪显示，1、2和4 mg/L丹参酮ⅡA作用A375细胞48 h后，细胞内自噬小体比例分别为6.91%±0.35%、13.11%±0.73%、25.51%±0.83%，均明显高于对照组（0.41%±0.02%），各组间差异有统计学意义（均P<0.05）。Western印迹显示，1、2和4 mg/L丹参酮ⅡA作用A375细胞48 h后，细胞自噬相关蛋白Beclin?1和LC3?Ⅱ表达水平随丹参酮ⅡA浓度增加而升高，各丹参酮ⅡA组间差异有统计学意义，且高于对照组（均P<0.05）。而PI3K?Akt?mTOR?p70S6K1信号通路中PI3K、p?Akt、p?mTOR和p?p70S6K1蛋白表达随丹参酮ⅡA浓度增加而下降，各丹参酮ⅡA组间差异有统计学意义，且低于对照组（均P<0.05）。结论丹参酮ⅡA可通过抑制P13K?Akt?mTOR?p70S6K1信号通路，促进黑素瘤细胞发生自噬。     

α硫辛酸对人皮肤成纤维细胞自噬的影响

目的：评价α硫辛酸对人皮肤成纤维细胞自噬水平的影响。方法人皮肤成纤维细胞与终浓度分别为0、0.05、0.10、0.15、0.20和0.50 mmol/L 的α硫辛酸孵育4、12和24 h 后,采用噻唑蓝法检测细胞增殖活性,单丹酰戊二胺（MDC）染色法检测细胞自噬水平,Western 印迹法检测微管相关蛋白1轻链3-B（LC3-B）表达。结果孵育4 h 和12 h 时,0、0.05、0.10、0.15、0.20和0.50 mmol/L α硫辛酸组间人皮肤成纤维细胞增殖活性（A490值）差异均无统计学意义（F 值分别为2.85、1.34,均 P >0.05）;孵育24 h 时,各组间差异有统计学意义（F =10.41,P <0.01）。MDC 法检测显示,孵育4 h 和12 h 时,0、0.05、0.10、0.15、0.20和0.50 mmol/L α硫辛酸组间自噬体阳性细胞百分率差异均无统计学意义（F 值分别为0.11、0.10,均 P >0.05）;孵育24 h 时,各组间差异有统计学意义（F =8.03,P <0.05）。Western 印迹法检测显示,孵育4 h 和12 h 时,0、0.05、0.10、0.15、0.20和0.50 mmol/L α硫辛酸组间细胞 LC3-Ⅰ向 LC3-Ⅱ转化（LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ）水平差异均无统计学意义（F 值分别为3.38、2.13,均 P >0.05）,但孵育24 h 时各组间差异有统计学意义（F =37.49,P <0.01）。结论α硫辛酸可能抑制人皮肤成纤维细胞基础自噬。     

紫檀芪对人乳头瘤病毒16整合感染宫颈上皮细胞系生长、凋亡和自噬的影响

【摘要】 目的 探讨紫檀芪对人乳头瘤病毒16（HPV16）整合感染宫颈上皮细胞（H8细胞）生长、凋亡和自噬的影响。方法 紫檀芪与H8细胞共培养24 h和48 h,使用CCK8法检测细胞增殖活性,流式细胞仪检测H8细胞凋亡和细胞周期,荧光显微镜观察MDC染色后细胞自噬形态学改变,Western印迹检测各组细胞周期相关蛋白（cyclinD1）、凋亡相关蛋白（caspase3、caspase9）、自噬相关蛋白（Beclin1、LC3-Ⅱ/Ⅰ、ATG5、P62）、HPV致癌基因蛋白（E6、E7蛋白）的表达。采用单因素方差分析、重复测量方差分析和LSD-t检验分析组间差异。结果 对照组（0）、25、50、75、100 μmol/L紫檀芪作用H8细胞48 h后,各组细胞相对生长率（100.00% ± 1.56%、99.02% ± 4.97%、93.59% ± 2.01%、81.28% ± 4.90%、69.17% ± 7.56%）差异有统计学有意义（F = 77.22,P < 0.05）,随着浓度增加生长率渐降低,各紫檀芪组与对照组比较,均P < 0.05。紫檀芪作用H8细胞24 h后,各组细胞G1 期、G2期、S期细胞比例差异均有统计学意义（F = 7 845.00、51.14、266.50,均P < 0.05）,各紫檀芪组G1期、G2期细胞比例均高于对照组,S期细胞比例均低于对照组（均P < 0.05）。紫檀芪作用48 h后,0 ~ 100 μmol/L组细胞凋亡率分别为11.58% ± 0.50%、14.66% ± 0.22%、13.50% ± 0.49%、14.56% ± 0.19%、15.30% ± 0.76%,各紫檀芪组均高于对照组（均P < 0.05）。紫檀芪作用24 h后细胞MDC染色显示,对照组中仅有少量H8细胞检测到高亮点状荧光,各紫檀芪组高亮点状荧光的自噬小体较对照组增多。Western印迹显示,紫檀芪作用24 h、48 h后各组细胞cyclinD1、caspase3、caspase9、Beclin1、LC3-Ⅱ/Ⅰ、ATG5、P62、E6、E7蛋白相对表达水平差异均有统计学意义（均P < 0.05）。与对照组比较,紫檀芪处理后cyclinD1表达降低,caspase3、caspase9表达升高,Beclin1、LC3-Ⅱ/Ⅰ、ATG5、P62升高,E6、E7表达降低（个别浓度组与对照组比较P > 0.05,多数组间比较P < 0.05）。结论 紫檀芪可抑制H8细胞增殖,促进其凋亡和自噬,抑制E6、E7致癌基因的表达。     

西罗莫司和饥饿处理对人A431细胞自噬水平的影响

目的 探讨经典自噬诱导剂西罗莫司和饥饿处理对人皮肤鳞状细胞癌细胞系A431自噬水平的影响。方法 分别将A431细胞和人宫颈癌细胞系HeLa分为对照组（单纯DMEM培养基处理）、二甲基亚砜（DMSO）组、20 nmol/L西罗莫司组、80 nmol/L西罗莫司组、平衡盐溶液（EBSS）组。作用4 h后,Western印迹检测A431细胞和HeLa细胞自噬微管相关蛋白轻链3A/3B（LC3A/B）、重组人γ?氨基丁酸受体相关蛋白（GABARAP）的表达水平。吖啶橙染色分析细胞自噬体表达水平。结果 Western印迹检测显示,对照组与DMSO组A431细胞中LC3A/B?Ⅱ与LC3 A/B?Ⅰ比值差异无统计学意义（P > 0.05）;20 nmol/L西罗莫司组、80 nmol/L西罗莫司组、EBSS组LC3 A/B?Ⅱ与LC3 A/B?Ⅰ比值较对照组均明显升高,差异均有统计学意义（P < 0.05）。HeLa细胞Western印迹检测结果与A431细胞类似。双变量相关性分析显示,HeLa细胞中LC3A/B?Ⅰ与GABARAP表达呈正相关（r = 0.869,95% CI：0.807 ~ 0.999,P = 0.051）,LC3A/B?Ⅱ与GABARAP表达呈负相关（r = -0.742,95% CI：-0.982 ~ 0.406,P = 0.042）;A431细胞中LC3A/B?Ⅰ与GABARAP表达亦呈正相关（r = 0.837,95% CI：-0.173 ~ 0.989,P = 0.037）,LC3A/B?Ⅱ与GABARAP表达呈负相关（r = -0.684,95% CI：-0.977 ~ 0.500,P = 0.047）。吖啶橙染色显示,A431细胞自噬阳性细胞比例在西罗莫司组（23.750% ± 0.260%）与EBSS组（32.450% ± 0.488%）同样高于对照组（15.987% ± 0.242%,均P < 0.05）;HeLa细胞自噬阳性细胞比例在西罗莫司组（33.307% ± 0.715%）和EBSS组（66.097% ± 1.141%）高于对照组（14.117% ± 0.295%,均P < 0.05）。结论 经典自噬诱导剂西罗莫司和饥饿能够上调A431细胞的自噬水平, GABARAP蛋白可能与LC3A/B高度相关。     

血清饥饿处理对人角质形成细胞系HaCaT细胞自噬的调控效应研究北大核心CSCD

目的研究血清饥饿处理对人角质形成细胞系HaCaT细胞自噬的调控效应,初步分析其分子机制。方法采用血清饥饿处理体外培养的HaCaT细胞诱导自噬,分析血清饥饿对细胞形态和细胞活力（MTr法）的影响。透射电镜观察自噬体囊泡形成,使用Western印迹法进行自噬标志性分子LC3-I-Lc3Ⅱ转化分析和自噬关键基因Atg7的表达以及MDC染色标记自噬体囊泡。对mTOR的蛋白表达及其ser2448和ser2481位点磷酸化产物水平进行分析。结果血清饥饿HaCaT细胞活力上升,电镜观察和MDC染色发现,血清饥饿处理的HaCaT细胞中有自噬体囊泡形成。Western印迹显示,血清饥饿细胞LC3-I—LC3Ⅱ转化（LC3-Ⅱ,LC3-I比率为3．5084-0．415）较正常培养的细胞（0．538±0．038）显著上调（两组比较,t=13．32,P〈0．01）;自噬关键基因Atg7表达上调（对照细胞和血清饥饿细胞Atg7／GAPDH分别为0．021±0．006和0．048-4-0．011,t=7．27,P〈0．05）。血清饥饿处理的细胞中,roTOR的ser2448位点、ser2481位点磷酸化产物水平显著降低（对照细胞和血清饥饿细胞间的磷酸化mTORser2448／mTOR比率分别为0．762±0．108和0．394±0．048,t=7．58,P〈0．05;磷酸化mTORser248I／mTOR的比率分别为0．263±0．039和0．111±0．020,t=13．77,P〈0．01）。结论血清饥饿处理可以诱导HaCaT细胞发生自噬,并且导致细胞活力上升。这种自噬的诱导可能与自噬调控关键元件mTOR蛋白活化抑制相关。     

白念珠菌对人THP-1细胞产生白细胞介素6、活化信号分子IκBα的影响北大核心CSCD

目的 探讨白念珠菌对人急性单核细胞白血病细胞系（THP-1细胞系）分泌白细胞介素6（IL-6）和细胞内信号分子NF-κB抑制蛋白（IκBα）激活的影响.方法 实时荧光定量PCR分析105、106 CFU/ml灭活白念珠菌刺激THP-1细胞IL-6 mRNA表达水平变化,酶联免疫吸附法检测IL-6分泌量.免疫印迹法分析白念珠菌体外作用THP-1细胞后不同时间IκBα和磷酸化IκBα的水平.结果 105 CFU/ml白念珠菌刺激THP-1细胞后l、3、6h,IL-6 mRNA水平（2-△△α）分别为1.48±0.06、6.48±0.30、125.34±1.47,刺激3h、6h后明显高于空白对照组（P＜ 0.001）.106 CFU/ml白念珠菌刺激THP-1细胞后1、3、6h,IL-6 mRNA水平分别为2.96±0.35、8.57±1.27、588.10±2.31,与空白对照组比较,P值分别为0.036、0.001、＜0.001.106 CFU/ml白念珠菌刺激THP-1细胞后24 h,IL-6蛋白水平为（924.9±30.13） ng/L,与空白对照组比较差异有统计学意义（P＜ 0.001）.106 CFU/ml白念珠菌作用THP-1细胞后30 min、60 min,磷酸化IκBα蛋白水平显著升高,而IκB α蛋白水平相应降低.结论 人THP-1细胞体外与白念珠菌作用后激活信号分子NF-κB并分泌IL-6,参与抗念珠菌感染固有免疫反应.     

circIGF2BP3调控光老化皮肤成纤维细胞自噬水平的研究

【摘要】 目的 初步探究circIGF2BP3对光老化皮肤成纤维细胞自噬水平的影响。方法 取中山大学附属第三医院泌尿外科6例儿童包皮环切术后包皮组织,分离培养成纤维细胞,以每日10 J/cm2长波紫外线（UVA）连续照射14 d,建立UVA诱导的光老化成纤维细胞模型（UVA处理组）,未经处理的正常成纤维细胞作为对照组,β半乳糖苷酶染色、Western印迹法检测P21蛋白表达,CCK8法检测细胞活力验证建模是否成功。Western印迹法检测光老化成纤维细胞中自噬相关蛋白P62、LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ表达,qRT-PCR验证光老化与正常成纤维细胞间circIGF2BP3表达差异,并对其进行生物学注释。将原代成纤维细胞分为4组：空载组、UVA + 空载组,circIGF2BP3过表达组、UVA + circIGF2BP3过表达组,Western印迹法检测各组细胞中自噬相关蛋白表达水平。两独立样本均数的比较采用t检验,多组间比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用LSD-t检验。结果 UVA处理组β半乳糖苷酶染色阳性率（61.33% ± 5.78%）、P21蛋白表达（1.25 ± 0.03）均显著高于对照组（6.37% ± 0.32%、1.00 ± 0.05,t = 9.49、4.26,P < 0.01、< 0.05）,而细胞活力（74.33% ± 3.48%）显著低于对照组（100%,t = 7.38,P < 0.01）。UVA处理组P62蛋白表达及LC3-Ⅱ/Ⅰ比值均显著高于对照组（均P < 0.05）。光老化成纤维细胞中circIGF2BP3的相对表达量为0.72 ± 0.04,显著低于对照组（1.00 ± 0.03）,t = 5.46,P < 0.01。circIGF2BP3过表达组P62蛋白表达（0.60 ± 0.01）及LC3-Ⅱ/Ⅰ比值（0.71 ± 0.01）均显著低于空载组（1.00 ± 0.02、1.00 ± 0.01;t = 16.25、2.75,P < 0.01、P < 0.05）;UVA + circIGF2BP3过表达组P62蛋白表达（1.05 ± 0.02）及LC3-Ⅱ/Ⅰ比值（2.04 ± 0.05）亦均显著低于UVA + 空载组（1.31 ± 0.02、2.72 ± 0.14;t = 10.49、6.47,均P < 0.01）。结论 circIGF2BP3可调控UVA诱导的光老化皮肤成纤维细胞自噬水平,为防治光老化提供了新的潜在治疗靶点。     

喜树碱对HaCaT细胞自噬的影响

目的 探讨喜树碱对HaCaT细胞自噬的影响.方法 将HaCaT细胞分为对照组和实验组,对照组用0.1％二甲基亚砜处理,实验组分别用5、10、25、50、100、200 nmol/L浓度的喜树碱处理.不同浓度喜树碱作用于HaCaT细胞24、48 h,用CCK8法检测细胞增殖情况,流式细胞仪检测药物作用24 h后细胞凋亡情况,免疫印迹法检测自噬相关微管相关蛋白1轻链3(LC3)、p62的变化;选取10 nmol/L喜树碱作用于HaCaT细胞24 h,间接免疫荧光法检测细胞自噬蛋白LC3的变化.结果 5、10 nmol/L喜树碱对HaCaT细胞增殖、凋亡无显著影响,50、100、200 nmol/L喜树碱作用HaCaT细胞24 h,增殖抑制率分别为(31.23±1.00)％,(54.21±8.10)％,(66.75±10.70)％;25、50、100、200 nmol/L喜树碱作用HaCaT细胞48 h,增殖抑制率分别为(25.81±5.99)％、(44.35±5.32)％、(65.81±8.28)％、(73.23±9.59)％,与同时段对照组相比,差异有统计学意义(均P＜0.001).50、100、200 nmol/L喜树碱作用HaCaT细胞24 h,凋亡率分别为(14.46±2.38)％、(19.15±1.59)％、(29.88±1.37)％,与对照组(3.80±0.13)％比较,差异有统计学意义(均P＜ 0.001).5、10 nmol/L喜树碱处理HaCaT细胞24 h后,LC3Ⅱ表达上调,p62蛋白表达下调.间接免疫荧光显示10 nmol/L喜树碱作用HaCaT细胞24h后,实验组与对照组自噬体阳性细胞百分率分别为(36.67±4.55)％、(6.23±0.92)％,两组差异有统计学意义(t=6.546,P=0.003).结论 5、10 nmol/L喜树碱可诱导HaCaT细胞发生自噬,但对细胞增殖、凋亡无影响.50、100、200 nmol/L喜树碱抑制HaCaT细胞增殖,促使细胞发生凋亡,自噬水平降低.     

葫芦素Ⅰ对HaCaT细胞体外增殖及对角蛋白17、STAT3、VEGF表达的影响

目的 探讨葫芦素Ⅰ对HaCaT细胞体外增殖及角蛋白17(K17)、信号转导及转录激活子3(STAT3)、血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响.方法 采用不同浓度葫芦素Ⅰ(0.0125、0.025、0.05、0.1μmol/L)、含与0.1 μmol/L葫芦素Ⅰ等体积DMSO的DMEM培养液(溶媒组)、DMEM培养液(阴性对照组)、10 nmol/L卡泊三醇(阳性对照组)分别作用于HaCaT细胞.采用CCK8法检测葫芦素Ⅰ作用12、24、36 h后对HaCaT细胞体外增殖的影响,RT-PCR法检测葫芦素Ⅰ作用24 h对HaCaT细胞K17和VEGF mRNA表达的影响,Western印迹法检测葫芦素Ⅰ作用24h对HaCaT细胞K17、STAT3、磷酸化STAT3(P-STAT3)和VEGF蛋白表达的影响.结果 0.0125 μmol/L葫芦素Ⅰ作用12h即开始表现出对HaCaT细胞体外增殖的抑制作用,当葫芦素Ⅰ浓度增加到0.1 μmol/L时,24h和36h的抑制率分别为43.00％±2.11％和48.98％±2.27％.与阴性对照组相比,各浓度葫芦素Ⅰ组对HaCaT细胞体外增殖均有抑制作用(均P＜ 0.05),且该抑制作用随葫芦素Ⅰ浓度的增加及作用时间的延长逐渐增强.不同浓度葫芦素Ⅰ作用于HaCaT细胞24 h后,K17 mRNA及其蛋白、P-STAT3蛋白、VEGF mRNA及其蛋白表达量均随葫芦素Ⅰ浓度的增加而降低,差异有统计学意义(均P＜ 0.05).结论 葫芦素Ⅰ可抑制HaCaT细胞的体外增殖,并可在mRNA水平下调K17、VEGF的表达,在蛋白水平下调K17、P-STAT3、VEGF的表达.     

丹参酮ⅡA对黑素瘤细胞侵袭迁移能力的抑制作用及机制

目的 探讨丹参酮ⅡA对黑素瘤A375细胞侵袭转移的作用及趋化因子受体7(CXCR7)基因与蛋白表达的影响.方法 体外培养黑素瘤A375细胞,经1、2、4mg/L丹参酮ⅡA处理48 h后,细胞划痕实验和Transwell细胞体外侵袭实验分别测定细胞迁移和侵袭能力,实时荧光定量PCR和Western印迹分别检测A375细胞CXCR7 mRNA和蛋白的表达水平.结果 1、2、4 mg/L丹参酮ⅡA处理A375细胞48 h后,Transwell细胞体外侵袭实验显示,每高倍(×200)视野下迁移穿过聚碳酸酯膜的细胞数分别为71.00±4.00、51.00±2.00、37.00±3.61,而细胞划痕实验显示,细胞迁移数分别为301±3.00、253.00±3.61、126.00±7.00,均显著低于对照组(105.33±6.51、332.00±6.24,均P＜0.05),且丹参酮ⅡA对A375细胞侵袭、迁移能力的抑制作用随丹参酮ⅡA浓度的升高而增强(均P＜0.05).实时荧光定量PCR及Western印迹显示,1、2、4 mg/L丹参酮ⅡA组CXCR7 mRNA的相对表达量分别为0.63±0.04、0.44±0.02、0.31±0.01,蛋白表达水平分别为0.573±0.015、0.416±0.011、0.260±0.055,均显著低于对照组(1.00±0.02、0.9000±0.010,均P＜0.05),且丹参酮ⅡA对A375细胞CXCR7 mRNA和蛋白表达的抑制能力随丹参酮ⅡA浓度的升高而增强(均P＜0.05).结论 丹参酮ⅡA可通过下调CXCR7表达抑制黑素瘤A375细胞的侵袭迁移能力.     

A specific inhibitor of keratinolytic proteinase from Candida albicans could inhibit the cell growth of C. albicans

The authors investigated the influence of culture medium pH and various kinds of protease inhibitors on the growth of Candida albicans when cultivated in liquid medium containing human stratum corneum (HSC) as the nitrogen source. Rapid growth of C. albicans was observed with weakly acidic media, particularly at pH 4.0. From among the various kinds of protease inhibitors added to the media at pH 4.0, pepstatin, a carboxyl protease inhibitor, most strongly inhibited the growth of C. albicans dependent upon its concentration. The antifungal effect of pepstatin was not fungicidal, but was nevertheless effective even at a very low concentration of 0.01 microgram/ml. This inhibitory effect of pepstatin was considerably stronger than that of the well-known antifungal agent, clotrimazole. Pepstatin is a specific inhibitor of keratinolytic proteinase (KPase) from C. albicans; it belongs to the carboxyl proteinases group and has an optimum pH at 4.0. Pepstatin showed a strong antifungal effect, possibly through KPase inhibition, in biologic (HSC) medium that was similar to that encountered in vivo. Our results suggest that KPase may play an important role in the growth of C. albicans and that pepstatin has the possibility of being used as a new type of antifungal agent.     

组织蛋白酶D调控皮肤成纤维细胞降解晚期糖基化终末产物的研究

目的 探究组织蛋白酶D（CatD）对皮肤成纤维细胞降解吞入胞内的晚期糖基化终末产物（AGE）的调控作用。方法 分别以CatB + CatL、CatD以及20S蛋白酶体的酶活性抑制剂CA074Me、天冬氨酸酶抑制剂（pepstatin A）、MG-132处理皮肤成纤维细胞,CCK8和荧光法检测细胞活性及蛋白酶活性。CA074Me、pepstatin A、MG-132组分别加入AGE-BSA孵育8 h,而对照组加入磷酸盐缓冲液（PBS）。孵育8 h后,置换含相应抑制剂的新鲜培养基继续培养24 h,流式细胞仪检测各时间点胞内AGE-BSA平均荧光强度。以不同浓度pepstatin A（37.5、75、150 μmol/L）或PBS处理皮肤成纤维细胞,加入AGE-BSA孵育,方法同前,ELISA检测各时间点胞内AGE-BSA平均浓度,计算降解率。慢病毒转染皮肤成纤维细胞,设空白对照组、空载病毒转染组、CatD高表达慢病毒转染组,荧光显微镜观察,RT-PCR、Western印迹法和荧光法检测各组CatD mRNA和蛋白表达及酶活性。分别加入AGE-BSA孵育,处理及检测方法同前,计算降解率。结果 1 μmol/L CA074Me组、75 μmol/L pepstatin A组及1 μmol/L MG-132组细胞增殖活性均在90%以上,与对照组（100%）差异无统计学意义（F = 1.525,P > 0.05）。去除AGE-BSA 24 h后,CA074Me + AGE-BSA组和MG-132 + AGE-BSA组胞内AGE-BSA荧光强度（275.00 ± 10.15、259.00 ± 11.14）均较其相应8 h点荧光强度（295.00 ± 6.56、285.67 ± 8.74）显著下降（配对t值分别为4.778、6.154,均P < 0.05）,而pepstatin A + AGE-BSA组8 h和32 h点细胞内AGE-BSA荧光强度差异无统计学意义（均P > 0.05）。37.5、75和150 μmol/L pepstatin A组24 h内对吞入胞内AGE-BSA的降解率分别为9.64% ± 1.27%、5.62% ± 0.47%和3.21% ± 0.73%,各组间差异有统计学意义（F = 45.876,P < 0.05）,且该降解率随pepstatin A浓度增加而降低（P < 0.05）。荧光显微镜下观察,空白对照组细胞未见荧光,空载病毒转染组和CatD高表达慢病毒转染组细胞荧光阳性率均在80%以上。CatD高表达慢病毒转染组CatD mRNA、蛋白表达及活性均较另2组显著上调（均P < 0.05）。CatD高表达慢病毒转染 + AGE-BSA组24 h内AGE-BSA的降解率显著高于AGE-BSA组和空载病毒转染 + AGE-BSA组（均P < 0.05）。结论 CatD可促进皮肤成纤维细胞降解吞入胞内的AGE-BSA。     

T细胞免疫球蛋白黏蛋白分子3对黑素瘤TRP-2180-188肽疫苗刺激小鼠淋巴细胞的影响

目的 探讨体外T细胞免疫球蛋白黏蛋白分子-3（TIM-3）对与小鼠黑素瘤B16F10细胞共培养的酪氨酸相关蛋白-2（TRP-2180-188）抗原肽刺激小鼠淋巴细胞的影响。 方法 构建TIM-3重组质粒pFUSE-TIM-3-mIgG2Aae1-Fc2,分别转染重组质粒及空质粒pFUSE-mIgG2Aae1-Fc2至人上皮293T细胞,继续培养48 h,制备含TIM-3、免疫球蛋白（Ig-tail）的上清液。TRP-2180-188肽疫苗免疫C57BL/6小鼠,分离小鼠脾淋巴细胞,用TRP-2180-188抗原肽和白细胞介素（IL）-2刺激培养5 d,以未刺激细胞作为对照组。构建B16F10细胞与上述TRP-2180-188抗原肽刺激淋巴细胞共培养体系,分为空白对照组（加293T细胞培养48 h上清液）、TIM-3组（加含TIM-3上清液）、阴性对照组（加含Ig-tail上清液）。CCK-8法检测细胞增殖情况,酶联免疫吸附试验（ELISA）检测共培养体系中干扰素（IFN）-γ和肿瘤坏死因子（TNF）-α浓度,流式细胞仪检测共培养体系中CD8+T淋巴细胞。 结果 酶切和测序鉴定证实目的基因正确插入真核表达载体中,检测到转染重组质粒pFUSE-TIM-3-mIgG2Aae1-Fc2的293T细胞上清液中有TIM-3表达,转染空质粒pFUSE-mIgG2Aae1-Fc2的293T细胞上清液中有Ig-tail的表达。CCK-8法检测显示24 h时空白对照组、阴性对照组、TIM-3组淋巴细胞增殖活力分别为（100.00 ± 10.42）%、（108.70 ± 9.90）%、（78.06 ± 6.37）%,48 h时分别为（100.00 ± 6.24）%、（168.00 ± 2.98）%、（42.93 ± 5.93）%;24 h、48 h时TIM-3组淋巴细胞活力低于空白对照组和阴性对照组（均P ＜ 0.05）。TIM-3组48 h相比24 h淋巴细胞增殖倍数低于空白对照组和阴性对照组（均P ＜ 0.05）。24 h时,空白对照组、阴性对照组、TIM-3组IFN-γ浓度分别为（216.44 ± 7.85）、（223.67 ± 7.79）、（192.96 ± 5.05） ng/L,48 h时分别为（230.06 ± 4.23）、（167.24 ± 3.33）、（54.95 ± 0.57） ng/L。24 h、48 h时,TIM-3组IFN-γ浓度低于空白对照组和阴性对照组（均P ＜ 0.05）。24 h、48 h时,TIM-3组TNF-α浓度低于空白对照组和阴性对照组（均P ＜ 0.05）。24 h时空白对照组、阴性对照组、TIM-3组CD8+T淋巴细胞中位数分别为0.421%、2.22%、3.30%,48 h时分别为0.577%、0.691%、4.06%。24 h、48 h时TIM-3组CD8+T淋巴细胞中位数高于空白对照组和阴性对对照组。 结论 TIM-3在体外能够抑制B16F10细胞与TRP-2180-188抗原肽刺激淋巴细胞共培养体系中淋巴细胞增殖和分泌IFN-γ、TNF-α,提高CD8+T淋巴细胞。     

张力促进瘢痕疙瘩纤维化的初步研究

【摘要】 目的 初步探讨张力刺激对瘢痕疙瘩成纤维细胞生物学活性及纤维化标志基因表达的影响。方法 选取2017年1 - 3月于空军军医大学唐都医院皮肤科诊断为瘢痕疙瘩并接受手术治疗的3例患者，处理手术切除的瘢痕疙瘩组织，经原代培养获得人瘢痕疙瘩成纤维细胞（KD-Fbs），取3～6代KD-Fbs分别培养于张力刺激模型小室和对照小室中，分别接受张力刺激（张力组）和正常培养（对照组）。CCK8法检测培养1、2、3、4 d时KD-Fbs的增殖活性，划痕实验检测培养1、2 d时KD-Fbs的迁移能力；处理48 h后，实时定量PCR和Western印迹法分别检测KD-Fbs中纤维化标志物Ⅰ型胶原蛋白、纤连蛋白、α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）mRNA和蛋白的表达。两组间比较采用两独立样本t检验。结果 CCK8法显示，培养1、2、3、4 d时，张力组KD-Fbs增殖活性均高于对照组（t值分别为3.05、7.00、16.65、15.19，均P < 0.05）。划痕实验显示，培养1、2 d时，张力组KD-Fbs迁移率（48.65% ± 3.96%、100.00%）均显著高于对照组（9.36% ± 1.14%、50.35% ± 4.23%；t值分别为16.53、20.35，均P < 0.01）。实时定量PCR结果显示，张力组Ⅰ型胶原蛋白、纤连蛋白、α-SMA mRNA表达（3.04 ± 0.20、2.16 ± 0.10、3.76 ± 0.24）均显著高于对照组（1.00），差异有统计学意义（t值分别为17.57、21.01、20.25，均P < 0.01）。Western印迹法显示，3种纤维化标志物蛋白表达水平变化与其mRNA变化一致（均P < 0.05）。结论 张力可能通过促进纤维化标志基因的表达，增强KD-Fbs的增殖和迁移能力，进而参与瘢痕疙瘩的纤维化进程。